Zellmembranaffinitätschromatographiesäulen zur Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit dem immobilisierten Tropomyosinkinase-Rezeptor B interagieren

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt die Herstellung von CMAC-Säulen (Cell Membrane Affinity Chromatography) mit immobilisierten Zellmembranfragmenten, die funktionelle Transmembran-Tropomyosin-Kinase-Rezeptor-B-Proteine enthalten. Die Verwendung von CMAC-Säulen bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten, die mit diesen Rezeptoren interagieren und in komplexen natürlichen Mischungen vorhanden sind, wird ebenfalls erläutert.

Zusammenfassung

Chemikalien, die von Pflanzen, Pilzen, Bakterien und wirbellosen Meerestieren synthetisiert werden, waren eine reiche Quelle für neue Drogen und Blei. Medikamente wie Statine, Penicillin, Paclitaxel, Rapamycin oder Artemisinin, die üblicherweise in der medizinischen Praxis verwendet werden, wurden zuerst identifiziert und aus Naturprodukten isoliert. Die Identifizierung und Isolierung von biologisch aktiven spezialisierten Metaboliten aus natürlichen Quellen ist jedoch ein herausfordernder und zeitaufwendiger Prozess. Traditionell werden einzelne Metaboliten nach der Extraktion von Biomasse aus komplexen Gemischen isoliert und gereinigt. Anschließend werden die isolierten Moleküle in funktionellen Assays getestet, um ihre biologische Aktivität zu überprüfen. Hier stellen wir die Verwendung von CMAC-Säulen (Cellular Membrane Affinity Chromatography) vor, um biologisch aktive Verbindungen direkt aus komplexen Gemischen zu identifizieren. CMAC-Säulen ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, die mit immobilisierten funktionellen Transmembranproteinen (TMPs) interagieren, die in ihre native Phospholipid-Doppelschichtumgebung eingebettet sind. Dies ist ein gezielter Ansatz, der voraussetzt, den TMP zu kennen, dessen Aktivität man mit dem neu identifizierten niedermolekularen Wirkstoffkandidaten modulieren will. In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz zur Herstellung von CMAC-Säulen mit immobilisiertem Tropomyosin-Kinase-Rezeptor B (TrkB) vor, der sich zu einem brauchbaren Ziel für die Wirkstoffforschung bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems entwickelt hat. In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Montage der CMAC-Säule mit immobilisierten TrkB-Rezeptoren unter Verwendung von Neuroblastom-Zelllinien zur Überexpression von TrkB-Rezeptoren vor. Wir stellen ferner den Ansatz vor, die Funktionalität der Säule und ihre Verwendung bei der Identifizierung spezialisierter Pflanzenmetaboliten zu untersuchen, die mit TrkB-Rezeptoren interagieren.

Einleitung

Botanische Mischungen sind reich an pharmakologisch aktiven Verbindungen¹ und dienen als gute Quelle für die Identifizierung neuer Arzneimittel-Hits und -Leads 2,3,4,5. Die Entdeckung neuer Medikamente aus Naturprodukten war ein fruchtbarer Ansatz, und viele derzeit zugelassene Medikamente stammen aus Verbindungen, die zuerst in der Natur identifiziert wurden. Die chemische Vielfalt von Naturstoffen ist schwer von künstlichen Bibliotheken chemisch synthetisierter Moleküle zu erreichen. Viele natürliche Verbindungen in....

Protokoll

1. Zellkultur von SH-SY5Y-Neuroblastomzellen (TrkB- und TrkB-NULL-Zelllinien (parentale) Zelllinien)

HINWEIS: Zelllinien (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) und SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))^{49,50 wurden} von Kerafast gekauft. Kultivierte Zellen werden als Quelle der Transmembranrezeptoren verwendet, die für die Herstellung von CMAC-Säulen immobilisiert werden sollen. In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie Zellmembranfragmente erhalten und funktionale CMAC-Säulen zusammengesetzt werden.

1. Züchten Sie die Zellen in einem Zellkulturmedium, das dur....

Ergebnisse

Nach dem Protokoll wurden zwei CMAC-chromatographische Säulen zusammengesetzt: eine mit den immobilisierten SH-SY5Y-Neuroblastom-Zellmembranfragmenten mit überexprimiertem TrkB und eine mit SH-SY5Y TrkB-NULL-Zellmembranfragmenten. Die korrekt montierte CMAC-Säule ist in Abbildung 1 dargestellt, und die Schritte zur Immobilisierung von Zellmembranfragmenten sind in Abbildung 2 dargestellt.

Seit der Immobilisierung von TrkB-Rezeptoren a.......

Diskussion

Die Identifizierung von Wirkstoffen, die in komplexen Mischungen spezialisierter Metaboliten vorhanden sind, ist eine sehr anspruchsvolle Aufgabe²³. Traditionell werden einzelne Verbindungen isoliert und ihre Aktivität in verschiedenen Assays getestet. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig und kostspielig und führt häufig zur Isolierung und Identifizierung der am häufigsten vorkommenden und gut charakterisierten Verbindungen²³. Die derzeit verwendeten Hochdurchsatz-Screening-Assa.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
7-8 Dihydroxyflavon-Hydrat	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥ 98% (HPLC)
Adenosin-5'-triphosphat (ATP)-Dinatriumsalzhydrat	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammoniumacetat	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF-Antikörper	Invitrogen	PA5-15198-400 μ L	Primärer Antikörper; Konzentration von 2 mg/ml
Benzamidinhydrochloridhydrat	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Neurotropher Faktor (BDNF) aus dem Gehirn humaner	Sigma-Aldrich	B3795-10 μ g	Rekombinant, exprimiert in E. coli, lyophilisiertes Pulver, geeignet für Zellkulturen
Calciumchlorid	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholsäure-Natriumsalz	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce Homogenisator	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (Gesamtlänge), 32 x 140 mm (AD x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterilfiltriert, geeignet für Zellkultur
G418 Disulfatsalzlösung	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0,1 μ m filtriert, geeignet für Zellkultur
Glycerin	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilisierte künstliche Membran (IAM. PC. DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon C2 DUVb	Nikon		Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop
Normales Ziegenserum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Kaliumchlorid	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Proteasehemmer-Cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomik-Qualität, enthält 50 mM AEBSF, 30 & Mikro; M Aprotonin, 1 mM Bestatin, 1 mM E-64 und 1 mM Leupeptin
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	mit L-Glutamin und Natriumbicarbonat, flüssig, steril gefiltert, geeignet für Zellkultur
Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastom-Zelllinien, die Trk-B	Kerafast	ECP007
exprimierenSH-SY5Y Trk-NULL Zelllinie	Kerafast	ECP005
Schlangenhaut-Dialyseschlauch	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm trockener Innendurchmesser
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002
Natriumchlorid	BDH VWR Analytical	BDH9286-2,5 kg
Tricorn 5/20 Säule	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA-Lösung	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0,25%, sterilfiltriert, für Zellkulturen geeignet, 2,5 g Schweinetrypsin und 0,2  g EDTA