Methodenartikel

Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

DOI:

10.3791/63116

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8. November 2021

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1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Zusammenfassung

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Mitochondrien sind wichtig für die Pathophysiologie vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Änderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), der mitochondrialen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig Merkmale dieser Prozesse. Dieser Bericht beschreibt einen neuartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleiteter Neural- und Gliazellen. Diese flussbasierte Strategie verwendet lebende Zellen zur Messung des mitochondrialen Volumens, des MMP- und ROS-Spiegels sowie fixierte Zellen zur Schätzung von Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und mtDNA-assoziierte Proteine wie den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM).

Durch Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, einschließlich MitoTracker Green (MTG), Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) und MitoSox Red, können Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des MMP und der mitochondrialen ROS quantifiziert und mit dem mitochondrialen Inhalt in Beziehung gesetzt werden. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20 (TOMM20) ermöglicht die Beurteilung der MRC-Untereinheitsexpression. Da die Menge an TFAM proportional zur mtDNA-Kopienzahl ist, ergibt die Messung von TFAM pro TOMM20 eine indirekte Messung der mtDNA pro mitochondrialem Volumen. Das gesamte Protokoll kann innerhalb von 2-3 h durchgeführt werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle die Messung mitochondrialer Parameter sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.

Einleitung

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Mitochondrien sind essentielle Organellen, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Mitochondrien sind für die Energieversorgung verantwortlich, indem sie Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung produzieren und als metabolische Vermittler für Biosynthese und Stoffwechsel fungieren. Mitochondrien sind tief an vielen anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie ROS-Generierung, Zelltod und intrazellulärer Ca2+-Regulation. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Huntington-Krankheit (HD), Friedreich-Ataxie (FRDA) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)1. Es wird auch angenommen, dass eine erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mtDNA-Anomalie zum menschlichen Altern beitragen 2,3.

Verschiedene Arten von mitochondrialer Dysfunktion treten bei neurodegenerativen Erkrankungen auf, und Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der MMP-Depolarisation, der Produktion von ROS und Veränderungen der mtDNA-Kopienzahl sind häufig 4,5,6,7. Daher ist die Fähigkeit, diese und andere mitochondriale Funktionen zu messen, von großer Bedeutung, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu testen. Darüber hinaus ist angesichts des Mangels an Tiermodellen, die menschliche neurodegenerative Erkrankungen originalgetreu nachbilden, die Etablierung geeigneter In-vitro-Modellsysteme, die die menschliche Krankheit in Gehirnzellen rekapitulieren, ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis dieser Krankheiten und zur Entwicklung neuer Therapien 2,3,8,9.

Humane iPS-Zellen können verwendet werden, um verschiedene Gehirnzellen zu erzeugen, einschließlich neuronaler und nicht-neuronaler Zellen (dh Gliazellen), und mitochondriale Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden in beiden Zelltypengefunden 3,10,11,12,13. Geeignete Methoden zur iPSC-Differenzierung in neuronale und gliale Linien stehen zur Verfügung14,15,16. Diese Zellen bieten eine einzigartige Mensch-Patienten-Plattform für die In-vitro-Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening. Da diese von Patienten stammen, liefern iPSC-abgeleitete Neuronen und Gliazellen Krankheitsmodelle, die genauer widerspiegeln, was beim Menschen passiert.

Bisher gibt es nur wenige komfortable und zuverlässige Methoden zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter in iPS-Zellen, insbesondere lebenden Neuronen und Gliazellen. Der Einsatz der Durchflusszytometrie bietet dem Wissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung biologischer Parameter, einschließlich der mitochondrialen Funktion, in einzelnen Zellen. Dieses Protokoll liefert Details für die Erzeugung verschiedener Arten von Gehirnzellen, einschließlich neuraler Stammzellen (NSCs), Neuronen und glialer Astrozyten aus iPSCs, sowie neuartige durchflusszytometrische Ansätze zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich iPSCs und iPSC-abgeleiteten Neural- und Gliazellen. Das Protokoll bietet auch eine Co-Färbestrategie für die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Messung des mitochondrialen Volumens, MMP, mitochondrialen ROS-Spiegels, MRC-Komplexe und TFAM. Durch die Einbeziehung von Messungen des mitochondrialen Volumens oder der mitochondrialen Masse ermöglichen diese Protokolle auch die Messung sowohl des Gesamtniveaus als auch des spezifischen Niveaus pro mitochondrialer Einheit.

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Protokoll

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HINWEIS: In der Materialtabelle und der Zusatztabelle S1 finden Sie Rezepturen aller in diesem Protokoll verwendeten Medien und Lösungen.

1. Differenzierung humaner iPS-Zellen in NCSs, dopaminerge (DA) Neuronen und Astrozyten

  1. Matrixbeschichtete Platten vorbereiten.
    1. Eine Durchstechflasche mit 5 ml Matrix über Nacht auf Eis auftauen. Verdünnen Sie 1 ml Matrix mit 99 ml kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% Endkonzentration). Stellen Sie 1 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
    2. Die Matrixlösung bei 4 °C auftauen (kalt halten) und 6 Vertiefungen (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) beschichten.
    3. Legen Sie die matrixbeschichtete Platte für 1 h in einen befeuchteten 5% CO2/95% Luftinkubator bei 37 °C. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platte innerhalb von 3 Tagen nach der Beschichtung zu verwenden. Die beschichtete Platte kann jedoch bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Denken Sie nur daran, es herauszunehmen und vor dem Gebrauch auf RT aufwärmen zu lassen. Für eine Langzeitlagerung 1 ml iPSC-Kulturmedium auf die beschichtete Platte geben, um ein Austrocknen der Matrix zu vermeiden.
  2. Auftauen von iPSCs
    1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
    2. Mischen Sie 6 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL Y-27632 ROCK-Inhibitor, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erhalten.
    3. Die gefrorene Durchstechflasche mit iPSCs bei 37 °C in einem Wasserbad teilweise auftauen, bis ein kleines Stück Eis übrig bleibt.
    4. Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL ROCK-Inhibitor tropfenweise in die Zellen. Den flüssigen Inhalt der Durchstechflasche mit iPSCs tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-vorbeschichteten Platte mit einer 5-ml-Pipette überführen.
    5. Bewegen Sie die Platte in senkrechten Richtungen, um den Brunneninhalt zu mischen und die Platte in den Inkubator zurückzubringen. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium nach 24 h nach dem Waschen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      HINWEIS: Fügen Sie ROCK-Hemmer nicht zu nachfolgenden Fütterungen hinzu. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium täglich.
  3. Subkulturierung von iPSCs
    1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
    2. Das Kulturmedium von den Platten mit den Zellen absaugen. Spülen Sie die iPSCs mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
    3. Fügen Sie EDTA (0,5 mM) (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis sich die Ränder der Kolonien aus dem Brunnen heben (normalerweise 3-5 min). Saugen Sie die EDTA ab.
    4. Fügen Sie vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu und lösen Sie die iPSC-Kolonien einmal mit einer sterilen 10-ml-Pipette gewaltsam. Pipettieren Sie nicht auf und ab, da dies Zellklumpen in einzelne Zellen zerlegen kann.
    5. Der Inhalt jeder Vertiefung wird in zwei einzelne Vertiefungen in einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) überführt und bei 37 °C inkubiert. Erzeugen Sie beim Pipettieren keine Blasen in der Suspension.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie sie im Inkubator aufbewahren. Das Split-Verhältnis kann 1:2 (eine Bohrung in 2 neue Bohrungen) bis 1:4 (eine Bohrung in 4 neue Bohrungen) betragen.
    6. Ersetzen Sie das Medium täglich, bis die Kolonien 60% Konfluenz mit guter Größe und Verbindungen erreichen.
  4. Neuronale Induktion und neuronale Vorläufergenerierung
    1. Bereiten Sie 500 ml chemisch definiertes Medium (CDM), 500 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) und 500 ml neural stem cell serumfreies (NSC SF) Medium vor.
    2. Spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
    3. Ersetzen Sie das NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) an Tag 1, Tag 3 und Tag 4 und beobachten Sie täglich unter der Mikroskopie.
    4. An Tag 5 lösen Sie die neuronalen Rosetten wie unten beschrieben in die Suspensionskultur.
      1. Einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen. Fügen Sie Kollagenase IV hinzu (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und bewahren Sie sie 1 Minute in einem Inkubator auf. Die Kollagenase IV absaugen und einmal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) vorsichtig waschen.
      2. Fügen Sie 2 ml NSC SF Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Platte hinzu. Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Böden der Vertiefungen abkratzen, indem Sie Gitter mit einer 200-μL-Pipettenspitze zeichnen.
      3. Sammeln Sie die Zellsuspension von der 6-Well-Platte in eine 10 cm nicht haftende Schale. Erhöhen Sie das Volumen mit NSC SF Medium auf 12 ml.
      4. Schütteln Sie die nicht haftende Schale bei 65-85 U/min auf einem Orbitalschüttler in einem Inkubator, um eine Aggregation zu verhindern.
  5. DA-Neuronendifferenzierung
    1. An Tag 7 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-8b (FGF-8b) und legen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
    2. An den Tagen 8-13 das Medium alle 2 Tage wechseln und täglich unter der Mikroskopie beobachten.
    3. An Tag 14 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng/ml FGF-8b und 1 μM Purmorphamin (PM). Stellen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
    4. An den Tagen 15-20 wechseln Sie das Medium alle 2 Tage und beobachten die Zellen täglich unter der Mikroskopie.
    5. Durchlässigen Sie die Kugeln mechanisch, indem Sie 1000 μL-Spitzen verwenden, um die größeren Kugeln aufzubrechen.
      HINWEIS: Das Verhältnis kann 1:2 betragen (ein Gericht in 2 neue Gerichte).
  6. Beendigung der Differenzierung
    1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte oder Deckgläser mit Poly-L-Ornithin (PLO) und Laminin wie unten beschrieben.
      1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 ml PLO pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20 min. Saugen Sie die PLO-Lösung ab.
      2. Sterilisieren Sie die Platte unter UV für 20 min. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      3. 5 μg/ml Lamininlösung (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) in die Vertiefung geben und bei 37 °C für 2 h inkubieren. Das Laminin absaugen und die Vertiefungen vor dem Plattieren einmal kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen.
    2. Alle Kugeln (ab Schritt 1.5.5) in 50-ml-Röhrchen sammeln und mit DPBS (1x) nachfüllen. Bei 300 × g 5 min schleudern. Asspirieren Sie den Überstand.
    3. Inkubieren Sie mit 2 ml Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) für 10 min bei 37 °C im Wasserbad, gefolgt von sanfter Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
    4. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz mit 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und zentrifugieren Sie das 50 ml konische Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT.
    5. Fügen Sie 1 ml CDM hinzu, ergänzt mit 10 ng / ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 10 ng / mL Gliazelllinien-abgeleitetem neurotrophem Faktor (GDNF), um die Zellpellets durch sanftes Pipettieren auf und ab zu resuspendieren, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
    6. Die Lamininlösung wird von der Platte abgesaugt (Schritt 1.6.1.3), kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) abgesaugt und die Zellen (ab Schritt 1.6.5) in die vorbeschichteten Platten oder Deckgläser in 3 ml CDM gesät, ergänzt mit 10 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF. Füttern Sie die Zellen alle 4 Tage.
      HINWEIS: Unterscheidungskulturen können für viele Wochen bis zu 3 Monate beibehalten werden. Die neuronale Morphologie tritt in der Regel nach 2 Wochen nach Beendigung auf und kann ab diesem Zeitpunkt für nachgeschaltete Analysen verwendet werden. BDNF und GDNF sind für die Kultivierung für längere Pflege (bis zu 2 Monate) nicht notwendig.
  7. NSC-Erzeugung
    1. Matrixplatten beschichten.
    2. Sammeln Sie alle neuronalen Kugeln (generiert aus Schritt 1.4) in 50-ml-Röhrchen und füllen Sie sie mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) auf. Bei 300 × g 5 min drehen. Saugen Sie die Überstände ab.
    3. Die Pellets mit 2 mL Zelldissoziationsreagenz für 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, gefolgt von einer sanften Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
    4. Neutralisieren Sie mit 2 ml DMEM mit 10% FBS und zentrifugieren Sie die 50 ml konischen Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie die Zellpellets, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um einzellige Suspensionen zu erhalten.
    5. Die Matrixlösung aus einer vorbeschichteten Platte absaugen und die Zellen in die vorbeschichteten Platten in NSC SF Medium einsäen (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage und teilen Sie die Zellen, wenn sie zusammenfließen.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt können NSCs erweitert und eingefroren werden.
  8. Differenzierung von Glia-Astrozyten
    1. Astrozyten-Differenzierung von NSCs
      1. Bereiten Sie 500 ml Astrozyten-Differenzierungsmedium vor.
      2. Saat-NSCs auf Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Platten/Deckgläsern mit NSC SF Medium.
      3. Am nächsten Tag spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Astrocyte Differentiation Medium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
      4. Beobachten Sie die NSCs täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozytendifferenzierungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage von Tag 1 bis 27.
    2. Astrozyten-Reifung
      1. Astrozyten-Reifungsmedium vorbereiten.
      2. Am Tag 28 spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu.
      3. Beobachten Sie am Tag 29 und danach die Zellen täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage.
      4. Nach einem Monat Reifung expandieren Sie die Zellen und kryokonservieren sie ab diesem Stadium.
        HINWEIS: Während dieser Phase erhöht sich die Anzahl der Zellen. Bei der Spaltung der Zellen sind PDL-beschichtete Deckgläser für die Kultivierung nicht notwendig.

2. Zellcharakterisierung durch Immunzytochemie und Immunfluoreszenzfärbung

  1. Am Ende der Kulturperiode die Deckgläser mit den Zellen auf eine 12-Well-Platte übertragen.
    Spülen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1x) und inkubieren Sie für 10 min in 4% Paraformaldehyd (PFA) (0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) bei RT.
    HINWEIS: Die fixierte Probe kann mit 2 ml PBS (1x) abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden, bis sie für die Immunfärbung erforderlich ist. PFA ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
  2. Blockieren und permeabilisieren Sie die Zellen und inkubieren Sie mit Blockierpuffer, der PBS (1x), 0,3% Triton X-100 und 10% normales Ziegenserum für 1 h bei RT enthält.
  3. Inkubation mit primären Antikörpern im Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C: Färbung von iPSCs mit Anti-Oktamer-bindendem Transkriptionsfaktor 4 (Oct4) und anti-stage-spezifischem embryonalem Antigen-4 (SSEA4), NSCs mit anti-geschlechtsbestimmender Region Y box-2 (Sox2) und Anti-Nestin, neuronale Sphären mit anti-paired box-6 (Pax6) und Anti-Nestin, Astrozyten mit anti-glialem fibrillärem saurem Protein (GFAP) und Anti-S100-Calcium-bindendem Protein β (S100β) und DA-Neuronen mit Anti-Tyrosinhydroxylase (TH), Anti-β-III-Tubulin (Tuj 1), Anti-Synaptophysin und Anti-PSD-95 (0,5 ml primäre Antikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte; Einzelheiten siehe Materialtabelle ).
  4. Die Proben mit PBS (1x) dreimal für jeweils 10 min unter leichtem Schaukeln waschen.
  5. Inkubieren Sie mit sekundärer Antikörperlösung (1:800 im Blockierpuffer, 0,5 ml Alexa Fluor Sekundärantikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) für 1 h bei RT mit leichtem Schaukeln.
  6. Inkubieren Sie die Zellen mit Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) in PBS (1x) für 15 min bei RT, um die Kerne zu markieren.
  7. Montieren Sie die Zellen mit Montagemedium und trocknen Sie über Nacht bei RT für die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop im Dunkeln. Siehe Ergänzende Abbildung S1 für die Mikroskopeinstellungen und -parameter.

3. Durchflusszytometrische Messung des mitochondrialen Volumens, MMP und mitochondrialen ROS in lebenden Zellen

  1. Säen Sie die Zellen separat in 4 Vertiefungen in einer 6-Well-Platte, bis die Zellen 50% -60% Konfluenz erreichen. Beschriften Sie diese vier Brunnen als #1, #2, #3 und #4.
  2. Am Ende der Kulturperiode 5 einzelne Färbelösungen (500 μL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) wie folgt vorbereiten: #1 nur Kulturmedium (bis Vertiefung #1 enthält nur Zellen zur Kontrolle); #2-1 mit FCCP (100 μM); #2-2 mit FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #3 mit TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #4 mit MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) mit 10% FBS. Siehe Abbildung 1A, Zusatztabelle S2 und Materialtabelle für Details zu diesen Verbindungen und dem Aufbau der Durchflusszytometrie.
    HINWEIS: Verwenden Sie das Kulturmedium, um die Färbelösung vorzubereiten. Erwärmen Sie das Medium und PBS (1x) bei RT vor dem Gebrauch. FCCP ist giftig; Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
  3. Saugen Sie das Medium aus der #2-Welle ab und fügen Sie #2-1-Lösung hinzu (nur FCCP). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 min.
  4. Saugen Sie das Medium aus #2 und #3 Wells ab und fügen Sie #2-2 Lösung (FCCP + TMRE + MTG) in der #2 Welle und #3 Lösung (TMRE + MTG) in #3 hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 45 min.
  5. Saugen Sie das Medium aus der #4-Welle ab und fügen Sie die #4-Lösung hinzu (MitoSox Red + MTG). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 15 min.
  6. Saugen Sie das Medium aus allen Bohrlöchern ab. Mit PBS (1x) waschen (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Lösen Sie die Zellen mit 1 ml Zelldissoziationsreagenz (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) bei 37 °C für 5 min. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz in 1 ml DMEM mit 10% FBS (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
  7. Sammeln Sie den Inhalt aller Vertiefungen in konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 × g für 5 min. Waschen Sie die Pellets ein- bis zweimal mit PBS (1x).
  8. Die Überstände absaugen, aber etwa 100 μL in den Röhrchen belassen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Röhren bei RT im Dunkeln.
  9. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie MTG in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter, TMRE in Filter 2 (FL2) mit dem Bandpassfilter 585/40 und MitoSox Red in Filter 3 (FL3) mit einem 510/580-Bandpassfilter.

4. Durchflusszytometrische Messung von MRC-komplexen Untereinheiten und TFAM in festen Zellen

  1. Am Ende der Kulturperiode lösen Sie die Zellen (~ 106) durch Zugabe des Zelldissoziationsreagenzes; Dann pelletieren und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
  2. Fixieren Sie die Zellen in 1,6% PFA (1 ml 1,6% PFA in einem 15 ml Röhrchen) bei RT für 10 min. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
  3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit eiskaltem 90% Methanol (1 mL 90% Methanol in einem 15 ml Röhrchen) bei -20 °C für 20 min.
  4. Blockieren Sie die Proben in einem Blockierpuffer, der 0,3 M Glycin, 5% Ziegenserum und 1% Rinderserumalbumin (BSA) - Fraktion V in PBS (1x) enthält (1 ml Blockierpuffer in einem 15-ml-Röhrchen). Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) zentrifugiert (wie in Schritt 3.7).
  5. Inkubieren Sie die Zellen mit den folgenden primären Antikörpern für 30 min: Anti-NDUFB10 (1:1.000) zur Messung der Komplex-I-Untereinheit, Anti-Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A (SDHA, 1:1.000) zur Messung der Komplex-II-Untereinheit und Anti-COX IV (1:1.000) zur Messung der komplexen IV-Untereinheit und Anti-TFAM-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:400). Färben Sie die gleiche Anzahl von Zellen separat mit Anti-TOMM20-Antikörpern, die mit Alexa Fluor 488 (1:400) konjugiert sind, für 30 min (1 ml primäre Antikörperlösung in einem 15-ml-Röhrchen; Details zu den Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle ).
  6. Die Zellen mit PBS (1x) einmal bei Zentrifugation bei 300 × g für 5 min waschen. Fügen Sie sekundäre Antikörper (1:400) in Röhrchen mit NDUFB10, SDHA und COX IV hinzu und inkubieren Sie die Zellen mit diesen Lösungen für 30 min.
  7. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Die Überstände werden abgesaugt, wobei etwa 100 μL in den Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die im Dunkeln auf Eis aufbewahrt werden.
  8. Analysieren Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie Signale in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.

5. Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie

  1. Verwenden Sie das nicht gefärbte Steuerrohr, um die Vorwärtsstreuflächen- (FSC-A) und Seitenstreuflächendiagramme (SSC-A) basierend auf der Größe und Komplexität der analysierten Zellpopulation festzulegen. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.
    HINWEIS: Richten Sie nicht gefärbte Kontrollen für einzelne Zelltypen ein.
  2. Verwenden Sie die Nicht-Fleckenkontrollröhrchen, um die positiven Gatter auszuwählen, und verwenden Sie einfarbige Steuerröhren, um die spektrale Überlappung der Fluoreszenz-Spektralüberlappung zwischen MTG (Fluorophor-1 [FL-1]) und TMRE (FL-2) in der Mehrfarben-Durchflusszytometrie zu kompensieren. Verwenden Sie die Isotypkontrolle für die Negativkontrolle, um die Hintergrundfärbung in MRC- und TFAM-Proben zu überwachen. Verwenden Sie die FCCP-Röhre als Depolarisationskontrolle für die TMRE-Färbung.
  3. Gate aus Fremdkörpern, um stromführende Zellen und die Hauptansteuerung aus dem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm auszuwählen (Abbildung 2A). Gate out-Dubletten unter Verwendung eines Vorwärtsstreuhöhen- (FSC-H) versus (vs.) FSC-A-Dichtediagramms, um Dubletten auszuschließen und auch ein Seitenstreuhöhendiagramm (SSC-H) vs. SSC-A-Diagramm zu konstruieren (Abbildung 2A).
  4. Datenerfassung (Durchflusszytometer)
    1. Verwenden Sie die ungefärbten oder isotypischen Proben als Negativkontrolle, um ein Tor über der Hauptpopulation der Einzelzellereignisse zu erstellen, während Sie SSC-A und die verschiedenen Filter (FL1, FL2, FL3, FL4) betrachten (Abbildung 1B und Abbildung 2B).
  5. Datenanalyse (CFlow Software)
    1. Kopieren Sie die Position der Gatter auf die gefärbten Zellproben und notieren Sie die Menge der positiv gefärbten Zellen für die positive Färbung.
    2. Wählen Sie für jede Zellsubpopulation ein Histogrammdiagramm aus und analysieren Sie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) der verschiedenen Filterkanäle (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-Achse).
      1. Berechnen Sie die TMRE-Werte, indem Sie den MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen vom MFI von FL2 von #3 TMRE-gefärbten Proben in einem Histogramm subtrahieren, wie in Eq (1) unten.
        TMRE-Werte = MFI von FL2 aus #3 TMRE-gefärbten Proben - MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen (1)
      2. Berechnen Sie die spezifischen Werte für MMP und mitochondriale ROS durch MFI in TMRE oder MitoSox Red, wobei der mitochondriale Volumenindikator MTG dividiert wird.
      3. Berechnen Sie den spezifischen Wert für komplexe Untereinheiten und TFAM, indem Sie MFI in komplexer Expression oder TFAM verwenden, wobei der mitochondriale Volumenindikator TOMM20 dividiert wird.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode und der durchflusszytometrischen Strategien ist in Abbildung 3 dargestellt. Humane iPS-Zellen werden in neuronale Rosetten differenziert und dann zur Differenzierung in neuronale Sphären in die Suspensionskultur gehoben. Neuronale Sphären werden weiter differenziert und zu DA-Neuronen gereift. Neuronale Kugeln werden in einzelne Zellen dissoziiert, um gliale Astrozyten zu erzeugen, die in Monoschichten als NSCs umplattiert und dann i...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin befinden sich Protokolle zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten und zur Bewertung mehrerer Aspekte der mitochondrialen Funktion mittels Durchflusszytometrie. Diese Protokolle ermöglichen eine effiziente Umwandlung menschlicher iPS-Zellen in Neuronen und Glia-Astrozyten und die detaillierte Charakterisierung der mitochondrialen Funktion, hauptsächlich in lebenden Zellen. Die Protokolle bieten auch eine auf der Durchflusszytometrie basierende Strategie zur Erfassung und Analyse mehrerer mitochon...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken dem Molecular Imaging Centre und der Flow Cytometry Core Facility an der Universität Bergen in Norwegen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Norwegian Research Council (Förderkennzeichen: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat und des China Scholarship Council (Projektnummer: 201906220275) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primärer Antikörper; verwendbar als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Primärer Antikörper; verwenden als 1:50, 20 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 594 Anti-Hühner-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) als Sekundärantikörper.
Anti-S100Β   konjugiert mit Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primärer Antikörper; verwenden als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949Primärer Antikörper; verwendbar als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 594 Anti-Hühner-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) als Sekundärantikörper.
anti-TFAM, konjugiert mit Alexa Fluor 488Abcamab198308Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; monoklonales IgG2b -Maus verwenden; Alexa Fluor® 488 als Isotyp-Kontrolle.
anti-TOMM20 konjugiert mit Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; monoklonales IgG2a -Maus verwenden; Alexa Fluor® 488 als Isotyp-Kontrolle.
anti-NDUFB10Abcamab196019Primärer Antikörper; verwendbar als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
anti-SDHAAbcamab137040Primärer Antikörper; verwendbar als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primärer Antikörper; verwenden als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; verwenden  Alexa Fluor ® 488 Ziegen Anti-Maus IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) als Sekundärantikörper; monoklonales Maus-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
Activin APeproTech120-14EAstrozyten-Differenzierungsmedium Inhaltsstoff
ABM BasalmediumLonzaCC-3187Basalmedium für Astrozytenkultur
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Nahrungsergänzungsmittel für Astrozytenkultur
Antibiotisch-AntimykotischThermo Fisher Scientific15240062CDM Inhaltsstoff
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Basalmedium für verdünntes Geltrex
Rinderserum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays und CDM-Wirkstoff
BDNFPeproTech450-02DA Neuronen mittlerer Inhaltsstoff
B-27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044Wirkstoff für Astrozytendifferenzierungsmedium
BD Accuri C6 Plus DurchflusszytometerBD Biosciences, USA
Chemisch definiertes LipidkonzentratThermo Fisher Scientific11905031CDM-Inhaltsstoff
Kollagenase IVThermo Fisher Scientific17104019Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs
CCD-Mikroskop Kamera Leica DFC3000 GLeica Mikrosysteme, Deutschland
Corning unbehandelte KulturschalenSigma-AldrichCLS430589Suspensionskultur
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Wird für eine Vielzahl von Zellkulturwaschungen
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplementverwendet Thermo Fisher Scientific10565018Astrozytendifferenzierung basal Medium
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs
Essential 8 BasalmediumThermo Fisher ScientificA1516901Basalmedium für iPSC-Kultur
Essential 8 Supplement (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement für iPSC-Kultur
EGF Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0314Supplement für NSC-Kultur
FGF-basic (AA 10– 155) Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Ergänzung für NSC-Kultur
Fötales RinderserumSigma-Aldrich12103CMittlerer Inhaltsstoff
FGF-basicPeproTech100-18BAstrozytendifferenzierungsmedium Zutat
FCCPAbcamab120081Eliminiert das mitochondriale Membranpotenzial und die TMRE-Färbung
Flüssigkeitsabsaugsystem BVC-SteuerungVacuubrand, Deutschland
Formaldehyd (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Zellfixierung
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Wird zur Bindung und Aufrechterhaltung von humanen iPSCs verwendet
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement für NSC-Kultur
GDNFPeprotech450-10DA Neuronen Medium Inhaltsstoff Glycin
Sigma-AldrichG8898Wird zum Blockieren von Puffer
verwendet Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31765027Basalmedium für CDM
Heregulin Beta-1 MenschSigma-AldrichSRP3055Astrozyten Differenzierungsmedium Zutat
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Färben Sie die Zellkerne für konfokale Bilder
Heracell 150i CO2-InkubatorenFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basalmedium für CDM
InsulinRoche1376497CDM-Inhaltsstoff
InSolution AMPK-InhibitorSigma-Aldrich171261Bestandteil des neuronalen Induktionsmediums
Insulin-like Growth Factor-I humanSigma-AldrichI3769Astrozyten Differenzierungsmedium Inhaltsstoff
KnockOut DMEM/F-12 MediumThermo Fisher Scientific12660012Basalmedium für NSC-Kultur
LamininSigma-AldrichL2020Fördert die Bindung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Leica TCS SP8 STED konfokales MikroskopLeica Microsystems, Deutschland
MonothioglycerinSigma-AldrichM6145CDM Inhaltsstoff
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Verwendet für mitochondriale Volumenindikator
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Verwendet für mitochondriale ROS-Indikator
N-Acetyl-L-CysteinSigma-AldrichA7250Neural Induktionsmedium Zutat
N-2 ErgänzungThermo Fisher Scientific17502048Astrozytendifferenzierungsmedium Zutat
Normales ZiegenserumThermo Fisher ScientificPCN5000Wird zum Blockieren
Puffer Orbital Shaker verwendet - SSM1Stuart Equipment, UK
Poly-L-Ornithin-LösungSigma-AldrichP4957Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Poly-D-LysinhydrobromidSigma-AldrichP7405Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
PurmorphaminSTEMCELL Technologies72204Fördert die Differenzierung von DA-Neuronen
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36930Einbetten des Deckglases für konfokale Bilder
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Wird für eine Vielzahl von Waschvorgängen
verwendet Rekombinantes Mensch/Maus FGF-8b ProteinR& D Systems423-F8-025/CFFördert die Differenzierung von DA-Neuronen
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium Inhaltsstoff
StemPro Neural SupplementThermo Fisher ScientificA10508-01Supplement für NSCs-Kultur
TrypLE Express EnzymThermo Fisher Scientific12604013Zelldissoziationsreagenz
TransferrinRoche652202CDM-Wirkstoff
TRITON X-100VWR International9002-93-1Zur Permeabilisierung von Zellen in Immunfärbeassays
TMREAbcamab113852Zur Färbung des Potenzials der Mitochondrienmembran
Wasserbad Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
von

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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