Method Article

Anwendung der passiven Kopfbewegung zur Erzeugung definierter Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren

DOI:

10.3791/63100

⸱

July 21st, 2022

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1Department of Rehabilitation for Motor Functions, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 2Department of Assistive Technology, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities, 3Department of Metabolism and Endocrinology, Graduate School of Medicine, Juntendo University, 4Department of Rehabilitation Medicine, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 5Department of Clinical Research, National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein speziell entwickeltes "passives Kopfbewegungssystem", das mechanische Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren reproduziert, die während ihres Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten erzeugt werden. Es ermöglicht es, mechanische Faktoren / Elemente von den positiven Auswirkungen körperlicher Bewegung zu trennen.

Abstract

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Bewegung ist weithin als wirksam für verschiedene Krankheiten und körperliche Störungen anerkannt, einschließlich solcher, die mit Hirnfunktionsstörungen zusammenhängen. Die molekularen Mechanismen hinter den positiven Auswirkungen von Bewegung sind jedoch kaum verstanden. Viele körperliche Trainingseinheiten, insbesondere solche, die als Aerobic-Übungen wie Joggen und Gehen eingestuft werden, erzeugen impulsive Kräfte zum Zeitpunkt des Fußkontakts mit dem Boden. Daher wurde spekuliert, dass mechanische Einflüsse daran beteiligt sein könnten, wie Bewegung zur homöostase des Organismus beiträgt. Um diese Hypothese am Gehirn zu testen, wurde ein maßgeschneidertes "passives Kopfbewegungssystem" (im Folgenden als PHM bezeichnet) entwickelt, das vertikale Beschleunigungen mit kontrollierten und definierten Größenordnungen und Modi erzeugen und mechanische Stimulation reproduzieren kann, die während des Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten auf die Köpfe von Nagetieren angewendet werden kann, eine typische Intervention, um die Auswirkungen von Bewegung bei Tieren zu testen. Durch die Verwendung dieses Systems wurde gezeigt, dass PHM den Serotonin (5-Hydroxytryptamin, im Folgenden als 5-HT) bezeichnet) Rezeptor Subtyp 2A (5-HT2A) Signalweg in den präfrontalen Kortex (PFC) Neuronen von Mäusen rekapituliert. Diese Arbeit liefert detaillierte Protokolle für die Anwendung von PHM und die Messung der daraus resultierenden mechanischen Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren.

Introduction

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Bewegung ist vorteilhaft, um verschiedene körperliche Störungen zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich Zivilisationskrankheiten wie Diabetes mellitus und essentielle Hypertonie1. In diesem Zusammenhang wurden auch Beweise für die positiven Auswirkungen von Bewegung auf die Gehirnfunktionen gesammelt2. Die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Bewegung für das Gehirn zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend ungeklärt. Die meisten körperlichen Aktivitäten und Workouts erzeugen zumindest teilweise mechanische Beschleunigungen am Kopf. Während verschiedene physiologische Phänomene mechanisch reguliert werden, ist die Bedeutung der mechanischen Belastung in den meisten Fällen im Bewegungsapparatdokumentiert 3,4,5. Obwohl das Gehirn auch bei körperlichen Aktivitäten, insbesondere sogenannten Schlagübungen, mechanischen Kräften ausgesetzt ist, wurde die mechanische Regulation der physiologischen Gehirnfunktion bisher kaum untersucht. Da die Erzeugung mechanischer Beschleunigungen am Kopf bei körperlichem Training relativ häufig ist, wurde spekuliert, dass mechanische Regulierung an den Vorteilen von Bewegung für die Gehirnfunktionen beteiligt sein könnte.

5-HT2A-Rezeptorsignale sind essentiell für die Regulierung von Emotionen und Verhaltensweisen zwischen verschiedenen biochemischen Signalen, die im Nervensystem funktionieren. Es ist an multiplen psychiatrischen Erkrankungen 6,7,8 beteiligt, bei denen sich Bewegung als therapeutisch wirksam erwiesen hat. 5-HT2A-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT2-Rezeptors, der zur Serotonin-Familie gehört und auch ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie (GPCR) ist, deren Signalisierung durch seine Internalisierung moduliert wird, entweder ligandenabhängig oder -unabhängig9. Kopfzucken ist ein charakteristisches Verhalten von Nagetieren, dessen Menge (Frequenz) explizit die Intensität der 5-HT2A-Rezeptorsignalisierung in ihren präfrontalen Kortex (PFC) Neuronendarstellt 10,11. Unter Ausnutzung der strengen Spezifität dieser halluzinogenen Reaktion auf verabreichtes 5-HT (Kopfzuckenreaktion, im Folgenden als HTR bezeichnet; siehe Ergänzender Film 1) wurde die oben erwähnte Hypothese über mechanische Auswirkungen von Trainingseffekten auf Gehirnfunktionen getestet. Daher analysierten und verglichen wir die HTR von Mäusen, die entweder erzwungenen Übungen (Laufbandlauf) oder übungsnachahmenden mechanischen Eingriffen (PHM) unterzogen wurden.

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Protocol

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Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities genehmigt. 8-9 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet, um Beschleunigungen am Kopf während des Laufbandlaufs und PHM zu messen. 9-10 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse wurden für Verhaltenstests und histologische Analysen der PFC verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).

1. Messung von Beschleunigungen entlang der x-, y- und z-Achse während des Laufbandlaufs

  1. Anästhesieren Sie die Ratte mit Inhalation von 1,5% Isofluran.
    HINWEIS: Die Ratten wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebung verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert.
  2. Befestigen Sie den Beschleunigungsmesser (siehe Materialtabelle) mit chirurgischem Klebeband auf dem Kopf der Ratte.
  3. Nach vollständiger Erholung von der Narkose setzen Sie die Ratte in die Laufbandmaschine (siehe Materialtabelle) und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (20 m/min)12 ein (Abbildung 1A).
    HINWEIS: Es dauerte mindestens 20 Minuten, um die vollständige Erholung der Ratte von der Anästhesie nach Beendigung der Isofluran-Inhalation zu bestätigen und das Laufbandexperiment zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Ratte auf eine Zehenklemmung der Hinterbeine reagiert und in der Lage ist, ohne offensichtliches Taumeln zu gehen oder zu laufen.
  4. Messen Sie die Größe der vertikalen Beschleunigungen während des Laufbandlaufs von Ratten mit der Anwendungssoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Extrahieren Sie 10 serielle Wellen und berechnen Sie individuell die durchschnittlichen Beschleunigungen entlang der 3-dimensionalen Achsen (x-, y- und z-Achsen, Abbildung 1B). Die Spitzengrößen wurden quantifiziert, indem schrittsynchronisierte Wellen (~2 Hz-Frequenz) als laufbandinduzierte Beschleunigungen definiert wurden (Abbildung 1C). Für diese Studie wurden Ratten verwendet, da ihre größere Körpergröße geeignet war, die vertikale Beschleunigung am Kopf zuverlässig zu messen, was bei Mäusen nicht möglich war. Mäuse wurden jedoch für weitere Studien verwendet, da die quantitative Analyse der Kopfzuckenreaktion einfach und zuverlässig ist.

2. Anpassung des PHM-Systems und Anwendung von PHM an Mäusen

  1. Stellen Sie die Amplitude der Schwingung der Plattform und die Rotationsgeschwindigkeit der propellerförmigen Nocke im PHM-System vor (Abbildung 1D), so dass Größe und Frequenz der vertikalen Beschleunigung mit den in Schritt 1.4 erhaltenen Werten übereinstimmen.
    HINWEIS: Das PHM-System besteht aus einem Metallrahmen und einer Holzplattform. Die Motordrehzahl kann durch Einstellen des an den eingebauten Treiber angeschlossenen Drehrads geändert und gesteuert werden (siehe Materialtabelle). Die Zifferblattskala von 600 entspricht 2 Hz, Abbildung 1E. Die propellerförmige Nocke hat vier Blätter mit 5 mm Stufenhöhe (Bild 1F).
  2. Betäuben Sie die Maus durch Einatmen von 1,2% Isofluran.
    HINWEIS: Mäuse wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebungen verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert.
  3. Platzieren Sie die Maus in einer Bauchlage, wobei sich der Kopf und der Rest des Körpers auf der oszillierbaren bzw. statischen Plattform befinden.
    HINWEIS: Halten Sie die Maus betäubt (1,2% Isofluran).
  4. Schalten Sie den Motor ein, um die Plattform vertikal zu oszillieren, und wenden Sie PHM auf die Maus an.
    HINWEIS: Die Motordrehzahl wurde so eingestellt, dass die Plattform mit 2 Hz oszilliert wird (siehe Schritt 2.1). Betäuben und platzieren Sie die Steuermaus ebenfalls auf der PHM-Plattform, aber lassen Sie den Motor aus.

3. Laufen der Maus auf dem Laufband

  1. Setzen Sie die Maus auf das Laufband und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (10 m/min)13 ein.

4. Quantifizierung der Kopfzuckenreaktion der Maus (HTR)

  1. Richten Sie die Videokamera (Bildrate: 24 fps) so ein, dass sie den gesamten Raum im transparenten Kunststoffgehäuse aufzeichnet.
    HINWEIS: Der Kunststoffkäfig wurde verwendet, um die Maus im Bereich der Videoaufzeichnung zu halten.
  2. Intraperitoneal 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) (100 mg/kg) (siehe Materialtabelle), die Vorstufe von 5-HT, einer Maus verabreichen.
  3. Legen Sie die Maus in den transparenten Käfig und starten Sie die Aufnahme für 30 Minuten.
  4. Überprüfen Sie das aufgenommene Video (1/2x oder 1/3x Geschwindigkeit) und zählen Sie das Kopfzucken manuell.
    HINWEIS: Die Analytiker waren nicht blind für das experimentelle Verfahren. Die charakteristische "Tic-ähnliche" schnelle Bewegung der Maus (siehe Ergänzender Film 1) wurde als Kopfzucken gezählt, das unter normaler Brutumgebung selten auftritt.

5. Immunhistochemische Analyse von Maus-PFC

  1. Sobald die HTR-Tests abgeschlossen sind, betäuben Sie die Maus, indem Sie die Mischung aus Midazolam (4,0 mg / kg), Butorphanol (4,0 mg / kg) und Medetomidin (0,3 mg / kg) verabreichen, Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS und entfernen Sie dann das Gehirn nach zuvor veröffentlichten Berichten14,15.
  2. Die Gehirne in 4% PFA in PBS für weitere 24 Stunden bei 4 °C nachfixieren und in 30% Saccharose/PBS lagern, bis sie sinken. Frieren Sie die fixierte optimale Schnitttemperaturmischung (OCT-Mischung, siehe Materialtabelle) ein.
  3. Rufen Sie die Kryoschnitte des Mausgehirns aus der Folienbox ab (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Objektträger auf sauberen Tüchern bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig dehydriert sind.
    HINWEIS: Zwanzig Mikrometer dicke sagittale Abschnitte (lateral +0,5–1,5 mm) wurden aus gefrorenen Proben, die in OCT-Verbindung eingebettet sind, unter Verwendung eines Kryostaten hergestellt (siehe Materialtabelle).
  4. Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblockerstift (siehe Materialtabelle), um einen Kreis um das kryogeschnittene Gewebe auf dem Objektträger zu zeichnen, um den Ausbreitungsbereich der Lösung einzuschließen (0,1% Tween-20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS-T).
  5. Legen Sie angefeuchtete Tücher auf den Boden eines Tabletts, in dem sich die Objektträger befinden, um eine feuchte Umgebung zu schaffen.
  6. Nach der Permeabilisierung mit TBS-T mit 4% Eselserum (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 h blockieren.
  7. Spülen Sie die Objektträger einmal durch 5 min Eintauchen in TBS-T.
  8. Tragen Sie 100 μL entsprechend verdünnten primären Antikörper und DAPI-Mischung (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf, decken Sie das Tablett ab, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
  9. Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
  10. Tragen Sie 100 μL eines entsprechend verdünnten speziespassenden fluoreszierenden Sekundärantikörpers (konjugiert mit Alexa Fluor 488, 568 oder 645) (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur.
  11. Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
  12. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium (siehe Materialtabelle). Bedecken Sie die Dias mit Deckgläsern.
  13. Betrachten Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop.

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Results

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Die Spitzengröße der vertikalen Beschleunigungen an den Köpfen der Ratten während ihres Laufbandlaufs mit moderater Geschwindigkeit (20 m/min) betrug etwa 1,0 × g (Abbildung 1C). Das PHM-System (Abbildung 1D) wurde eingerichtet, um vertikale Beschleunigungsspitzen von 1,0 × g an den Köpfen der Nagetiere zu erzeugen.

Die PHM-Anwendung (2 Hz, 30 min/Tag für 7 Tage) an Mäusen dämpfte ihre HTR im Vergleich zu den Kontrol...

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Discussion

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Mit dem entwickelten PHM-Applikationssystem haben wir gezeigt, dass die 5-HT-Signalisierung in ihren PFC-Neuronen mechanisch reguliert wird. Aufgrund der Komplexität der Bewegungseffekte war es schwierig, die Folgen von Bewegung im Rahmen der Gesundheitsförderung genau zu analysieren. Der Fokus liegt auf mechanischen Aspekten, um die Beteiligung oder den Beitrag von Stoffwechselereignissen auszuschließen, die mit oder nach Trainingsaktivitäten auftreten können, wie z.B. Energieverbrauch. Es wird erwartet, dass die hier b...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass mit der in diesem Beitrag beschriebenen Arbeit kein konkurrierendes Interesse verbunden ist.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde teilweise durch den Intramural Research Fund des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales unterstützt; Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); MEXT-unterstütztes Programm für die Strategic Research Foundation an privaten Universitäten, 2015-2019 vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (S1511017); die Naito Science & Engineering Foundation. Diese Forschung wurde auch von der Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T) finanziert, die vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health unter der Award-Nummer P2CHD086843 unterstützt wird.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-Hydroxytryptophan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Serotonin (5-HT)-Vorläufer
Bürstenloser MotortreiberOrientalischer MotorBMUD30-A2Eingebauter Drehzahlwechsler Motortreiber
C57BL/6 MäuseOrientalische HefefirmaC57BL/6JMäuse, die in dieser Studie verwendet wurden
KryostatLeicaCM33050SMikrotom zum Schneiden von gefrorenen Proben
GleichstrommotorOrientalischer MotorBLM230-GFV2Motor
Esel Anti-Ziege Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Sekundärantikörper für die immunhistochemische Färbung
Esel Anti-Maus Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Sekundärer Antikörper für die immunhistochemische Färbung
Esel Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Sekundärer Antikörper für die immunhistochemische Färbung
EselsserumSigma-AldrichS30-100MLBlocker der unspezifischen Bindung von Antikörpern bei der immunhistochemischen Färbung
FluoreszenzmikroskopKeyenceBZ-9000Fluoreszenzmikroskop
polyklonaler Anti-5-HT2ARezeptorSanta Cruz Biotechnologysc-15073Primärer Antikörper für die immunhistochemische Färbung
IsofluranPfizerv002139Inhalationsanästhetikum
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Papiertuch zur Reinigung von Oberflächen, Teilen, Instrumenten im Labor
Liquid BlockerDaido SangyoPAP-SMarker zur Herstellung der Objektträgeroberfläche wasserabweisend
Monoklonales Anti-NeuN der Maus (Klon A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Primärer Antikörper für die immunhistochemische Färbung
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Beschleunigungsmesser zur Messung von Beschleunigungen
OCT-VerbindungSakura Finetek45833Einbettungsmittel zur Vorbereitung von gefrorenen Gewebeschnitten
ProLong Gold Antifade EindeckmittelInvitrogenP36934Einbettmedium zur Vorbeugung
polyklonales Anti-c-Fos KaninchenSanta Cruz Biotechnologiesc-52Primärer Antikörper für die immunhistochemische Färbung
ObjektträgerboxAS ONE03-448-1Undurchsichtige Box zur Aufbewahrung von Objektträgern
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AAnwendungssoftware zur Analyse der Beschleunigung
Sprague-Dawley-RattenJapan SLCSlc:SDRatten, die in dieser Studie verwendet wurden
LaufbandmaschineMuromachiMK-680 System,das in Experimenten mit erzwungenem Laufen von Ratten und Mäusen verwendet wurde

References

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