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Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Abstract

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Mitochondrien sind wichtig für die Pathophysiologie vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Änderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), der mitochondrialen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig Merkmale dieser Prozesse. Dieser Bericht beschreibt einen neuartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleiteter Neural- und Gliazellen. Diese flussbasierte Strategie verwendet lebende Zellen zur Messung des mitochondrialen Volumens, des MMP- und ROS-Spiegels sowie fixierte Zellen zur Schätzung von Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und mtDNA-assoziierte Proteine wie den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM).

Durch Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, einschließlich MitoTracker Green (MTG), Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) und MitoSox Red, können Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des MMP und der mitochondrialen ROS quantifiziert und mit dem mitochondrialen Inhalt in Beziehung gesetzt werden. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20 (TOMM20) ermöglicht die Beurteilung der MRC-Untereinheitsexpression. Da die Menge an TFAM proportional zur mtDNA-Kopienzahl ist, ergibt die Messung von TFAM pro TOMM20 eine indirekte Messung der mtDNA pro mitochondrialem Volumen. Das gesamte Protokoll kann innerhalb von 2-3 h durchgeführt werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle die Messung mitochondrialer Parameter sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.

Introduction

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Mitochondrien sind essentielle Organellen, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Mitochondrien sind für die Energieversorgung verantwortlich, indem sie Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung produzieren und als metabolische Vermittler für Biosynthese und Stoffwechsel fungieren. Mitochondrien sind tief an vielen anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie ROS-Generierung, Zelltod und intrazellulärer Ca2+-Regulation. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Huntington-Krankheit (HD), Fri....

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Protocol

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HINWEIS: In der Materialtabelle und der Zusatztabelle S1 finden Sie Rezepturen aller in diesem Protokoll verwendeten Medien und Lösungen.

1. Differenzierung humaner iPS-Zellen in NCSs, dopaminerge (DA) Neuronen und Astrozyten

  1. Matrixbeschichtete Platten vorbereiten.
    1. Eine Durchstechflasche mit 5 ml Matrix über Nacht auf Eis auftauen. Verdünnen Sie 1 ml Matrix mit 99 ml kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% Endkonzentration). Stellen Sie 1 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
    2. Die Matrixlösung bei 4 °C auftauen ....

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Results

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Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode und der durchflusszytometrischen Strategien ist in Abbildung 3 dargestellt. Humane iPS-Zellen werden in neuronale Rosetten differenziert und dann zur Differenzierung in neuronale Sphären in die Suspensionskultur gehoben. Neuronale Sphären werden weiter differenziert und zu DA-Neuronen gereift. Neuronale Kugeln werden in einzelne Zellen dissoziiert, um gliale Astrozyten zu erzeugen, die in Monoschichten als NSCs umplattiert und dann i.......

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Discussion

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Hierin befinden sich Protokolle zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten und zur Bewertung mehrerer Aspekte der mitochondrialen Funktion mittels Durchflusszytometrie. Diese Protokolle ermöglichen eine effiziente Umwandlung menschlicher iPS-Zellen in Neuronen und Glia-Astrozyten und die detaillierte Charakterisierung der mitochondrialen Funktion, hauptsächlich in lebenden Zellen. Die Protokolle bieten auch eine auf der Durchflusszytometrie basierende Strategie zur Erfassung und Analyse mehrerer mitochon.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgements

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Wir danken dem Molecular Imaging Centre und der Flow Cytometry Core Facility an der Universität Bergen in Norwegen. Diese Arbeit wurde durch Mittel des Norwegian Research Council (Förderkennzeichen: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat und des China Scholarship Council (Projektnummer: 201906220275) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primärer Antikörper; verwendbar als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Primärer Antikörper; verwenden als 1:50, 20 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 594 Anti-Hühner-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) als Sekundärantikörper.
Anti-S100Β   konjugiert mit Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primärer Antikörper; verwenden als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 594 Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005) als Sekundärantikörper.
anti-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949Primärer Antikörper; verwendbar als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Primärer Antikörper; verwenden als 1:100, 10 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 594 Anti-Hühner-IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042) als Sekundärantikörper.
anti-TFAM, konjugiert mit Alexa Fluor 488Abcamab198308Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; monoklonales IgG2b -Maus verwenden; Alexa Fluor® 488 als Isotyp-Kontrolle.
anti-TOMM20 konjugiert mit Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Primärer Antikörper; verwenden als 1:400, 2,5 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; monoklonales IgG2a -Maus verwenden; Alexa Fluor® 488 als Isotyp-Kontrolle.
anti-NDUFB10Abcamab196019Primärer Antikörper; verwendbar als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
anti-SDHAAbcamab137040Primärer Antikörper; verwendbar als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung;   Alexa Fluor verwenden ® 488 Anti-Kaninchen für Ziegen IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) als Sekundärantikörper; monoklonales Kaninchen-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primärer Antikörper; verwenden als 1:1000, 1 μ L in 1000 μ L-Färbelösung; verwenden  Alexa Fluor ® 488 Ziegen Anti-Maus IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) als Sekundärantikörper; monoklonales Maus-IgG als Isotypkontrolle verwenden.
Activin APeproTech120-14EAstrozyten-Differenzierungsmedium Inhaltsstoff
ABM BasalmediumLonzaCC-3187Basalmedium für Astrozytenkultur
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Nahrungsergänzungsmittel für Astrozytenkultur
Antibiotisch-AntimykotischThermo Fisher Scientific15240062CDM Inhaltsstoff
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Basalmedium für verdünntes Geltrex
Rinderserum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Blockierungsmittel zur Verhinderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern in Immunfärbeassays und CDM-Wirkstoff
BDNFPeproTech450-02DA Neuronen mittlerer Inhaltsstoff
B-27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044Wirkstoff für Astrozytendifferenzierungsmedium
BD Accuri C6 Plus DurchflusszytometerBD Biosciences, USA
Chemisch definiertes LipidkonzentratThermo Fisher Scientific11905031CDM-Inhaltsstoff
Kollagenase IVThermo Fisher Scientific17104019Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs
CCD-Mikroskop Kamera Leica DFC3000 GLeica Mikrosysteme, Deutschland
Corning unbehandelte KulturschalenSigma-AldrichCLS430589Suspensionskultur
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Wird für eine Vielzahl von Zellkulturwaschungen
DMEM/F-12, GlutaMAX Supplementverwendet Thermo Fisher Scientific10565018Astrozytendifferenzierung basal Medium
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagenz für die schonende Dissoziation humaner iPSCs
Essential 8 BasalmediumThermo Fisher ScientificA1516901Basalmedium für iPSC-Kultur
Essential 8 Supplement (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement für iPSC-Kultur
EGF Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0314Supplement für NSC-Kultur
FGF-basic (AA 10– 155) Rekombinantes humanes ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Ergänzung für NSC-Kultur
Fötales RinderserumSigma-Aldrich12103CMittlerer Inhaltsstoff
FGF-basicPeproTech100-18BAstrozytendifferenzierungsmedium Zutat
FCCPAbcamab120081Eliminiert das mitochondriale Membranpotenzial und die TMRE-Färbung
Flüssigkeitsabsaugsystem BVC-SteuerungVacuubrand, Deutschland
Formaldehyd (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Zellfixierung
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Wird zur Bindung und Aufrechterhaltung von humanen iPSCs verwendet
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement für NSC-Kultur
GDNFPeprotech450-10DA Neuronen Medium Inhaltsstoff Glycin
Sigma-AldrichG8898Wird zum Blockieren von Puffer
verwendet Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31765027Basalmedium für CDM
Heregulin Beta-1 MenschSigma-AldrichSRP3055Astrozyten Differenzierungsmedium Zutat
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Färben Sie die Zellkerne für konfokale Bilder
Heracell 150i CO2-InkubatorenFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basalmedium für CDM
InsulinRoche1376497CDM-Inhaltsstoff
InSolution AMPK-InhibitorSigma-Aldrich171261Bestandteil des neuronalen Induktionsmediums
Insulin-like Growth Factor-I humanSigma-AldrichI3769Astrozyten Differenzierungsmedium Inhaltsstoff
KnockOut DMEM/F-12 MediumThermo Fisher Scientific12660012Basalmedium für NSC-Kultur
LamininSigma-AldrichL2020Fördert die Bindung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Leica TCS SP8 STED konfokales MikroskopLeica Microsystems, Deutschland
MonothioglycerinSigma-AldrichM6145CDM Inhaltsstoff
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Verwendet für mitochondriale Volumenindikator
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Verwendet für mitochondriale ROS-Indikator
N-Acetyl-L-CysteinSigma-AldrichA7250Neural Induktionsmedium Zutat
N-2 ErgänzungThermo Fisher Scientific17502048Astrozytendifferenzierungsmedium Zutat
Normales ZiegenserumThermo Fisher ScientificPCN5000Wird zum Blockieren
Puffer Orbital Shaker verwendet - SSM1Stuart Equipment, UK
Poly-L-Ornithin-LösungSigma-AldrichP4957Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
Poly-D-LysinhydrobromidSigma-AldrichP7405Fördert die Anheftung und das Wachstum von Nervenzellen in vitro
PurmorphaminSTEMCELL Technologies72204Fördert die Differenzierung von DA-Neuronen
ProLong Gold Antifade EindeckmittelThermo Fisher ScientificP36930Einbetten des Deckglases für konfokale Bilder
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Wird für eine Vielzahl von Waschvorgängen
verwendet Rekombinantes Mensch/Maus FGF-8b ProteinR& D Systems423-F8-025/CFFördert die Differenzierung von DA-Neuronen
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium Inhaltsstoff
StemPro Neural SupplementThermo Fisher ScientificA10508-01Supplement für NSCs-Kultur
TrypLE Express EnzymThermo Fisher Scientific12604013Zelldissoziationsreagenz
TransferrinRoche652202CDM-Wirkstoff
TRITON X-100VWR International9002-93-1Zur Permeabilisierung von Zellen in Immunfärbeassays
TMREAbcamab113852Zur Färbung des Potenzials der Mitochondrienmembran
Wasserbad Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
von

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al.

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