Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Summary

Wir stellen eine Technologie vor, die kapillaritätsunterstützte Montage in einer mikrofluidischen Plattform verwendet, um in einer Flüssigkeit suspendierte Objekte in Mikrogröße, wie Bakterien und Kolloide, in vorgeschriebene Arrays auf einem Polydimethylsiloxansubstrat zu strukturieren.

Abstract

Die kontrollierte Strukturierung von Mikroorganismen in definierte räumliche Anordnungen bietet einzigartige Möglichkeiten für ein breites Spektrum biologischer Anwendungen, einschließlich Studien der mikrobiellen Physiologie und Interaktionen. Auf der einfachsten Ebene würde eine genaue räumliche Strukturierung von Mikroorganismen eine zuverlässige, langfristige Bildgebung einer großen Anzahl einzelner Zellen ermöglichen und die Fähigkeit zur quantitativen Untersuchung von entfernungsabhängigen Mikroben-Mikroben-Interaktionen verändern. Noch einzigartiger ist, dass die Kopplung genauer räumlicher Musterung und voller Kontrolle über Umweltbedingungen, wie sie die mikrofluidische Technologie bietet, eine leistungsstarke und vielseitige Plattform für Einzelzellstudien in der mikrobiellen Ökologie bieten würde.

Dieser Beitrag stellt eine mikrofluidische Plattform vor, um vielseitige und benutzerdefinierte Muster von Mikroorganismen innerhalb eines mikrofluidischen Kanals zu erzeugen, die einen vollständigen optischen Zugriff für eine langfristige Überwachung mit hohem Durchsatz ermöglichen. Diese neue mikrofluidische Technologie basiert auf einer kapillaritätsunterstützten Partikelanordnung und nutzt die Kapillarkräfte, die sich aus der kontrollierten Bewegung einer verdampfenden Suspension in einem mikrofluidischen Kanal ergeben, um einzelne mikroskalierte Objekte in einer Reihe von Fallen abzuscheiden, die mikrofabriziert auf einem Polydimethylsiloxan (PDMS) -Substrat liegen. Sequenzielle Ablagerungen erzeugen das gewünschte räumliche Layout einzelner oder mehrerer Arten von Objekten in Mikrogröße, die ausschließlich durch die Geometrie der Fallen und die Füllreihenfolge bestimmt werden.

Die Plattform wurde mit kolloidalen Partikeln unterschiedlicher Größe und Materialien kalibriert: Sie hat sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um verschiedene kolloidale Muster zu erzeugen und eine Oberflächenfunktionalisierung von eingeschlossenen Partikeln durchzuführen. Darüber hinaus wurde die Plattform an mikrobiellen Zellen getestet, wobei Escherichia coli-Zellen als Modellbakterium verwendet wurden. Tausende von einzelnen Zellen waren auf der Oberfläche strukturiert und ihr Wachstum wurde im Laufe der Zeit überwacht. In dieser Plattform ermöglicht die Kopplung von Einzelzellabscheidung und mikrofluidischer Technologie sowohl die geometrische Strukturierung von Mikroorganismen als auch die präzise Kontrolle der Umgebungsbedingungen. Es öffnet sich damit ein Fenster in die Physiologie einzelner Mikroben und die Ökologie von Mikroben-Mikroben-Interaktionen, wie vorexperimentelle Experimente gezeigt haben.

Introduction

Die räumliche Strukturierung einzelner Mikroorganismen, insbesondere in experimentellen Arenen, die die volle Kontrolle über Umweltbedingungen ermöglichen, wie z. B. mikrofluidische Geräte, ist in einer Vielzahl von Kontexten sehr wünschenswert. Zum Beispiel würde die Anordnung von Mikroorganismen in regulären Arrays die genaue Abbildung einer großen Anzahl einzelner Zellen und die Untersuchung ihres Wachstums, ihrer Physiologie, ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und ihrer Arzneimittelempfindlichkeit ermöglichen. Es würde auch die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen von besonderem Interesse für die Erforschung der zellulären Kommunikation (z. B. Quorum-Sensing), der Kreuzfütterung (z. B. Algen-Bakterien-Symbiose) oder des Antagonismus (z. B. Allelopathie) mit voller Kontrolle über die räumliche Lokalisierung von Zellen relativ zueinander ermöglichen. Zellphysiologische und ^{Evolutionsstudien1}, Zell-Zell-Interaktionsstudien2, phänotypisches Differenzierungsscreening3, Umweltmonitoring4 und Arzneimittelscreening5 gehören zu den Bereichen, die von einer Technologie, die in der Lage ist, eine solche quantitative Einzelzellanalyse zu erreichen, stark profitieren können.

In den letzten Jahren wurden mehrere Strategien zur Isolierung und Handhabung einzelner Zellen vorgeschlagen, von holographischen optischen ^Fallen6 und heterogenen Oberflächenfunktionalisierungsmethoden7,8,9,10 bis hin zu einzelligen Chemostaten11 und Tröpfchenmikrofluidik12. Diese Methoden sind entweder technisch sehr anspruchsvoll oder beeinflussen die Zellphysiologie und bieten keine Hochdurchsatzplattform, um Mikroben zu mustern, die über lange Zeiträume untersucht werden können, um eine Einzelzellauflösung, einen vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen zu gewährleisten. Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Plattform zu beschreiben, um Bakterien mit mikrometrischer Präzision in vorgeschriebene räumliche Anordnungen auf einer PDMS-Oberfläche durch kapillaritätsunterstützte Montage zu strukturieren. Diese Plattform ermöglicht eine präzise und flexible räumliche Strukturierung von Mikroben und ermöglicht dank ihrer mikrofluidischen Natur den vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen.

Die Technologie hinter dieser Plattform ist eine in den letzten Jahren entwickelte Montagetechnologie namens sCAPA13,14,15 (sequential capillarity-assisted particle assembly), die in eine mikrofluidische ^Plattform16 integriert wurde. Der Meniskus eines verdampfenden Flüssigkeitströpfchens, während er sich über ein gemustertes Polydimethylsiloxan (PDMS) -Substrat in einem mikrofluidischen Kanal zurückzieht, übt Kapillarkräfte aus, die die einzelnen in der Flüssigkeit suspendierten kolloidalen Partikel in mikrometrischen Vertiefungen einfangen, die auf dem Substrat mikrofabriziert sind (Abbildung 1A). Schwebstoffe werden zunächst durch konvektive Ströme an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche transportiert und dann kapillar in die Fallen gelegt. Kapillarkräfte, die vom sich bewegenden Meniskus ausgeübt werden, wirken im Vergleich zu Kräften, die an Teilchenwechselwirkungen beteiligt sind, in größerem Maßstab.

Somit wird der Montagemechanismus nicht durch das Material, die Abmessungen und die Oberflächeneigenschaften der Partikel beeinflusst. Parameter wie Partikelkonzentration, Die Geschwindigkeit des Meniskus, Temperatur und Oberflächenspannung der Suspension sind die einzigen Parameter, die die Ausbeute des Strukturierungsprozesses beeinflussen. Eine detaillierte Beschreibung des Einflusses der vorgenannten Parameter auf den Musterungsprozess findet der Leser in13,14,15. In der ursprünglichen sCAPA-Technologie13,14,15 wurde der kolloidale Strukturierungsprozess in einem offenen System durchgeführt und erforderte eine hochpräzise piezoelektrische Stufe, um die Aufhängung über die Schablone anzutreiben. Diese Plattform nutzt eine andere Strategie und ermöglicht es, die Musterung mit Standardgeräten durchzuführen, die üblicherweise in der Mikrofluidik in einer kontrollierten Umgebung verwendet werden, wodurch das Risiko einer Kontamination der Proben minimiert wird.

Diese mikrofluidische Plattform wurde zunächst auf kolloidale Partikel optimiert, um regelmäßige Arrays inerter Partikel zu erzeugen, und dann erfolgreich auf Bakterien angewendet. Beide mikrofluidischen Plattformen werden in diesem Paper beschrieben (Abbildung 1B,C). Die meisten vorbereitenden Schritte und die im Protokoll beschriebene Versuchsausrüstung sind für die beiden Anwendungen üblich (Abbildung 2). Wir berichten über kolloidale Muster, um zu zeigen, dass die Technik verwendet werden kann, um mehrere sequentielle Abscheidungen auf derselben Oberfläche durchzuführen, um komplexe, multimaterialartige Muster zu erzeugen. Insbesondere wurde pro Trap für jeden Schritt ein einzelnes Partikel abgeschieden, um kolloidale Arrays mit einer spezifischen Geometrie und Zusammensetzung zu bilden, die ausschließlich von der Geometrie und der Füllreihenfolge der Traps bestimmt wurden. Was die bakterielle Musterung betrifft, so werden einzelne Ablagerungen beschrieben, was dazu führt, dass sich pro Falle ein Bakterium ablagert. Sobald die Zellen auf der Oberfläche strukturiert sind, wird der mikrofluidische Kanal mit Medium gespült, um das Bakterienwachstum zu fördern, der erste Schritt jeder Einzelzellstudie.

Protocol

1. Vorbereitung auf Silikon-Master

HINWEIS: Die PDMS-Schablonen mit den mikrofabrizierten Fallen, die die Schablone für die kolloidale und mikrobielle Musterung bilden, wurden nach der von Geissler et al. eingeführten Methode hergestellt. ¹⁷. Auflage. Der Siliziummaster wurde durch konventionelle Lithographie in einem Reinraum hergestellt. In den folgenden Schritten finden Sie das Verfahren und die Materialtabelle für die Ausrüstung.

1. Entwerfen Sie die Funktionen mit CAD-Software (Computer Aided Design).
2. Bereiten Sie die Chromglasmaske mit einer Schicht aus positivem Fotolack vor, indem Sie die entworfenen Merkmale mit einem UV-Direktlaserschreiber freilegen.
   1. Entwickeln Sie die Chrom-Glas-Maske mit einem Spin-Entwickler mit einem Entwickler im Verhältnis von 1:4 Fotolack zu Wasser für 15 s.
   2. Tauchen Sie die Maske für 50 s in Chromätzmittel.
   3. Plasmabehandlung eines 10 cm Siliziumwafers für 3 min bei 600 W.
   4. Eine Schicht Hexamethyldisilizan dampfen und bei 110 °C backen, um die Haftung zum Fotolack zu verbessern.
   5. Legen Sie eine Schicht Fotolack bei 4.500 × g für 2 min ab.
   6. Setzen Sie das Feature durch die Chromglasmaske mit einem Mask aligner für 2 s UV aus und entwickeln Sie mit einem Entwickler wie für die Maske.
3. Um die Herstellung des Silizium-Masters abzuschließen, ätzen Sie den Wafer über einen tiefen reaktiven Ionenaustausch und passen Sie die Ätzzeit (<2 min) an, um die gewünschte Tiefe zu erreichen (gemessen mit einem Profilometer).

2. Mikrokanal-Formvorbereitung

1. Entwerfen Sie den Kanal mit CAD-Software und schneiden Sie ihn mit einer Slicer-Software, um das entworfene Modell in Anweisungen für den 3D-Drucker umzuwandeln und den Schneideabstand auf 0,05 mm einzustellen.
2. Drucken Sie den Kanal mit einem 3D-Drucker für ~1 h.
3. Waschen und nachhärten Sie die Form in einer speziellen Aushärtungs- und Waschmaschine.
   1. Geben Sie die Form in einen mit reinem Isopropylalkohol (IPA) gefüllten Behälter und wirbeln Sie die Flüssigkeit (20 minuten waschen). Nehmen Sie den mit IPA gefüllten Behälter aus der Maschine.
   2. Sobald die gewaschene Form aus dem IPA-Behälter entnommen wurde, legen Sie sie zurück in die Wasch- und Härtungsmaschine und stellen Sie sie für 15 min bei 35 ° C nach.
      HINWEIS: Die Materialtabelle enthält den 3D-Drucker und die Aushärtungs- und Waschmaschine, die im Formvorbereitungsprotokoll verwendet werden. Das 3D-Modell wurde mit der proprietären Slicer-Software des 3D-Druckers geschnitten.
4. Legen Sie den Druck für 12 h in einen UV-Ofen und legen Sie ihn für 12 h in einen Ofen bei 80 °C.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass das gesamte Polymer ausgehärtet ist und das gesamte nicht ausgehärtete Polymer aus dem Druck entfernt wird, da pdMS nicht aushärten kann.
5. Silanisieren Sie die Form durch Dampfabscheidung von Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan.
   1. Legen Sie die 3D-Form in einen Vakuum-Exsikkator zusammen mit 20 μL 100% konzentriertem Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan, das auf einer Aluminiumfolie in der Nähe der Form pipettiert wird.
   2. Erzeugen Sie ein Vakuum im Exsikkator, um Dampf zu erzeugen, und lassen Sie es 40 Minuten stehen.
   3. Entfernen Sie die Form aus dem Exsikkator und spülen Sie sie mit reinem Ethanol ab, bevor Sie PDMS darauf gießen.

3. Herstellung des mikrofluidischen Chips

1. Bereiten Sie eine PDMS-Mischung vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Vernetzungsmittel mischen (Materialtabelle). Rühren Sie die Mischung kräftig um, um die beiden Komponenten gleichmäßig zu mischen, bis sich Luftblasen bilden und die PDMS-Mischung undurchsichtig aussieht.
   HINWEIS: Die Menge an Vernetzer sollte 10 Gew.-% der Elastomermenge betragen.
2. Entgasen Sie das Gemisch aus Elastomer und Vernetzungsmittel in einem Vakuum-Exsikkator, um die eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Das Gemisch wird im Exsikkator in den zum Mischen verwendeten Behälter überführt (Schritt 3.1). Setzen Sie den Entgasungsprozess fort, bis alle Blasen entfernt wurden und die Mischung wieder transparent aussieht.
   HINWEIS: Die für die Austrocknung typische Zeit beträgt 30 min.
3. Gießen Sie 3 g der Mischung auf den Siliziummaster, um die Schablone zu erzeugen, die als "Boden" des mikrofluidischen Chips dient.
   HINWEIS: Die Dicke der PDMS-Schicht kann durch Ändern der auf den Siliziumstamm gegossenen Mischungsmenge abgestimmt werden.
   1. Um eine 400 μm dicke Schablone zu erhalten, gießen Sie 3 g PDMS auf den Silizium-Master, legen Sie den Silizium-Master auf einen Spin-Coater und drehen Sie ihn bei 21 × g für 5 s und 54 × g für 10 s und entgasen Sie dann erneut, wie in Schritt 3.2 beschrieben, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
4. Gießen Sie 20 g der PDMS-Mischung auf die 3D-gedruckte Form, um den Mikrokanal herzustellen, der als "Dach" des mikrofluidischen Chips dient, und entgasen Sie ihn wie in Schritt 3.2 beschrieben für 30 Minuten.
5. Backen Sie sowohl den Siliziumwafer als auch die 3D-gedruckte Form bei 70 °C für mindestens 2 h.
6. Ziehen Sie die PDMS-Schicht von der 3D-gedruckten Form ab, schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrokanäle und stanzen Sie die Löcher, die als Ein- und Auslass des mikrofluidischen Kanals dienen.
7. Ziehen Sie das PDMS vom Siliziumstamm ab und schneiden Sie die PDMS-Schicht in kleinere Stücke mit den gleichen Abmessungen der mikrofluidischen Kanäle, die auf den Schablonen verklebt werden.
8. Reiben Sie die Schablonen und Mikrokanäle vorsichtig mit einer 1% igen Reinigungsmittellösung (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min und spülen Sie sie dann mit entionisiertem Wasser ab. Als nächstes spülen Sie die Schablonen und Mikrokanäle mit Isopropanol und spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab. Trocknen Sie die Schablonen und Mikrokanäle bei Raumtemperatur für 1 min mit Druckluft an 1 bar.
9. Legen Sie die Schablonen und die Mikrokanäle in einen Plasmareiniger, wobei die zu verklebenden Oberflächen nach oben zeigen. Schalten Sie den Plasmareiniger ein, und Plasma behandelt die Schablonen und die Mikrokanäle für 40 s. Nehmen Sie sie aus dem Plasmareiniger heraus und verbinden Sie die Mikrokanäle sofort auf den Schablonen, indem Sie sie miteinander in Kontakt bringen.
10. Lagern Sie die mikrofluidischen Chips fünf Tage lang in einem Ofen bei 70 °C, um eine hydrophobe PDMS-Rückgewinnung zu gewährleisten und einen Rückkontaktwinkel im optimalen Bereich zwischen 30 und 60°^10,11 zu haben.

4. Bakterielle Musterung

1. Einen Tag vor dem Experiment wächst eine Population von Escherichia coli (Stamm MG1655 prpsM-GFP). Impfen Sie die Kultur direkt aus der gefrorenen Brühe und wachsen Sie über Nacht für 20 h in Lysogenbrühe (LB) Medium in einem Shaker-Inkubator bei 37 ° C. Fügen Sie 50 μg / ml Kanamycin hinzu, damit die Zellen das prpsM-GFP-Plasmid behalten.
2. Stellen Sie am Tag des Experiments den Box-Inkubator (Abbildung 2A) mehrere Stunden vor dem Experiment auf 37 °C, um vor Beginn des Experiments eine gleichmäßige und stabile Temperatur zu haben. Stellen Sie die Spritzenpumpe und die beheizte Glasplatte auf dem Mikroskoptisch auf (Abbildung 2B,C) und stellen Sie die Temperatur auf die gleiche Temperatur wie der Box-Inkubator.
   HINWEIS: Der Box-Inkubator, in dem das gesamte System, einschließlich des Mikroskops (Abbildung 2E), eingeschlossen ist, stellt sicher, dass während des gesamten Experiments eine gleichmäßige und konstante Temperatur aufrechterhalten wird, wenn der Kanal mit Medium gespült wird.
3. Neunzig Minuten vor dem Experiment den mikrofluidischen Chip in ein mit 100% Ethanol (EtOH) gefülltes Gefäß geben und den Kanal mindestens 10 Minuten lang mit 100% EtOH spülen. Legen Sie den mikrofluidischen Chip in einen Vakuum-Exsikkator und entgasen Sie ihn für mindestens 30 min. Tauschen Sie das EtOH gegen destilliertes Wasser aus und saugen Sie den Chip mindestens 30 Minuten lang vakuumbehandelt. Stellen Sie den mikrofluidischen Chip für 10 min bei 70 °C in den Ofen, um die im Kanal verbliebenen Flüssigkeitsspuren zu entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um die Bildung von Blasen im Kanal zu verhindern, wenn er mit Kulturmedium gespült wird. Dieses Blasenpräventionsprotokoll wurde von Wang et ^al.18 übernommen.
4. 1 ml 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS)-Medium (1x) werden in eine Zentrifugenfläschchen pipettiert und 10 μL 0,132 M Kaliumphosphat (_K2HPO4) zugegeben. Nehmen Sie die Nachtkultur aus dem 37 °C Inkubator und aliquot 100 μL in die Zentrifugenfläschchen und zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.300 × g für 2 min. Den Überstand vorsichtig aus den Zentrifugenfläschchen pipettieren und das Pellet in 1 ml frischem MOPS-Medium mit 0,015% v/v Tween 20 und 0,01% v/v Kaliumphosphat resuspendieren.
   HINWEIS: Die typische Konzentration der Bakteriensuspension liegt im Bereich von 0,015-0,15 vol%, was die Bildung einer ausgedehnten und mobilen Akkumulationszone gewährleistet und die Ansammlung von Partikeln auf dem Substrat verhindert. Das Ersetzen des Übernachtmediums durch ein frisches Medium minimiert das Risiko der Freisetzung von Bakterienfilmen auf der Schablone. Der Mangel an Kohlenstoffquelle im frischen Medium verhindert, dass Zellen während der Schablonenstrukturierung in der Suspension wachsen. Eine Konzentration von 0,015% v/v von Tween 20 in der Suspension ist notwendig, damit der Kontaktwinkel der zurückweichenden Flüssigkeit auf der PDMS-Schablone in den optimalen Bereich zwischen 30 und 60° fällt.
5. Laden Sie die Bakteriensuspension in eine 1-ml-Spritze und verbinden Sie die Spritze über mikrofluidische Schläuche mit dem Chip.
   1. Um die Verbindung zwischen der Spritze und dem Schlauch zu sichern, führen Sie direkt eine Nadel mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm in den Schlauch ein. Um zu vermeiden, dass in der Einlassnähe verbleibende Suspension über den Kanal gestreut wird, spülen Sie frisches Medium durch die Bohrung, die während des Strukturierungsprozesses als Auslass verwendet wird (Abbildung 3A-III), und nicht durch die als Einlass verwendete Bohrung.
   2. Montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe und injizieren Sie die Suspension durch den Einlass am vorgeschalteten Teil des Kanals in den mikrofluidischen Chip, bis die Suspension den Schablonenbereich mit Fallen bedeckt.
      HINWEIS: Während des Flüssigkeitsinjektionsprozesses kann Luft durch einen Auslass am nachgeschalteten Ende des Kanals entweichen.
   3. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie die Bakteriensuspension (Abbildung 3A-I) mit einer Durchflussrate von 0,07-0,2 μL/min entzieht, was in der beschriebenen Geometrie einer Meniskusrücktrittsgeschwindigkeit von 80-100 μm/min entspricht.
   4. Überwachen Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware.
      HINWEIS: Hier wurde eine 10-fache Vergrößerung verwendet, um den zurückgehenden Meniskus auf der Schablone zu überwachen, und eine 20-fache Vergrößerung wurde verwendet, um die Ablagerung einzelner Bakterien in die mikrofabrizierten Fallen zu überwachen.
6. Sobald die Schablone mit Zellen strukturiert wurde (Abbildung 3A-II), erhöhen Sie die Entnahmeflussrate, um den mikrofluidischen Kanal schnell zu entleeren, und spülen Sie ihn mit frischem LB, der zuvor für mindestens 30 min entgast und bei 30 °C vorgewärmt wurde.
7. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 2 μL/min ein, um den Kanal vorsichtig zu spülen. Sobald der Kanal gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussrate (15 μL/min) entsprechend den spezifischen experimentellen Anforderungen.
8. Erfassen Sie Bilder von wachsenden Bakterien in der gewünschten Vergrößerung und im gewünschten Zeitintervall.

5. Kolloidale Musterung

1. 900 μL einer wässrigen Lösung mit 0,015 % v/v Tween 20 werden in eine Zentrifugenfläschchen pipettiert und 100 μl der ursprünglichen kolloidalen Suspension hinein pipettiert. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.500 × g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch die wässrige Tween 20-Lösung (0,015 % v/v). Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um den vollständigen Austausch des Lösungsmittels des Lieferanten aus der Lagersuspension sicherzustellen.
2. Laden Sie die kolloidale Suspension in eine 1-ml-Spritze und verbinden Sie die Spritze über mikrofluidische Schläuche mit dem Chip. Injizieren Sie die Suspension in den mikrofluidischen Chip durch den Einlass, der sich innerhalb des zentralen Abschnitts am vorgeschalteten Teil des Kanals befindet, und drücken Sie die Suspension allmählich an, bis die Schablone abgedeckt ist.
3. Ziehen Sie die kolloidale Suspension mit einer Durchflussrate von 0,07-0,2 μL/min zurück, was einer Meniskusrücktrittsgeschwindigkeit von 1-2 μm/min entspricht, und bilden Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware ab. Verwenden Sie die 10-fache Vergrößerung, um den zurückgehenden Meniskus auf der Schablone zu überwachen, und die 20-fache Vergrößerung, um die Ablagerung einzelner Partikel in die mikrofabrizierten Fallen zu beobachten. Erhöhen Sie die Durchflussrate, sobald der Meniskus das Ende der Vorlage erreicht hat, um den Kanal schnell zu leeren.
   HINWEIS: Kolloidale Arrays, die aus mehreren Partikeln bestehen, können hergestellt werden, indem der Strukturierungsprozess von den Schritten 5.1 bis 5.3 in Reihe ausgeführt wird. Der Kanal wird bei jeder Iteration entsprechend der gewünschten kolloidalen Array-Zusammensetzung mit einer neuen kolloidalen Suspension beladen. Jeder Strukturierungsschritt fügt dem kolloidalen Array ein Partikel hinzu und kann nacheinander ausgeführt werden, bis die Fallen mit der gewünschten Partikelsequenz gefüllt sind. Die Zusammensetzung der resultierenden kolloidalen Arrays ist ausschließlich durch die Sequenz der kolloidalen Suspensionen gegeben, die zum Füllen der Fallen verwendet werden (Abbildung 3B).

Results

Es wurde eine mikrofluidische Plattform entwickelt, die die kapillaritätsunterstützte Montage nutzt, um kolloidale Partikel und Bakterien zu Fallen zu strukturieren, die auf einer PDMS-Schablone mikrofabriziert sind. Zwei verschiedene Kanalgeometrien wurden entwickelt, um die Strukturierung von Kolloiden und Bakterien durch die kapillaritätsunterstützte Montage zu optimieren. Die erste Kanalgeometrie (Abbildung 1B) besteht aus drei 23 mm langen parallelen Abschnitten ohne physische Barriere ...

Discussion

Die hier beschriebene mikrofluidische Plattform ermöglicht die Strukturierung von mikrogroßen Objekten wie Kolloiden und Bakterien in vorgeschriebene räumliche Anordnungen auf einem PDMS-Substrat. Die volle Kontrolle über die Umweltbedingungen, die die Mikrofluidik bietet, und die Fähigkeit, Zellen mit mikrometrischer Präzision zu strukturieren, die durch die sCAPA-Technologie gewährleistet wird, machen es zu einer vielversprechenden Plattform für zukünftige physiologische und ökologische Studien.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcatel AMS 200SE I-Speeder	Alcatel Micro Machining System		Tiefenreaktives Ionenaustauschsystem
Alconox-Reinigungsmittel
AZ400K Entwickler	MicroChemicals	AZ400K
BD 10 mL Spritze (Luer-Lock)	BD	300912	zum Spülen von frischer Lysogen-Brühe in den mikrofluidischen Kanal
Box Inkubator	Lebensdauer Bildgebungsdienstleistungen		zur Gewährleistung einer gleichmäßigen und konstanten Temperatur im Kanal
Zentrifuge	Eppendorf	5424R	wird verwendet, um das Übernachtmedium durch frische, minimale Medien zu ersetzen
Zentrifugenfläschchen	Eppendorf	30120086	1,5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		Spritzenpumpe
Fluoreszierende PS-Partikel mit einem Durchmesser von 0,98 & Mikro; m (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi267
Fluoreszierende PS-Partikel mit einem Durchmesser von 1,08 &μ; m (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi182
Fluoreszierende PS-Partikel mit Durchmesser 2,07 & Mikro; m (green)	microParticles GmbH	PS-FluoGreen-Fi183
Fluoreszierende PS-Partikel mit Durchmesser 2,08 &; micro; m (red)	microParticles GmbH	PS-FluoRed-Fi180
Gigabatch 310 M	PVA TePla		zur Plasmabehandlung eines 10 cm Siliziumwafers
H401-T-CONTROLLER	Okolab-Controller		der beheizten Glasplatte
H601-NIKON-TS2R-GLAS	Okolab		beheizte Glasplatte
Heidelberg DWL 2000	Heidelberg Instruments		UV-Direktlaser Schriftsteller
Insulinspritzen, U 100, mit Luer	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL Spritze zur Entnahme der flüssigen Suspension während des Strukturierungsprozesses
Klayout	Opensource		zur Gestaltung der Merkmale auf dem Silikon-Master
LB Brühe, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	244610	Lysogene Bouillon, die in den mikrofluidischen Kanal gespült
wird Masterflex Transferschlauch	Masterflex	HV-06419-05	0,020'' ID, 0,06'' OD
MOPS (10x)	Teknova	M2101	zehnfach mit milliQ Wasser verdünnt und als Ersatz für das Nachtmedium
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		Mikroskop
openSCAD	Opensource		zur Gestaltung der Form
OPTIspin SB20	ATM-Gruppe	51-0002-01-00	Spin-Entwickler
Plasmakammer Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	zur Plasmabehandlung des Templates und des Mikrokanals, um sie zu verbinden
Positiver Fotolack AZ1505	Mikrochemikalien	AZ1505
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma Aldrich	P3786	zu MOPS hinzugefügt 1x
Prusa Härtungs- und Waschmaschine CW1S	Prusa		wird verwendet, um sicherzustellen, dass das gesamte Polymer ausgehärtet und das nicht ausgehärtete Polymer aus der Form entfernt wird
Prusa-Harz - Tough	Prusa Research a.s.		UV-lichtempfindliches 405 nm flüssiges Harz für den 3D-Druck
Prusa SL1 3D-Drucker	Prusa		zum Drucken der Form Skala
	VWR-CH	611-2605	zum Gewichten der PDMS-Mischung
verwendet Siliziumwafer (10 cm)	Silicon Materials Inc.		N/Phos < 100> 1-10 Ω cm
Sü ss MA6 Mask Aligner	SUSS MicroTec Group		zur Ausrichtung der Chrom-Glas-Maske und des Substrats und zur Freilegung des Substrats
Sylgard 184	Dow Corning		Silikonelastomer-Kit; Härter
Techni Etch Cr01	Technic		Chromätzmittel
Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan	Sigma Aldrich	448931	zur Silanisierung der 3D-gedruckten Form verwendet
TWEEN 20	Sigma Aldrich	P1379	wird verwendet, um einen optimalen Rückzugswinkel während des Strukturierungsprozesses zu gewährleisten
Veeco Dektak 6 M	Veeco		Profilometer
VTC-100 Vakuum-Spin-Coater	MTI Corporation		Vakuum-Spin-Coater