Caenorhabditis elegans als Modellsystem zur Entdeckung bioaktiver Verbindungen gegen Polyglutamin-vermittelte Neurotoxizität

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der neuroprotektiven Aktivitäten von Testverbindungen in Caenorhabditis elegans vor, einschließlich Polyglutaminaggregation, neuronalem Tod und Chemovermeidungsverhalten, sowie eine beispielhafte Integration mehrerer Phänotypen.

Zusammenfassung

Altersbedingte Fehlfaltung und Aggregation pathogener Proteine sind für mehrere neurodegenerative Erkrankungen verantwortlich. Zum Beispiel wird die Huntington-Krankheit (HD) hauptsächlich durch eine CAG-Nukleotid-Wiederholung angetrieben, die einen erweiterten Glutamintrakt im Huntingtin-Protein kodiert. Daher ist die Hemmung der Aggregation von Polyglutamin (PolyQ) und insbesondere der aggregationsassoziierten Neurotoxizität eine nützliche Strategie zur Vorbeugung der Huntington-Krankheit und anderer PolyQ-assoziierter Erkrankungen. Dieses Papier stellt verallgemeinerte experimentelle Protokolle vor, um die neuroprotektive Kapazität von Testverbindungen gegen die Huntington-Krankheit unter Verwendung etablierter polyQ-transgener Caenorhabditis elegans-Modelle zu bewerten. Der AM141-Stamm wird für den polyQ-Aggregationsassay ausgewählt, da ein altersassoziierter Phänotyp diskreter fluoreszierender Aggregate aufgrund der muskelspezifischen Expression von polyQ::YFP-Fusionsproteinen im Erwachsenenstadium leicht in seiner Körperwand beobachtet werden kann. Im Gegensatz dazu wird das HA759-Modell mit starker Expression von PolyQ-expandierten Bahnen in ASH-Neuronen verwendet, um neuronalen Tod und Chemovermeidungsverhalten zu untersuchen. Um die neuroprotektive Kapazität von Zielverbindungen umfassend zu bewerten, werden die oben genannten Testergebnisse letztendlich als Radardiagramm mit Profilierung mehrerer Phänotypen in einer Art direktem Vergleich und direkter Betrachtung dargestellt.

Einleitung

Progressive Neurodegeneration bei der Huntington-Krankheit beinhaltet pathogene mutierte Huntingtin mit einer abnormalen PolyQ-Strecke, die von CAG-Trinukleotid-Wiederholungen ^1,2,3 kodiert wird. Mutierte Huntingtin-Proteine mit mehr als 37 Glutamin-Wiederholungen sind anfällig für Aggregation und akkumulieren sich in den Gehirnen von Huntington-Patienten und Tiermodellen^4,5, was letztendlich zu Neurodegeneration^{führt 6}. Trotz der mangelnden Klarheit über die Rolle von PolyQ-Aggregaten in der Krankheitspathologie⁵ ist die Hemmung der PolyQ-Aggregation und der damit verbundenen Toxizität eine nützliche therapeutische Strategie für die Huntington-Krankheit und andere PolyQ-Erkrankungen ^4,7,8.

Aufgrund der Erhaltung neuronaler Signalwege und leicht zu konstruierender transgener Krankheitsmodelle wurde Caenorhabditis elegans häufig als wichtiger Modellorganismus für die Untersuchung neurologischer Erkrankungen 9,10,11,12 eingesetzt. Zum Beispiel können transgene C. elegans-Modelle, die aggregationsanfällige PolyQ-Erweiterungen exprimieren, objektiv HD-ähnliche Merkmale wie selektiven neuronalen Zellverlust, zytoplasmatische Aggregatbildung und Verhaltensstörungen^{nachahmen 13}. Die Untersuchung der möglichen Auswirkungen von Testproben zur Umkehrung dieser Phänotypen in etablierten PolyQ-Nematodenmodellen hat zur Identifizierung einer Vielzahl vielversprechender therapeutischer Kandidaten geführt, z. B. Polysaccharide 7,14,15, Oligosaccharide 16, natürliche kleine Moleküle^17,18 und pflanzliche Extrakte und Formeln ^19,20.

Hier werden zwei Hauptmodelle von PolyQ C. elegans und relevante Protokolle für mögliche Anwendungen beschrieben, wie die Studie an Astragalan, einem Polysaccharid, das aus Astragalus membranaceus⁷ isoliert wurde, veranschaulicht. Für den PolyQ-Aggregationsassay in C. elegans wird der transgene Stamm AM141 verwendet, der fluoreszierende Puncta zeigt, die im Erwachsenenalter aufgrund der Expression des Q40::YFP-Fusionsproteins, eines PolyQ-Trakts von 40 Resten (polyQ40), der mit gelbem fluoreszierendem Protein (YFP) verschmolzen ist, im Erwachsenenalter dispergiert ^ist21,22 . Der Stamm HA759 wurde verwendet, um das neuronale Überlebens- und Chemovermeidungsverhalten zu untersuchen, da er sowohl grün fluoreszierendes Protein (GFP) als auch Htn-Q150 (ein von Huntingtin abgeleiteter PolyQ-Trakt von 150 Resten) stark in ASH-Neuronen, aber schwach in anderen Neuronen exprimiert, was zu fortschreitender Neurodegeneration und ASH-Zelltod ^7,13 führt. Eine umfassende Zusammenfassung des neuroprotektiven Potenzials von therapeutischen Kandidaten wird durch die Integration von Ergebnissen aus verschiedenen Assays bereitgestellt.

Protokoll

HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie die Rezepte der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

1. Vorbereitung der Materialien für den Caenorhabditis elegans Assay

1. Wartung von C. elegans-Stämmen
   1. Erhalten Sie C. elegans (AM141 und HA759) und Escherichia coli (OP50 und NA22) Stämme (siehe Materialtabelle).
   2. Halten Sie die Nematoden auf der mit E. coli OP50 ausgesäten Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM) bei 20 °C für AM141²¹ oder 15 °C für^{HA759 23}.
2. Herstellung von E. coli OP50 Bakterienkultur
   1. Wählen Sie eine einzelne Kolonie von E. coli OP50 aus einer Luria-Bertani (LB) Streifenplatte und impfen Sie sie in 50 ml flüssige LB-Kultur.
   2. Inkubieren Sie die OP50-Bakterien in einem Shaker bei 37 °C und 200 U/min bis zu einer optischen Dichte von ~0,5 bei 570 nm (OD₅₇₀).
   3. Lagern Sie die OP50-Bakterienkultur bei 4 °C und verwenden Sie sie innerhalb von zwei Wochen.
3. Herstellung von NGM-Platten mit OP50-Bakterien
   1. 20 g Agar, 2,5 g Pepton, 3,0 g NaCl und 975 ml deionisiertes Wasser in eine autoklavierbare 1-Liter-Flasche geben. Autoklav bei 121 °C für 30 min.
   2. Legen Sie die flüssige NGM-Agarflasche auf die Bank, um sie auf ~ 60 ° C abzukühlen, und fügen Sie dann die folgenden sterilen Stammlösungen hinzu: 1 ml 1 M CaCl₂, 1 ml 1 M_{MgSO 4}, 1 ml 5 mg / ml Cholesterin und 25 ml 1 M Kaliumphosphat (pH 6,0).
   3. Gießen Sie 20 ml NGM in eine sterile 90-mm-Petrischale und lassen Sie die Teller auf der Bank abkühlen und erstarren. Halten Sie die Platten auf dem Kopf und lassen Sie sie 2 Tage lang auf der Bank bei Raumtemperatur trocknen.
   4. Geben Sie 200 μL der OP50-Bakterienkultur auf jede NGM-Platte und verteilen Sie sie gleichmäßig mit einem sterilen Glasbeschichtungsstab. Schließen Sie die Deckel und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
   5. Lagern Sie die mit OP50 ausgesäten NGM-Platten in einer Kunststoffbox mit Abdeckung bei Raumtemperatur und verwenden Sie sie innerhalb von zwei Wochen.
4. Aufbereitung der alterssynchronen C. elegans Population
   1. Sammeln Sie gravide erwachsene Nematoden in einem sterilen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 1000 × g für 1 min. Dreimal waschen und die Nematoden im M9-Puffer aufhängen.
   2. Fügen Sie ein gleiches Volumen Bleichlösung hinzu und rühren Sie es vorsichtig für 3-5 min. Überwachen Sie das Bleichen alle 15 s unter einem Seziermikroskop.
      HINWEIS: Die Bleichlösung muss vor der Verwendung frisch zubereitet werden, indem gleiche Volumina von 10% NaOCl und 1 M NaOH gemischt werden (Tabelle 1)²⁰.
   3. Sobald die meisten Nematoden gebrochen sind, stoppen Sie die Verdauung, indem Sie mit M9-Puffer verdünnen. Zentrifugieren Sie schnell, um den Überstand zu entfernen, und suspendieren Sie das Pellet im M9-Puffer, um das Waschen dreimal zu wiederholen.
   4. Resuspendiert das Pellet in S medium. Lassen Sie die Nematodenrückstände 2-3 Minuten lang durch Schwerkraft absetzen, während die Eier im Überstand verbleiben.
   5. Saugen Sie den Überstand in ein neues steriles Mikrozentrifugenröhrchen ab. Sammeln Sie die Eier durch Zentrifugation bei 1000 × g für 1 min.
   6. Entsorgen Sie ~ 80% des Überstands und geben Sie die Eier in einen sterilen Kolben mit 20 ml S-Medium. Legen Sie den Kolben in einen Shaker und bebrüten Sie die Eier über Nacht ohne Nahrung bei 120 U / min, um synchronisierte L1-Nematoden zu erhalten.

2. PolyQ-Aggregationsassay

1. Vorbereitung von Nematoden für den PolyQ-Aggregationsassay
   1. Transfer von 300-500 synchronisierten L1-Larven von AM141 zu jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 μL S-Medium, das OP50 (OD₅₇₀ von 0,7-0,8) und 5 mg/ml Astragalan enthält, typischerweise eine Vertiefung pro Behandlung für einen Zeitpunkt.
   2. Die Platte mit Parafilm abdichten und bei 20 °C und 120 U/min für 24, 48, 72 und 96 h inkubieren.
   3. Ernten Sie die Nematoden in einem sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und waschen Sie sie mit M9-Puffer >3-mal durch Zentrifugation (1000 × g für 1 min), um den verbleibenden OP50 zu entfernen. Suspendieren Sie die AM141-Nematoden im M9-Puffer und halten Sie sie für die Bildaufnahme bereit.
2. Aufnahme von fluoreszierenden Bildern und Datenanalyse
   HINWEIS: Die Daten werden mit diesem High-Content-Bildgebungssystem automatisch analysiert. Wenn kein automatisiertes Bildgebungsgerät verfügbar ist, kann ein herkömmliches Verfahren zur Vorbereitung eines Agarose-Pads für die Bildaufnahme verwendet werden, um eine ähnliche Leistung zu erzielen, indem ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop 7,15,17 verwendet wird (siehe Schritte 3.2 und 3.3).
   1. Übertragen Sie 10-15 Nematoden in jede Vertiefung in einer 384-Well-Platte (Endvolumen 80 μL pro Well). Legen Sie 10 Replikatvertiefungen für jede Behandlung fest.
   2. Fügen Sie 10 μL 200 mM Natriumazid zu jeder Vertiefung hinzu, um die Nematoden zu lähmen und sie bis zum Boden absetzen zu lassen (5-10 min).
   3. Legen Sie die Platte in ein High-Content-Bildgebungssystem, um fluoreszierende Bilder zu erfassen (Informationen zu Geräten und Software finden Sie in der Materialtabelle ).
   4. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware und richten Sie die folgenden Parameter ein.
      1. Öffnen Sie das Fenster Plate Acquisition Setup und erstellen Sie einen neuen Experimentsatz und Namen.
      2. Wählen Sie Vergrößerung als 2x, Kamera-Binning als 1 und Plattentyp als 384-Well-Platte.
      3. Legen Sie die Brunnen und Standorte (einzelner Standort) fest, die besucht werden sollen.
      4. Wählen Sie den Filter Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und aktivieren Sie bildbasierte Fokussierungsoptionen.
      5. Legen Sie die Belichtung auf 300 ms fest.
         HINWEIS: Die oben genannten Einstellungen können getestet und angepasst werden, um die Bildgebungsparameter zu optimieren.
      6. Speichern Sie die Bildaufnahmeeinstellungen und klicken Sie zum Ausführen auf die Schaltfläche Platte erfassen .
   5. Analysieren Sie die Bilddaten mit der Bildanalysesoftware.
      1. Öffnen Sie das Fenster Plattendaten überprüfen und wählen Sie die Testplatte für die Bildanalyse aus.
      2. Doppelklicken Sie auf einen Testbrunnen, um sein Bild anzuzeigen.
      3. Wählen Sie Count Nuclei als Analysemethode aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen konfigurieren, um ein Fenster für die folgenden Einstellungen aufzurufen.
      4. Definieren Sie das Quellbild aus dem FITC-Kanal und wählen Sie den Standardalgorithmus aus.
      5. Stellen Sie die Bildanalyseparameter wie folgt ein: ungefähre Mindestbreite = 10 μm (= 2 Pixel); ungefähre maximale Breite = 50 μm (= 12 Pixel); Intensität über lokalem Hintergrund = 1.000-2.000 Graustufen.
      6. Testen Sie die aktuellen Einstellungen, um die Analysemethode zu optimieren.
      7. Speichern Sie die Einstellungen und führen Sie die Analyse auf allen Bohrlöchern durch.
         HINWEIS: Es dauert ~ 20 Minuten, um die Analyse für eine 384-Well-Platte abzuschließen.
      8. Exportieren Sie die Gesamtkerne als Gesamtzahl der Q40::YFP-Aggregate in jedem Bohrloch.
   6. Zählen Sie die Anzahl der Nematoden in jedem Brunnen.
   7. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Q40::YFP-Aggregate pro Nematode in jeder Gruppe und wenden Sie eine nichtlineare Kurvenanpassung auf die Daten von jedem Zeitpunkt an.
   8. Berechnen Sie den Hemmungsindex mit eq (1) unten:
      Hemmungsindex = (1)
      Dabei sind N-Kontroll- und_N-Stichprobe die durchschnittliche Anzahl von Q40::YFP-Aggregaten in der_Kontroll- bzw. der Behandlungsgruppe.

3. PolyQ-vermittelte Neurotoxizitäts-Assays

1. Behandlung von C. elegans mit Testproben
   1. Um Nematoden für den PolyQ-Neurotoxizitätsassay vorzubereiten, übertragen Sie 300-500 synchronisierte L1-Larven von HA759 auf jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 500 μL S-Medium, das OP50 (OD₅₇₀ von 0,7-0,8) und 5 mg / ml Astragalan enthält, typischerweise drei Replikatvertiefungen für jede Behandlung.
   2. Die Platte mit Parafilm abdichten und 3 Tage²³ bei 15 °C und 120 U/min inkubieren.
   3. Sammeln Sie die Nematoden durch Zentrifugation und waschen Sie sie 3-5 Mal mit M9-Puffer. Resuspendieren Sie die Nematoden im M9-Puffer für den Einsatz in neuronalen Überlebens- und Vermeidungsassays.
2. Herstellung von Agarose-Pad
   1. Fügen Sie 2 g Agarose zu 100 ml M9-Puffer (2%, w/v) hinzu und erhitzen Sie die Agaroselösung in einer Mikrowelle auf Beinahe-Siede.
   2. Geben Sie 0,5 ml geschmolzene Agarose auf die Mitte eines 1 mm dicken Mikroskopie-Glasobjektträgers, der zwischen zwei Stück 2 mm dicker Glasplatten platziert ist. Decken Sie mit einer weiteren Folie vertikal ab. Sobald die Agarose abgekühlt und erstarrt ist, entfernen Sie vorsichtig den oberen Schieber.
3. ASH neuronaler Überlebensassay
   1. Fügen Sie einen Tropfen 20 mM Natriumazid auf das Agarosepad hinzu. Übertragen Sie 15-20 HA759-Nematoden in den Tropfen, um sie zu immobilisieren.
   2. Legen Sie einen Deckglas vorsichtig über die Nematoden. Halten Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. Wählen Sie eine 40-fache Objektivlinse und einen FITC-Filter, um GFP-positive ASH-Neuronen im Kopfbereich der Nematoden zu erkennen.
   3. Wählen Sie mehr als 50 Nematoden in jeder Gruppe nach dem Zufallsprinzip aus, um die Anzahl der Nematoden mit GFP-markierten bilateralen ASH-Neuronen in ihrer Kopfregion^{zu zählen 7}. Berechnen Sie die Überlebensrate von ASH-Neuronen mit eq (2) unten.
      Neuronales Überleben (%) = (2)
      Dabei sind N_survival und N_total die Anzahl der Nematoden mit GFP-positiven ASH-Neuronen bzw. die Gesamtzahl der getesteten Nematoden in jeder Gruppe.
4. Osmotischer Vermeidungstest
   1. Teilen Sie eine lebensmittelfreie NGM-Platte (9 cm) in normale (N) und Fangzone (T) durch eine 8 M Glycerinlinie (~ 30 μL) in der Mitte. Verteilen Sie eine 200 mM Natriumazidlinie (~ 20 μL) in ~ 1 cm Entfernung von der Glycerinlinie, um die Nematoden zu lähmen, die die Glycerinbarriere in Zone T durchqueren.
   2. Übertragen Sie jeweils ~ 200 Nematoden auf Zone N von drei Replikatplatten für jede Gruppe. Fügen Sie einen Tropfen von 1% Butandion (~ 2 μL) auf Zone T (1 cm vom Plattenrand entfernt) hinzu, um die Nematoden anzuziehen. Deckel der Petrischale sofort abdecken und bei 23 °C 90 min inkubieren.
   3. Bewerten Sie die Anzahl der Nematoden in den N- und T-Zonen unter einem Mikroskop. Berechnen Sie den Vermeidungsindex mit eq (3)²⁰.
      Vermeidungsindex = (3)
      Dabei sind N und T die Anzahl der Nematoden in den Zonen N bzw. T. Die Daten werden als Mittel ± Standardabweichung (SD) von drei Replikaten dargestellt, die für >3 unabhängige Experimente repräsentativ sind.
   4. Führen Sie einen ungepaarten, zweiseitigen t-Test durch, um die Daten der Astragalan- und Kontrollgruppen zu vergleichen.

4. Erstellen eines Radardiagramms

1. Öffnen Sie die Grafiksoftware und importieren Sie Daten aus verschiedenen Assays in ein neues Blatt. Geben Sie die Spalte A(X) als Titel der Radialachsen, die Spalte A(Y) als Daten aus der Kontrollgruppe und die Spalte B(Y) als Daten aus der Behandlungsgruppe ein.
2. Wählen Sie die gewünschten Daten aus und klicken Sie auf Plot | Spezialisiert: Schaltfläche Radar im Symbolleistenmenü zum Generieren eines Radardiagramms.
3. Doppelklicken Sie auf die Radialachse und passen Sie die Maßstabs-, Tick- und Tick-Beschriftungen jeder Achse nach Bedarf an.
4. Klicken Sie im Menü auf Datei und wählen Sie Diagramme exportieren, um das Bild als *.tiff zu speichern.
   HINWEIS: Die Software-Websites in der Materialtabelle bieten detaillierte Hilfedokumente und Video-Tutorials zum Erstellen von Radardiagrammen.

Ergebnisse

Die transgene PolyQ-Sorte AM141 exprimiert stark Q40::YFP-Fusionsproteine in ihren Körperwandmuskelzellen ^7,21. Wie in Abbildung 1A gezeigt, kann der diskrete Aggregatphänotyp dieser Dehnung durch das in diesem Artikel beschriebene automatisierte Bildgebungs- und Analyseprotokoll identifiziert werden. Die Menge an Q40::YFP-Aggregaten in AM141-Nematoden stieg nach 48 h ab der L1-Stufe signifikant an. Diese Tendenz zur Zunahme wurde jedoch durch die Behandlung mit Astragalan gehemmt (Abbildung 1B), was das Schutzpotenzial von Astragalan gegen PolyQ-Aggregation zeigt. Typischerweise können entweder 72 h oder 96 h bequem als Zeitpunkte für die Zählung von Q40::YFP-Aggregaten verwendet werden, um die Antiaggregationswirkung von Testproben zu bewerten. In diesem Protokoll wurden die fluoreszierenden Aggregate des AM141-Nematoden von einem automatisierten Bildgebungssystem erfasst, obwohl auch Fluoreszenzmikroskope für diesen Zweck verwendet werden können⁷.

Der C. elegans-Stamm HA759 exprimiert sowohl den GFP-Marker als auch Htn-Q150 in seinen sensorischen ASH-Neuronen, was zu einem fortschreitenden Verlust und einer Dysfunktion dieser Neuronen^{führt 11,13}. Die Nematoden wurden auf 2% Agarose-Pads montiert, um die neuronale Lebensfähigkeit der ASH zu bestimmen (Abbildung 2A) und mikroskopisch sichtbar gemacht, um die ASH-Neuronen nachzuweisen. Ein Verlust der GFP-Fluoreszenz in bilateralen ASH-Neuronen in den Kopfregionen von Nematoden weist auf den neuronalen Tod der ASH hin (Abbildung 2B). Die Überlebensrate von ASH-Neuronen in HA759-Nematoden beträgt <40% in der Kontrollgruppe nach Inkubation bei 15 °C für 3 Tage ^7,20, was auf PolyQ-vermittelte Neurotoxizität hinweist. Daher kann dieser neuronale ASH-Überlebensassay verwendet werden, um die Auswirkungen von Testverbindungen auf C. elegans-Neuronen visuell zu bewerten, z. B. die neuroprotektive Wirkung von Astragalan, aber nicht von Poria glycan (Abbildung 2C).

Da Verhaltensstörungen ein wichtiges klinisches Symptom bei PolyQ-Erkrankungen sind, ist der chemosensorische Vermeidungsassay (Abbildung 3A) mit einer großen Anzahl von HA759-Nematoden als vereinfachter Test konzipiert, um die Wirkung von Testproben auf den funktionellen Verlust von ASH-Neuronen zu untersuchen, die durch PolyQ-Aggregation vermittelt werden. Wie in Abbildung 3B gezeigt, betrug der Vermeidungsindex von HA759-Nematoden in der unbehandelten Kontrollgruppe ~ 0,5, ähnlich dem, was zuvor^{berichtet wurde 14}. Interessanterweise stieg der Vermeidungsindex bei den Nematoden, die 3 Tage lang mit Astragalan bei 15 °C behandelt wurden, auf >0,6 (Abbildung 3B), was eine neuroprotektive Wirkung des Polysaccharids gegen Verhaltensstörungen zeigt.

Um die neuroprotektive Gesamtkapazität von Testverbindungen zu bewerten, können die Daten aus den oben genannten Einzelassays integriert und als Radardiagramm für mehrere Phänotypen dargestellt werden, was sie zu einem vereinheitlichenden Merkmal von PolyQ-Phänotypen macht, die für den direkten Vergleich und die direkte Betrachtung geeignet sind. Wie in Abbildung 4 gezeigt, ist die Fläche des Dreiecks in der astragalanen Behandlungsgruppe größer als die der Kontrollgruppe, was auf die Anti-PolyQ-Wirkungen des Polysaccharids hinweist.

Abbildung 1: Wirkung von Astragalan auf die PolyQ40-Aggregation . (A) Repräsentative Bilder von AM141-Nematoden nach Behandlung mit oder ohne Astragalan für 96 h bei 20 °C. Die fluoreszierenden Bilder (linke Panels) wurden von 384-Well-Platten mit einem High-Content-Bildgebungs- und Analysesystem aufgenommen, und die Q40::YFP-Aggregate (rechte Panels) wurden automatisch vom System identifiziert. Einsätze sind die vergrößerten Ansichten von Nematodenbildern, die die PolyQ-Aggregate zeigen. Maßstabsstäbe = 500 μm. (B) Quantifizierung von Q40::YFP-Aggregaten. Die Anzahl der Q40::YFP-Aggregate in AM141-Nematoden wurde mit dem High-Content-Bildgebungssystem alle 24 Stunden für 4 Tage nach der Behandlung mit oder ohne Astragalan bei 20 °C überwacht. Ungefähr 100-150 Nematoden in jeder Gruppe wurden zu jedem Zeitpunkt für Aggregate bewertet. Die Ergebnisse werden als angepasste Kurven basierend auf der durchschnittlichen Anzahl von Aggregaten pro Nematode dargestellt. Abkürzungen: polyQ = Polyglutamin; YFP = gelb fluoreszierendes Protein; FITC = Fluoresceinisothiocyanat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Wirkung von Astragalan auf den Htn-Q150-vermittelten neuronalen ASH-Tod. (A) Schematische Darstellung der Agarose-Objektträgervorbereitung. (B) Repräsentative Mikroaufnahmen von HA759-Nematoden mit neuronalem Überleben und Tod von ASH bei 400-facher Vergrößerung. Maßstabsstäbe = 20 μm. Die HA759-Nematoden wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop nach der Behandlung mit oder ohne Astralgalan bei 15 °C für 3 Tage ab L1 fotografiert. (C) Schutzwirkung von Astragalan gegen polyQ-vermittelten neuronalen ASH-Tod. Poria glycan, ein Polysaccharid aus Poria cocos, wurde als Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittel ± SD von drei Replikaten dargestellt, die für mehr als drei unabhängige Experimente repräsentativ sind. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung eines ungepaarten, zweiseitigen t-Tests durchgeführt, um die Daten der Kontrollgruppe mit denen der Astragalan- und Poria-Glykangruppen zu vergleichen. *p < 0,05; ns = nicht signifikant. Abkürzung: GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Wirkung von Astragalan auf Htn-Q150-vermittelte Verhaltensstörungen. (A) Schematische Darstellung der Vermeidungsassay-Platte. (B) Repräsentative Ergebnisse des Vermeidungsassays. Der Vermeidungsindex war definiert als das Verhältnis der Nematoden in der N-Zone zur Gesamtzahl der Nematoden auf der Platte. Die Ergebnisse werden als Mittel ± SD von drei Replikaten dargestellt, die für drei unabhängige Experimente repräsentativ sind. Die statistische Analyse des Vermeidungsindex wurde mit einem ungepaarten, zweiseitigen t-Test durchgeführt. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Neuroprotektive Gesamtkapazität von Astragalan. Daten aus drei verschiedenen Assays werden in die OriginPro-Software importiert, um ein Radardiagramm zu erstellen, das dargestellt wird, um die allgemeine Wirkung von Astragalan auf mehrere Phänotypen, die durch polyQ vermittelt werden, zu profilieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Diskussion

Da PolyQ-Aggregation und Proteotoxizität wichtige Merkmale von PolyQ-Störungen wie der Huntington-Krankheit¹³ sind, empfehlen wir die Verwendung mehrerer Modelle und Methoden, um die neuroprotektive Kapazität von Testverbindungen umfassend zu bewerten, einschließlich des PolyQ-Aggregationsassays im AM141-Stamm, des neuronalen ASH-Überlebenstests im HA759-Stamm und des chemosensorischen Vermeidungsassays im HA759-Stamm. Die hier vorgestellten Protokolle wurden verwendet, um die neuroprotektiven Fähigkeiten von Testproben gegen PolyQ-Toxizität zu bewerten, einschließlich hemmender Wirkungen sowohl auf die PolyQ-Aggregation als auch auf die damit verbundene Neurotoxizität 7,14,15,16,17,19,20^, was ihr Potenzial bei der Arzneimittelentdeckung für die Huntington-Krankheit und andere PolyQ-Erkrankungen zeigt.

Für die Detektion und Zählung von polyQ-Aggregaten im polyQ-Aggregationsassay wird ein automatisiertes Bildgebungs- und Analysesystem eingeführt. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie durchsatzstark und zeiteffizient ist und zu deutlich reduzierten subjektiven Fehlern im mühsamen Zählprozess führt. Für eine gesamte 384-Well-Platte dauert es nur <1 Stunde, um die Bildaufnahme und -analyse abzuschließen. Das herkömmliche mikroskopische Bildgebungsverfahren hat jedoch auch in diesem Labor eine ähnliche Leistung gezeigt, ohne das automatisierte Bildgebungsgerät^{zu verwenden 7}.

Insgesamt 100-150 Nematoden pro Behandlung werden in einem typischen Q40::YFP-Aggregationsassay für jeden Zeitpunkt empfohlen, der in Replikatvertiefungen mit jeweils 10-15 Nematoden durchgeführt werden kann. Es sollte jedoch beachtet werden, dass L1-Larven empfindlicher auf einige Behandlungen oder höhere Konzentrationen reagieren können. Daher könnten höhere Dosen von Testverbindungen ihr Wachstum hemmen, was zu falsch-positiven Ergebnissen aufgrund des langsamen Wachstums und damit der verzögerten PolyQ-Aggregation führt. In der Regel kann ein Lebensmittel-Clearance-Assay durchgeführt werden, um dieses Problem auszuräumen und den geeigneten Konzentrationsbereich der Testverbindungen^{sicherzustellen 23}.

Die transgenen HA759-Nematoden, die in PolyQ-Neurotoxizitätsassays verwendet werden, koexprimieren OSM-10::GFP und Htn-Q150, wodurch es möglich ist, bilaterale sensorische ASH-Neuronen eindeutig zu identifizieren. Daher wird das Überleben von ASH-Neuronen durch das Vorhandensein oder Fehlen einer GFP-Expression bewertet; Normalerweise sind ~ 40-75% der ASH-Neuronen in den Kontrollnematoden tot^23,24. Interessanterweise ist der genetische Mutantenhintergrund pqe-1 (Polyglutamin-Enhancer-1) im HA759-Stamm (pqe-1; Htn-Q150) beschleunigt die PolyQ-vermittelte Toxizität, was zum Absterben der meisten ASH-Neuronen innerhalb von drei Tagen führt, selbst bei 15 °C, und daher wird dieser Stamm bei 15 °C für den neuronalen Überlebensassay gezüchtet, wie zuvor berichtet^23,24.

Ein funktioneller Verlust von ASH-Neuronen in HA759-Nematoden kann vor dem Nachweis von Zelltod und Proteinaggregaten^{auftreten 13}; Daher ist der osmotische Vermeidungsverhaltenstest für die Beurteilung der PolyQ-vermittelten Toxizität unerlässlich. Um die potenziellen Auswirkungen von weniger aktiven HA759-Nematoden bei niedriger Temperatur auf Verhaltensexperimente zu minimieren, werden die Vermeidungsassayplatten in einem befeuchteten 23 °C-Inkubator und nicht bei 15 °C wie im neuronalen Überlebensassay mit diesem Stamm inkubiert. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Htn-Q150/OSM-10::GFP transgene Nematoden sehr empfindlich auf Nasenberührung reagieren; Daher ist ein alternativer Nachweis der ASH-Neuronenfunktion der Nasenberührungsassay¹³.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
C. elegans Stämme
AM141 rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/AM141
HA759 rtIs11 [osm-10p::GFP + osm-10p::HtnQ150 + dpy-20(+)]	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
https://cgc.umn.edu/strain/HA759E. coli Stämme
NA22	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/NA22
OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		https://cgc.umn.edu/strain/OP50
Reagenz
Agar	Shanghai EKEAR Bio-Technology Co., Ltd.	EQ1001-500G	https://www.ekear.com
Agarose	Biowest	111860
Butandion	Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.	80042427	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/d027c00e64c9404d9aa41391fbb59 5d0
Cholesterin	Sigma-Aldrich	C8667	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/product/sigma/c8667?context=product
Glycerin	Aladdin Co., Ltd.	G116203	https://www.aladdin-e.com/zh_cn/g116203.html
Peptone	Guangdong HuanKai Microbial Science and Technology Co., Ltd.	050170B	https://www.huankai.com/show/21074.html
Natriumazid	Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.	80115560	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/5e981aa807664e26af 551e96ff5f07cd
Natriumhydroxid	Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Ltd.	10019718	https://www.reagent.com.cn/goodsDetail/450dfdb1132a4d8a817 d3d8c68ec25e6
Natriumhypochloritlösung	Guangzhou Chemische Reagenzfabrik	7681-52-9	http://www.chemicalreagent.com/product/DetailProduct.aspx?id=125
Tryptonoxoid	Ltd.	LP0042B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0042B#/LP0042B
Hefeextrakt	Oxoid Ltd.	LP0021B	https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/LP0021B#/LP0021B
Equipment
	Nest Biotechnology Co., Ltd.	761001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
48-Well-Zellkulturplatte	Nest Biotechnology Co., Ltd.	748001	https://www.cell-nest.com/page94?_l=en&product_id=85
90 mm Petrischale	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F611003	https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F611003
Autoklav	Panasonic	MLS-3781L-PC
Präpariermikroskop	ChongQing Optical Co., Ltd.	ZSA0745	http://www.coicuop.com/plus/view.php?aid=64
Fluoreszenzmikroskop	Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	Mshot MF31-LED	https://www.mshot.com/article/442.html
High-Content-Bildgebungssystem	Molecular Devices	ImageXpress	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems#High-Content-Imaging
Mikrozentrifuge	GeneCompany	GENESPEED X1	https://www.genecompany.com/index.php/Home/Goods/goodsdetails/gid/189.html
Mikroskop Digitalkamera	Verifizierter Lieferant - Guangzhou Micro-shot Optical Technology Co., Ltd.	MS60	https://www.mshot.com/article/677.html
Mikrowelle	Midea Corp.	M1-211A	https://www.midea.cn/10000/10000000001 00511264425.html
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	https://www.sigmaaldrich.cn/CN/en/product/sigma/p7793?context=product
Shaker	Zhicheng Inc.	ZWY-2102C	http://www.zhicheng.net/Product/0865291356.html
Software
Bilderfassungs- und -analysesoftware	Molecular Devices	MetaXpress	https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metaxpress
OriginPro	OriginLab Corp.	Version 9.8.5.204	1. Fassung Einführung in die Software: https://www.originlab.com/index.aspx?go=Products/Origin 2. Anleitung zum Erstellen einer Radarkarte: https://www.originlab.com/doc/Origin-Help/RadarChart-Graph 3. Video-Tutorial zum Erstellen eines Radardiagramms: https://www.originlab.com/videos/details.aspx?pid=1813