Dieses Protokoll beschreibt die Dynamik von Virusinfektionen unter Verwendung von Luciferase- und Fluoreszenz-exprimierenden rekombinanten (r)SARS-CoV-2 und einem in vivo Bildgebungssystem (IVIS) in transgenen K18 hACE2-Mäusen, um den Bedarf an sekundären Ansätzen zu überwinden, die zur Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo erforderlich sind.
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Methodenartikel
Live-Bildgebung und Quantifizierung von Virusinfektionen in transgenen K18-hACE2-Mäusen mit Reporter-exprimierendem rekombinantem SARS-CoV-2
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) Pandemie wurde durch das schwere akute Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht. Bis heute war SARS-CoV-2 weltweit für über 242 Millionen Infektionen und mehr als 4,9 Millionen Todesfälle verantwortlich. Ähnlich wie bei anderen Viren erfordert die Untersuchung von SARS-CoV-2 die Verwendung experimenteller Methoden, um das Vorhandensein von Viren in infizierten Zellen und / oder in Tiermodellen nachzuweisen. Um diese Einschränkung zu überwinden, haben wir replikationskompetente rekombinante (r)SARS-CoV-2 erzeugt, die biolumineszierende (Nanoluciferase, Nluc) oder fluoreszierende (Venus) Proteine exprimiert. Diese Reporter-exprimierenden rSARS-CoV-2 ermöglichen die Verfolgung von Virusinfektionen in vitro und in vivo basierend auf der Expression von Nluc- und Venus-Reportergenen. Hier beschreibt die Studie die Verwendung von rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zum Nachweis und zur Verfolgung einer SARS-CoV-2-Infektion im zuvor beschriebenen transgenen K18-Modell der Infektion mit humanem Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) unter Verwendung von In-vivo-Bildgebungssystemen (IVIS). Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus zeigen rSARS-CoV-2/WT-ähnliche Pathogenität und virale Replikation in vivo. Wichtig ist, dass die Nluc- und Venusexpression es uns ermöglicht, Virusinfektionen in vivo und ex vivo bei infizierten Mäusen direkt zu verfolgen. Diese rSARS-CoV-2/Nluc und rSARS-CoV-2/Venus stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Biologie von SARS-CoV-2 in vivo zu untersuchen, Virusinfektionen und assoziierte COVID-19-Erkrankungen zu verstehen und wirksame prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen zur Bekämpfung der SARS-CoV-2-Infektion zu identifizieren.
Einleitung
Das Severe Acute RespiratorySyndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist ein umhülltes, positiv-sense, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Betacoronavirus-Linie in der Familie der Coronaviridae 1 gehört. Diese virale Familie ist in Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronavirus1 unterteilt. Alpha- und Betacoronaviren infizieren hauptsächlich Säugetiere, während Gamma- und Deltacoronaviren fast ausschließlich Vögel infizieren2. Bisher haben sieben Coronaviren (CoV) Artenbarrieren überschritten und sind als humane Coronaviren (HCoV) entstanden: zwei Alpha-CoVs (HCoV-229E und HCoV-NL63) und fünf Bet....
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Protokoll
Protokolle mit transgenen K18-hACE2-Mäusen wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) des Texas Biomedical Research Institute (TBRI) und dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Experimente folgen den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren des Nationalen Forschungsrats40. Bei der Arbeit mit Mäusen ist die entsprechende persönliche Schutzausrüstung (PSA) erforderlich.
1. Verwendung von transgenen K18 hACE2-Mäusen
- Kaufen und pflegen Sie 4-6 Wochen alte weibliche B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J-Mäuse (K18 hACE2 transgene Mäu....
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Ergebnisse
rSARS-CoV-2/Nluc-Infektion in transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abbildungen 1 und 2)
Abbildung 1A zeigt eine schematische Darstellung des rSARS-CoV-2/WT (oben) und rSARS-CoV-2/Nluc (unten), das zur Beurteilung von Infektionen in vivo verwendet wird. Abbildung 1B zeigt das schematische Flussdiagramm, das zur Bewertung der rSARS-CoV-2/Nluc-Infektionsdynamik in transgenen K18-hACE2-Mäusen angewe.......
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Diskussion
Dieses Protokoll demonstriert die Machbarkeit der Verwendung dieser rSARS-CoV-2-exprimierenden Reportergene zur Überwachung von Virusinfektionen in vivo. Beide Reporter-exprimierenden rekombinanten Viren bieten ein hervorragendes Werkzeug für die Untersuchung von SARS-CoV-2-Infektionen in vivo. Die beschriebenen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) und in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) Bildgebungssysteme stellen eine ausgezeichnete Option dar, um die Dynamik der SARS-CoV-2-Infektion, der viralen Patho.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen, finanziellen und nicht-finanziellen oder persönlichen Interessenkonflikten in Bezug auf die beschriebene Arbeit durchgeführt wurde.
Danksagungen
Wir möchten den Mitgliedern unseres Instituts (Texas Biomedical Research Institute) für ihre Bemühungen danken, unsere Einrichtungen während der COVID-19-Pandemie voll funktionsfähig und sicher zu halten. Wir möchten uns auch bei unserem Institutional Biosafety Committee (IBC) und Spell (IACUC) für die zeiteffiziente Überprüfung unserer Protokolle bedanken. Wir danken Dr. Thomas Moran von der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für die Bereitstellung des monoklonalen SARS-CoV-Kreuzreaktiv-1C7C7-Nukleokapsids (N)-Protein-Antikörpers. Die SARS-CoV-2-Forschung im Martinez-Sobrido-Labor wird derzeit durch die NIAID/NIH-Zuschüsse RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 und R4....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,5 % Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Bei Raumtemperatur lagern (RT) |
| 1 % DEAE-Dextran | MP Biomedicals | 195133 | |
| 10 % Formalinlösung, neutral gepuffert | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Agar | Oxoid | LP0028 | |
| 24-Well-Zellkulturplatte | Greiner Bio-one | 662160 | |
| 5% Natriumbicarbonat | Sigma Aldrich | S-5761 | |
| 6-Well-Zellkulturplatte | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 96-Well-Zellkulturplatte | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Epithelzellen der afrikanischen grünen Affenniere (Vero E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Ami HT | Spectral Instruments Imaging | ||
| Aura Imaging Software 3.2.0 | Spectral Instruments Imaging | Bildanalyse-Software | |
| Rinderserumalbumin (BSA), 35% | Sigma-Aldrich | A9647 | Lagern bei 4 ° C |
| Wasser in Zellkulturqualität | Corning | 25-055-CV | |
| Dulbecco' s modifizierter Eagle" s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Bei 4 > lagern; C |
| Anästhesiegasgerät | Veterinäranästhesiesysteme, Inc. | VAS 2001R | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Bei -20 ° lagern; C |
| Vier bis sechs Wochen alte weibliche transgene K18-hACE2-Mäuse | The Jackson Laboratory | 34860 | |
| Graphpad Prism Version 9.1.0 | GraphPad | ||
| Isofluran | Baxter | 1001936040 | Store at RT |
| MARS Data Analysis Software | BMG LABTECH | ||
| MB10 Tabletten | QUIP Laboratories | MBTAB1.5 | Store at RT |
| Nano-Glo Luciferase Assay Reagenz | Promega | N1110 | Dieses Reagenz wird zur Messung der Nluc-Aktivität verwendet. Bei -20 Grad lagern; C |
| Nunc MicroWell 96-Well-Mikrotiterplatten | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Nunc MicroWell 96-Well-Mikrotiterplatten | ThermoFisher Scientific | 269620 | |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamin (PSG) 100x | Corning | 30-009-CI | Bei -20 & Grad lagern; C |
| PHERAstar FSX | BMG LABTECH | PHERAstar FSX | |
| Precelleys Evolution Homogenisator | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| Weichgewebe-Homogenisierung CK14 – 7 mL | Bertin Instruments | P000940-LYSK0-A | |
| T75 EasYFlask | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase | Vector Laboratories | PK-4002 ABC-Kit | und DAB-Peroxidase-Substrat-Kit |
Referenzen
- V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
- Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome cor....
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Nachdrucke und Genehmigungen
