Strukturierung von Mikroorganismen und Mikropartikeln durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage

Die räumliche Strukturierung einzelner Mikroorganismen, insbesondere in experimentellen Arenen, die die volle Kontrolle über Umweltbedingungen ermöglichen, wie z. B. mikrofluidische Geräte, ist in einer Vielzahl von Kontexten sehr wünschenswert. Zum Beispiel würde die Anordnung von Mikroorganismen in regulären Arrays die genaue Abbildung einer großen Anzahl einzelner Zellen und die Untersuchung ihres Wachstums, ihrer Physiologie, ihrer Genexpression als Reaktion auf Umweltreize und ihrer Arzneimittelempfindlichkeit ermöglichen. Es würde auch die Untersuchung von Zell-Zell-Interaktionen von besonderem Interesse für die Erforschung der zellulären Kommunikation (z. B. Quorum-Sensing), der Kreuzfütterung (z. B. Algen-Bakterien-Symbiose) oder des Antagonismus (z. B. Allelopathie) mit voller Kontrolle über die räumliche Lokalisierung von Zellen relativ zueinander ermöglichen. Zellphysiologische und ^{Evolutionsstudien1}, Zell-Zell-Interaktionsstudien2, phänotypisches Differenzierungsscreening3, Umweltmonitoring4 und Arzneimittelscreening5 gehören zu den Bereichen, die von einer Technologie, die in der Lage ist, eine solche quantitative Einzelzellanalyse zu erreichen, stark profitieren können.

In den letzten Jahren wurden mehrere Strategien zur Isolierung und Handhabung einzelner Zellen vorgeschlagen, von holographischen optischen ^Fallen6 und heterogenen Oberflächenfunktionalisierungsmethoden7,8,9,10 bis hin zu einzelligen Chemostaten11 und Tröpfchenmikrofluidik12. Diese Methoden sind entweder technisch sehr anspruchsvoll oder beeinflussen die Zellphysiologie und bieten keine Hochdurchsatzplattform, um Mikroben zu mustern, die über lange Zeiträume untersucht werden können, um eine Einzelzellauflösung, einen vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen zu gewährleisten. Das Ziel dieses Papiers ist es, eine Plattform zu beschreiben, um Bakterien mit mikrometrischer Präzision in vorgeschriebene räumliche Anordnungen auf einer PDMS-Oberfläche durch kapillaritätsunterstützte Montage zu strukturieren. Diese Plattform ermöglicht eine präzise und flexible räumliche Strukturierung von Mikroben und ermöglicht dank ihrer mikrofluidischen Natur den vollständigen optischen Zugang und die Kontrolle über Die Umgebungsbedingungen.

Die Technologie hinter dieser Plattform ist eine in den letzten Jahren entwickelte Montagetechnologie namens sCAPA13,14,15 (sequential capillarity-assisted particle assembly), die in eine mikrofluidische ^Plattform16 integriert wurde. Der Meniskus eines verdampfenden Flüssigkeitströpfchens, während er sich über ein gemustertes Polydimethylsiloxan (PDMS) -Substrat in einem mikrofluidischen Kanal zurückzieht, übt Kapillarkräfte aus, die die einzelnen in der Flüssigkeit suspendierten kolloidalen Partikel in mikrometrischen Vertiefungen einfangen, die auf dem Substrat mikrofabriziert sind (Abbildung 1A). Schwebstoffe werden zunächst durch konvektive Ströme an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche transportiert und dann kapillar in die Fallen gelegt. Kapillarkräfte, die vom sich bewegenden Meniskus ausgeübt werden, wirken im Vergleich zu Kräften, die an Teilchenwechselwirkungen beteiligt sind, in größerem Maßstab.

Somit wird der Montagemechanismus nicht durch das Material, die Abmessungen und die Oberflächeneigenschaften der Partikel beeinflusst. Parameter wie Partikelkonzentration, Die Geschwindigkeit des Meniskus, Temperatur und Oberflächenspannung der Suspension sind die einzigen Parameter, die die Ausbeute des Strukturierungsprozesses beeinflussen. Eine detaillierte Beschreibung des Einflusses der vorgenannten Parameter auf den Musterungsprozess findet der Leser in13,14,15. In der ursprünglichen sCAPA-Technologie13,14,15 wurde der kolloidale Strukturierungsprozess in einem offenen System durchgeführt und erforderte eine hochpräzise piezoelektrische Stufe, um die Aufhängung über die Schablone anzutreiben. Diese Plattform nutzt eine andere Strategie und ermöglicht es, die Musterung mit Standardgeräten durchzuführen, die üblicherweise in der Mikrofluidik in einer kontrollierten Umgebung verwendet werden, wodurch das Risiko einer Kontamination der Proben minimiert wird.

Diese mikrofluidische Plattform wurde zunächst auf kolloidale Partikel optimiert, um regelmäßige Arrays inerter Partikel zu erzeugen, und dann erfolgreich auf Bakterien angewendet. Beide mikrofluidischen Plattformen werden in diesem Paper beschrieben (Abbildung 1B,C). Die meisten vorbereitenden Schritte und die im Protokoll beschriebene Versuchsausrüstung sind für die beiden Anwendungen üblich (Abbildung 2). Wir berichten über kolloidale Muster, um zu zeigen, dass die Technik verwendet werden kann, um mehrere sequentielle Abscheidungen auf derselben Oberfläche durchzuführen, um komplexe, multimaterialartige Muster zu erzeugen. Insbesondere wurde pro Trap für jeden Schritt ein einzelnes Partikel abgeschieden, um kolloidale Arrays mit einer spezifischen Geometrie und Zusammensetzung zu bilden, die ausschließlich von der Geometrie und der Füllreihenfolge der Traps bestimmt wurden. Was die bakterielle Musterung betrifft, so werden einzelne Ablagerungen beschrieben, was dazu führt, dass sich pro Falle ein Bakterium ablagert. Sobald die Zellen auf der Oberfläche strukturiert sind, wird der mikrofluidische Kanal mit Medium gespült, um das Bakterienwachstum zu fördern, der erste Schritt jeder Einzelzellstudie.

1. Vorbereitung auf Silikon-Master

HINWEIS: Die PDMS-Schablonen mit den mikrofabrizierten Fallen, die die Schablone für die kolloidale und mikrobielle Musterung bilden, wurden nach der von Geissler et al. eingeführten Methode hergestellt. ¹⁷. Auflage. Der Siliziummaster wurde durch konventionelle Lithographie in einem Reinraum hergestellt. In den folgenden Schritten finden Sie das Verfahren und die Materialtabelle für die Ausrüstung.

1. Entwerfen Sie die Funktionen mit CAD-Software (Computer Aided Design).
2. Bereiten Sie die Chromglasmaske mit einer Schicht aus positivem Fotolack vor, indem Sie die entworfenen Merkmale mit einem UV-Direktlaserschreiber freilegen.
   1. Entwickeln Sie die Chrom-Glas-Maske mit einem Spin-Entwickler mit einem Entwickler im Verhältnis von 1:4 Fotolack zu Wasser für 15 s.
   2. Tauchen Sie die Maske für 50 s in Chromätzmittel.
   3. Plasmabehandlung eines 10 cm Siliziumwafers für 3 min bei 600 W.
   4. Eine Schicht Hexamethyldisilizan dampfen und bei 110 °C backen, um die Haftung zum Fotolack zu verbessern.
   5. Legen Sie eine Schicht Fotolack bei 4.500 × g für 2 min ab.
   6. Setzen Sie das Feature durch die Chromglasmaske mit einem Mask aligner für 2 s UV aus und entwickeln Sie mit einem Entwickler wie für die Maske.
3. Um die Herstellung des Silizium-Masters abzuschließen, ätzen Sie den Wafer über einen tiefen reaktiven Ionenaustausch und passen Sie die Ätzzeit (<2 min) an, um die gewünschte Tiefe zu erreichen (gemessen mit einem Profilometer).

2. Mikrokanal-Formvorbereitung

1. Entwerfen Sie den Kanal mit CAD-Software und schneiden Sie ihn mit einer Slicer-Software, um das entworfene Modell in Anweisungen für den 3D-Drucker umzuwandeln und den Schneideabstand auf 0,05 mm einzustellen.
2. Drucken Sie den Kanal mit einem 3D-Drucker für ~1 h.
3. Waschen und nachhärten Sie die Form in einer speziellen Aushärtungs- und Waschmaschine.
   1. Geben Sie die Form in einen mit reinem Isopropylalkohol (IPA) gefüllten Behälter und wirbeln Sie die Flüssigkeit (20 minuten waschen). Nehmen Sie den mit IPA gefüllten Behälter aus der Maschine.
   2. Sobald die gewaschene Form aus dem IPA-Behälter entnommen wurde, legen Sie sie zurück in die Wasch- und Härtungsmaschine und stellen Sie sie für 15 min bei 35 ° C nach.
      HINWEIS: Die Materialtabelle enthält den 3D-Drucker und die Aushärtungs- und Waschmaschine, die im Formvorbereitungsprotokoll verwendet werden. Das 3D-Modell wurde mit der proprietären Slicer-Software des 3D-Druckers geschnitten.
4. Legen Sie den Druck für 12 h in einen UV-Ofen und legen Sie ihn für 12 h in einen Ofen bei 80 °C.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass das gesamte Polymer ausgehärtet ist und das gesamte nicht ausgehärtete Polymer aus dem Druck entfernt wird, da pdMS nicht aushärten kann.
5. Silanisieren Sie die Form durch Dampfabscheidung von Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan.
   1. Legen Sie die 3D-Form in einen Vakuum-Exsikkator zusammen mit 20 μL 100% konzentriertem Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyl) Silan, das auf einer Aluminiumfolie in der Nähe der Form pipettiert wird.
   2. Erzeugen Sie ein Vakuum im Exsikkator, um Dampf zu erzeugen, und lassen Sie es 40 Minuten stehen.
   3. Entfernen Sie die Form aus dem Exsikkator und spülen Sie sie mit reinem Ethanol ab, bevor Sie PDMS darauf gießen.

3. Herstellung des mikrofluidischen Chips

1. Bereiten Sie eine PDMS-Mischung vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Vernetzungsmittel mischen (Materialtabelle). Rühren Sie die Mischung kräftig um, um die beiden Komponenten gleichmäßig zu mischen, bis sich Luftblasen bilden und die PDMS-Mischung undurchsichtig aussieht.
   HINWEIS: Die Menge an Vernetzer sollte 10 Gew.-% der Elastomermenge betragen.
2. Entgasen Sie das Gemisch aus Elastomer und Vernetzungsmittel in einem Vakuum-Exsikkator, um die eingeschlossenen Luftblasen zu entfernen. Das Gemisch wird im Exsikkator in den zum Mischen verwendeten Behälter überführt (Schritt 3.1). Setzen Sie den Entgasungsprozess fort, bis alle Blasen entfernt wurden und die Mischung wieder transparent aussieht.
   HINWEIS: Die für die Austrocknung typische Zeit beträgt 30 min.
3. Gießen Sie 3 g der Mischung auf den Siliziummaster, um die Schablone zu erzeugen, die als "Boden" des mikrofluidischen Chips dient.
   HINWEIS: Die Dicke der PDMS-Schicht kann durch Ändern der auf den Siliziumstamm gegossenen Mischungsmenge abgestimmt werden.
   1. Um eine 400 μm dicke Schablone zu erhalten, gießen Sie 3 g PDMS auf den Silizium-Master, legen Sie den Silizium-Master auf einen Spin-Coater und drehen Sie ihn bei 21 × g für 5 s und 54 × g für 10 s und entgasen Sie dann erneut, wie in Schritt 3.2 beschrieben, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
4. Gießen Sie 20 g der PDMS-Mischung auf die 3D-gedruckte Form, um den Mikrokanal herzustellen, der als "Dach" des mikrofluidischen Chips dient, und entgasen Sie ihn wie in Schritt 3.2 beschrieben für 30 Minuten.
5. Backen Sie sowohl den Siliziumwafer als auch die 3D-gedruckte Form bei 70 °C für mindestens 2 h.
6. Ziehen Sie die PDMS-Schicht von der 3D-gedruckten Form ab, schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrokanäle und stanzen Sie die Löcher, die als Ein- und Auslass des mikrofluidischen Kanals dienen.
7. Ziehen Sie das PDMS vom Siliziumstamm ab und schneiden Sie die PDMS-Schicht in kleinere Stücke mit den gleichen Abmessungen der mikrofluidischen Kanäle, die auf den Schablonen verklebt werden.
8. Reiben Sie die Schablonen und Mikrokanäle vorsichtig mit einer 1% igen Reinigungsmittellösung (siehe Tabelle der Materialien) für 5 min und spülen Sie sie dann mit entionisiertem Wasser ab. Als nächstes spülen Sie die Schablonen und Mikrokanäle mit Isopropanol und spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser ab. Trocknen Sie die Schablonen und Mikrokanäle bei Raumtemperatur für 1 min mit Druckluft an 1 bar.
9. Legen Sie die Schablonen und die Mikrokanäle in einen Plasmareiniger, wobei die zu verklebenden Oberflächen nach oben zeigen. Schalten Sie den Plasmareiniger ein, und Plasma behandelt die Schablonen und die Mikrokanäle für 40 s. Nehmen Sie sie aus dem Plasmareiniger heraus und verbinden Sie die Mikrokanäle sofort auf den Schablonen, indem Sie sie miteinander in Kontakt bringen.
10. Lagern Sie die mikrofluidischen Chips fünf Tage lang in einem Ofen bei 70 °C, um eine hydrophobe PDMS-Rückgewinnung zu gewährleisten und einen Rückkontaktwinkel im optimalen Bereich zwischen 30 und 60°^10,11 zu haben.

4. Bakterielle Musterung

1. Einen Tag vor dem Experiment wächst eine Population von Escherichia coli (Stamm MG1655 prpsM-GFP). Impfen Sie die Kultur direkt aus der gefrorenen Brühe und wachsen Sie über Nacht für 20 h in Lysogenbrühe (LB) Medium in einem Shaker-Inkubator bei 37 ° C. Fügen Sie 50 μg / ml Kanamycin hinzu, damit die Zellen das prpsM-GFP-Plasmid behalten.
2. Stellen Sie am Tag des Experiments den Box-Inkubator (Abbildung 2A) mehrere Stunden vor dem Experiment auf 37 °C, um vor Beginn des Experiments eine gleichmäßige und stabile Temperatur zu haben. Stellen Sie die Spritzenpumpe und die beheizte Glasplatte auf dem Mikroskoptisch auf (Abbildung 2B,C) und stellen Sie die Temperatur auf die gleiche Temperatur wie der Box-Inkubator.
   HINWEIS: Der Box-Inkubator, in dem das gesamte System, einschließlich des Mikroskops (Abbildung 2E), eingeschlossen ist, stellt sicher, dass während des gesamten Experiments eine gleichmäßige und konstante Temperatur aufrechterhalten wird, wenn der Kanal mit Medium gespült wird.
3. Neunzig Minuten vor dem Experiment den mikrofluidischen Chip in ein mit 100% Ethanol (EtOH) gefülltes Gefäß geben und den Kanal mindestens 10 Minuten lang mit 100% EtOH spülen. Legen Sie den mikrofluidischen Chip in einen Vakuum-Exsikkator und entgasen Sie ihn für mindestens 30 min. Tauschen Sie das EtOH gegen destilliertes Wasser aus und saugen Sie den Chip mindestens 30 Minuten lang vakuumbehandelt. Stellen Sie den mikrofluidischen Chip für 10 min bei 70 °C in den Ofen, um die im Kanal verbliebenen Flüssigkeitsspuren zu entfernen.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, um die Bildung von Blasen im Kanal zu verhindern, wenn er mit Kulturmedium gespült wird. Dieses Blasenpräventionsprotokoll wurde von Wang et ^al.18 übernommen.
4. 1 ml 3-(N-Morpholino)propanesulfonsäure (MOPS)-Medium (1x) werden in eine Zentrifugenfläschchen pipettiert und 10 μL 0,132 M Kaliumphosphat (_K2HPO4) zugegeben. Nehmen Sie die Nachtkultur aus dem 37 °C Inkubator und aliquot 100 μL in die Zentrifugenfläschchen und zentrifugieren Sie die Kultur bei 2.300 × g für 2 min. Den Überstand vorsichtig aus den Zentrifugenfläschchen pipettieren und das Pellet in 1 ml frischem MOPS-Medium mit 0,015% v/v Tween 20 und 0,01% v/v Kaliumphosphat resuspendieren.
   HINWEIS: Die typische Konzentration der Bakteriensuspension liegt im Bereich von 0,015-0,15 vol%, was die Bildung einer ausgedehnten und mobilen Akkumulationszone gewährleistet und die Ansammlung von Partikeln auf dem Substrat verhindert. Das Ersetzen des Übernachtmediums durch ein frisches Medium minimiert das Risiko der Freisetzung von Bakterienfilmen auf der Schablone. Der Mangel an Kohlenstoffquelle im frischen Medium verhindert, dass Zellen während der Schablonenstrukturierung in der Suspension wachsen. Eine Konzentration von 0,015% v/v von Tween 20 in der Suspension ist notwendig, damit der Kontaktwinkel der zurückweichenden Flüssigkeit auf der PDMS-Schablone in den optimalen Bereich zwischen 30 und 60° fällt.
5. Laden Sie die Bakteriensuspension in eine 1-ml-Spritze und verbinden Sie die Spritze über mikrofluidische Schläuche mit dem Chip.
   1. Um die Verbindung zwischen der Spritze und dem Schlauch zu sichern, führen Sie direkt eine Nadel mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm in den Schlauch ein. Um zu vermeiden, dass in der Einlassnähe verbleibende Suspension über den Kanal gestreut wird, spülen Sie frisches Medium durch die Bohrung, die während des Strukturierungsprozesses als Auslass verwendet wird (Abbildung 3A-III), und nicht durch die als Einlass verwendete Bohrung.
   2. Montieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe und injizieren Sie die Suspension durch den Einlass am vorgeschalteten Teil des Kanals in den mikrofluidischen Chip, bis die Suspension den Schablonenbereich mit Fallen bedeckt.
      HINWEIS: Während des Flüssigkeitsinjektionsprozesses kann Luft durch einen Auslass am nachgeschalteten Ende des Kanals entweichen.
   3. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie die Bakteriensuspension (Abbildung 3A-I) mit einer Durchflussrate von 0,07-0,2 μL/min entzieht, was in der beschriebenen Geometrie einer Meniskusrücktrittsgeschwindigkeit von 80-100 μm/min entspricht.
   4. Überwachen Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware.
      HINWEIS: Hier wurde eine 10-fache Vergrößerung verwendet, um den zurückgehenden Meniskus auf der Schablone zu überwachen, und eine 20-fache Vergrößerung wurde verwendet, um die Ablagerung einzelner Bakterien in die mikrofabrizierten Fallen zu überwachen.
6. Sobald die Schablone mit Zellen strukturiert wurde (Abbildung 3A-II), erhöhen Sie die Entnahmeflussrate, um den mikrofluidischen Kanal schnell zu entleeren, und spülen Sie ihn mit frischem LB, der zuvor für mindestens 30 min entgast und bei 30 °C vorgewärmt wurde.
7. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Durchflussrate von 2 μL/min ein, um den Kanal vorsichtig zu spülen. Sobald der Kanal gefüllt ist, erhöhen Sie die Durchflussrate (15 μL/min) entsprechend den spezifischen experimentellen Anforderungen.
8. Erfassen Sie Bilder von wachsenden Bakterien in der gewünschten Vergrößerung und im gewünschten Zeitintervall.

5. Kolloidale Musterung

1. 900 μL einer wässrigen Lösung mit 0,015 % v/v Tween 20 werden in eine Zentrifugenfläschchen pipettiert und 100 μl der ursprünglichen kolloidalen Suspension hinein pipettiert. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 13.500 × g für 1 min. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und ersetzen Sie ihn durch die wässrige Tween 20-Lösung (0,015 % v/v). Wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal, um den vollständigen Austausch des Lösungsmittels des Lieferanten aus der Lagersuspension sicherzustellen.
2. Laden Sie die kolloidale Suspension in eine 1-ml-Spritze und verbinden Sie die Spritze über mikrofluidische Schläuche mit dem Chip. Injizieren Sie die Suspension in den mikrofluidischen Chip durch den Einlass, der sich innerhalb des zentralen Abschnitts am vorgeschalteten Teil des Kanals befindet, und drücken Sie die Suspension allmählich an, bis die Schablone abgedeckt ist.
3. Ziehen Sie die kolloidale Suspension mit einer Durchflussrate von 0,07-0,2 μL/min zurück, was einer Meniskusrücktrittsgeschwindigkeit von 1-2 μm/min entspricht, und bilden Sie den Strukturierungsprozess über eine Mikroskopsoftware ab. Verwenden Sie die 10-fache Vergrößerung, um den zurückgehenden Meniskus auf der Schablone zu überwachen, und die 20-fache Vergrößerung, um die Ablagerung einzelner Partikel in die mikrofabrizierten Fallen zu beobachten. Erhöhen Sie die Durchflussrate, sobald der Meniskus das Ende der Vorlage erreicht hat, um den Kanal schnell zu leeren.
   HINWEIS: Kolloidale Arrays, die aus mehreren Partikeln bestehen, können hergestellt werden, indem der Strukturierungsprozess von den Schritten 5.1 bis 5.3 in Reihe ausgeführt wird. Der Kanal wird bei jeder Iteration entsprechend der gewünschten kolloidalen Array-Zusammensetzung mit einer neuen kolloidalen Suspension beladen. Jeder Strukturierungsschritt fügt dem kolloidalen Array ein Partikel hinzu und kann nacheinander ausgeführt werden, bis die Fallen mit der gewünschten Partikelsequenz gefüllt sind. Die Zusammensetzung der resultierenden kolloidalen Arrays ist ausschließlich durch die Sequenz der kolloidalen Suspensionen gegeben, die zum Füllen der Fallen verwendet werden (Abbildung 3B).

Es wurde eine mikrofluidische Plattform entwickelt, die die kapillaritätsunterstützte Montage nutzt, um kolloidale Partikel und Bakterien zu Fallen zu strukturieren, die auf einer PDMS-Schablone mikrofabriziert sind. Zwei verschiedene Kanalgeometrien wurden entwickelt, um die Strukturierung von Kolloiden und Bakterien durch die kapillaritätsunterstützte Montage zu optimieren. Die erste Kanalgeometrie (Abbildung 1B) besteht aus drei 23 mm langen parallelen Abschnitten ohne physische Barriere zwischen ihnen. Die beiden Abschnitte an den Seiten sind 5 mm breit und 1 mm hoch, während der mittelmäßige Abschnitt 7 mm breit und 500 μm hoch ist. Dieses Design hilft, ein gut definiertes bewegliches Tröpfchen mit einem zurückgehenden konvexen Meniskus zu erhalten. Das Funktionsprinzip dieser Plattform wird von Pioli et al.11 ausführlich beschrieben. Wenn das Experiment das Füllen der seitlichen Kanäle erfordert, wie im Fall der Bakterienkultivierung, werden normalerweise Lufteinschlüsse gebildet. Aus diesem Grund haben wir eine zweite Geometrie entworfen und getestet, die den Füllprozess vereinfacht, wenn der Kanal mit Medium gespült wird. In diesem Fall besteht die Plattform (Abbildung 1C) aus einem einzelnen 20 mm langen, 3 mm breiten und 500 μm hohen geraden Kanal.

Die Temperatur im mikrofluidischen Kanal ist ein wichtiger Parameter, um einen effizienten Abscheidungsprozess zu gewährleisten. Es muss 15 °C über dem Taupunkt des Wassers gehalten werden, um Kondensation auf der Schablone zu vermeiden. Die beheizte Glasplatte unter dem Kanal (Abbildung 2D) sorgt für eine gleichmäßige Temperatur in der gesamten Schablone, um Kondensation während des Strukturierungsprozesses in der Nähe der Flüssig-Luft-Grenzfläche zu verhindern, die durch eine hohe Dampfkonzentration in der Luft gekennzeichnet ist. Die Temperatur der beheizten Glasplatte muss mit der des Box-Inkubators übereinstimmen, um Kondensation auf der Schablone zu vermeiden.

Die gerade Kanalgeometrie wurde genutzt, um stationäre Phasenzellen (Abbildung 4A) eines fluoreszierenden E. coli-Stammes (MG1655 prpsM-GFP) zu strukturieren. Bakterien lagerten sich in 83% der 5.000 analysierten Fallen ab. Die Zellen wurden zunächst gemäß dem vorgestellten Protokoll in die Fallen gelegt und anschließend für 4 h bei 37 °C in LB gespült bei 10 mm/min gezüchtet. Gemusterte Bakterien nahmen das Wachstum zu verschiedenen Zeiten innerhalb von 1,5 h wieder auf, nachdem der Kanal mit frischem LB gefüllt wurde (Abbildung 4B-I), wobei der Median bei 44 min lag. Sobald das Wachstum wieder aufgenommen ist, beginnen einzelne Bakterienzellen, einzelne Kolonien zu bilden, die sich ausdehnen (Abbildung 4B-II), bis eine Oberflächenschicht gebildet ist (3,5 h) und die Einzelzellauflösung verloren geht (Abbildung 4B-III).

Dieses Proof-of-Concept-Experiment zeigt, dass die kapillaritätsunterstützte Montage in einem mikrofluidischen Kanal verwendet werden kann, um eine Oberfläche mit Tausenden von lebensfähigen Einzelbakterienzellen zu strukturieren. Elf Replikate zeigen, dass gemusterte Zellen in 45,5% der Fälle innerhalb eines 7-Stunden-Fensters wuchsen. Vier Tests, die durchgeführt wurden, fügten Propidiumiodid (PI), eine lebende tote Färbung19, zu dem frischen LB hinzu, das nach der Ablagerung in den Kanal gespült wurde, und bewiesen, dass nicht wachsende, gemusterte Bakterien nicht gefärbt wurden. Da PI an DNA bindet, aber Zellen mit einer intakten Membran nicht durchdringen kann, zeigt das PI-Färbeexperiment, dass weder der Musterungsprozess noch die Austrocknungs- und Rehydratationsprozesse die Membran der Zellen beschädigt haben.

Die dreiteilige Kanalgeometrie wurde verwendet, um lineare kolloidale Arrays mit unterschiedlichen Zusammensetzungen zu erzeugen, indem sequenzielle Muster von kolloidalen Partikeln durchgeführt wurden. Abbildung 5 zeigt die verschiedenen kolloidalen Arrays, die durch sequenzielle Musterung gebildet werden, einschließlich Dimere (Abbildung 5A, B) und Trimere (Abbildung 5C), die zwei bzw. drei sequentiell gefangene Partikel enthalten. Grün und rot fluoreszierende Polystyrolpartikel wurden verwendet, um sowohl Dimere als auch Trimere zusammenzusetzen. Analysen, die über 55.000 Fallen durchgeführt wurden, zeigen, dass grün-rote (G-R) Dimere (Abbildung 5A,B), die von Partikeln mit einem Durchmesser von 2 μm bzw. 1 μm hergestellt werden, in 93% bzw. 89% der analysierten Fallen gebildet wurden. Grün-rot-grüne (G-R-G) Trimer (Abbildung 5C) wurden in 52% der 55.000 analysierten Fallen gebildet11. Dimere und Trimere wurden durch sequenzielle Ablagerungen zusammengesetzt, wobei sich die kolloidalen Suspensionen über alle sequentiellen Ablagerungen in die gleiche Richtung bewegten (Abbildung 3B). Infolgedessen stehen partikel, die in jedem Abscheidungsschritt eingeschlossen sind, in direktem Kontakt mit denen, die im vorherigen schrittfangen sind.

Die präzise Positionierung der Partikel erfordert keinen direkten Kontakt zwischen den abgeschiedenen Partikeln. Der Abstand zwischen strukturierten Partikeln kann präzise gesteuert werden, indem zwei Ablagerungen in entgegengesetzte Richtungen durchgeführt werden, wodurch solche Partikel an den gegenüberliegenden Enden jeder Falle eingeschlossen werden (Abbildung 5D). Der Abstand zwischen den eingeschlossenen Partikeln kann durch die Konstruktion von Fallen mit der gewünschten Länge eingestellt werden. Eine zusätzliche Möglichkeit, die die Plattform bietet, ist die chemische Strukturierung der Oberfläche mit mikrometrischer Präzision. Dieses Ergebnis kann erreicht werden, indem die Schablone mit chemisch funktionalisierten Partikeln gemustert wird11.

Abbildung 1: Geometrien und Strukturierungsprozesse mikrofluidischer Kanäle. (A) Schematische Darstellung eines Seitenansichtsabschnitts des mikrofluidischen Kanals während der Strukturierung kolloidaler Partikel. Die flüssige Suspension verdampft im mikrofluidischen Kanal, und konvektive Ströme transportieren schwebende Partikel in Richtung der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Partikel werden somit akkumuliert und bilden die Akkumulationszone. Die Spritzenpumpe zieht die Flüssigkeitssuspension, wodurch sie sich zurückzieht, und einzelne Partikel werden während der Flüssigkeitsrezession auf der Schablone eingeschlossen. Der Pfeil stellt die Richtung dar, in die sich die Aufhängung bewegt. (B) Schematische Darstellung der Kanalgeometrie, die zum Muster kolloidaler Partikel auf der PDMS-Schablone verwendet wird. Der Kanal ist 23 mm lang und 17 mm breit und besteht aus drei Abschnitten: einem zentralen, der 7 mm breit ist, und zwei seitlichen, die 5 mm breit sind. Die Vorlage befindet sich auf dem Boden des Kanals im zentralen Bereich. Der Querschnitt zeigt, dass der zentrale Abschnitt des mikrofluidischen Kanals, in dem die Flüssigkeitssuspension während des gesamten Strukturierungsprozesses eingeschlossen ist, der flachste Teil des Kanals ist und 500 μm hoch ist, während die beiden seitlichen Abschnitte beide 1 mm hoch sind. (C) Schematische Darstellung der geraden Kanalgeometrie, die zur Musterung von Bakterien verwendet wird. Das mikrofluidische Gerät besteht aus einem 20 mm langen, 3 mm breiten und 500 μm hohen geraden Kanal. Der rechteckige Querschnitt dieser mikrofluidischen Vorrichtung, der im Querschnitt dargestellt ist, vereinfacht den Füllvorgang des Kanals mit Medium. Das REM-Bild zeigt einen kleinen Teil der PDMS-Vorlage mit 2 μm langen, 1 μm breiten und 500 nm tiefen Fallen, die darauf mikrofabriziert sind. Maßstabsleiste = 2 μm. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; REM = Rasterelektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Plattform für die sequentielle kapillaritätsunterstützte Montage in einem mikrofluidischen Kanal. (A) Box-Inkubator. Der Box-Inkubator hält eine gleichmäßige und konstante Temperatur (hier 30 °C) im Mikrofluidikkanal aufrecht. (B) Spritze, die mit flüssiger Suspension beladen ist. Die Spritze wird von einer Spritzenpumpe (nicht abgebildet) gesteuert und dient zur Steuerung der Bewegung der Flüssigkeit während des Strukturierungsprozesses. (C) Beheizte Glasplatte. Die beheizte Glasplatte befindet sich unter dem mikrofluidischen Kanal und sorgt für eine gleichmäßige Temperatur (hier 30 °C) über die Schablone, was entscheidend ist, um Kondensation in der Nähe der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche zu vermeiden. (D) Mikrofluidik-Chip, der mit einer flüssigen Suspension beladen ist. Der Boden des mikrofluidischen Chips trägt die Fallen, in denen Bakterien und Kolloide während des Strukturierungsprozesses gemustert werden. (E) Mikroskop. Die beheizte Glasplatte und der mikrofluidische Chip werden auf einem Mikroskoptisch platziert und ermöglichen den vollen optischen Zugang während des Strukturierungsprozesses und aller folgenden Schritte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Schritte bei der bakteriellen und kolloidalen Musterung. Jedes Panel zeigt eine Innenansicht des mikrofluidischen Kanals und enthält nur einen kleinen Teil des PDMS-Templates. (A) Strukturierung von Bakterien durch kapillaritätsunterstützte Montage. (I) Die Bakteriensuspension verdampft innerhalb des mikrofluidischen Kanals, wodurch konvektive Ströme suspendierte Bakterien an die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche transportieren und so die Akkumulationszone bilden. Währenddessen wird die Aufhängung von der Spritzenpumpe gezogen und zieht sich an der Schablone zurück. Der Pfeil stellt die Richtung dar, in die sich die Bakteriensuspension bewegt. Die zurückweichende Suspension streicht über die Schablone, und einzelne Zellen lagern sich in den mikrofabrizierten Fallen ab. (II) Abgelagerte Bakterien werden der Luft ausgesetzt, bis der Kanal mit frischem Medium gespült wird. Der Abscheidungsprozess ist abgeschlossen, wenn die flüssige Suspension das Ende der Schablone erreicht. (III) Der mikrofluidische Kanal wird mit frischem Medium (d. h. LB) gespült. Der Pfeil stellt die Richtung dar, in die das frische Medium gespült wird. (B) Strukturierung kolloidaler Partikel durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Assemblierung. (I) Die kolloidale Suspension zieht sich während des Verdampfens auf der Schablone zurück, und Partikel sammeln sich an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche an und bilden die Akkumulationszone. Einzelne Partikel werden in die auf der Schablone mikrofabrizierten Fallen abgeschieden. Der Pfeil stellt die Richtung dar, in die sich die kolloidale Suspension bewegt. II) Der Abscheidungsprozess ist abgeschlossen, wenn die flüssige Suspension das Ende der Schablone erreicht. (III) Eine zweite Abscheidung wird in die gleiche Richtung wie die erste Abscheidung durchgeführt, um ein zweites Teilchen in jede Falle auf der Schablone zu legen. (IV) Sobald die zweite Abscheidung abgeschlossen ist, wird die Schablone mit Dimeren aus einem grünen und einem roten Partikel strukturiert. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; LB = Lysogeniebrühe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: PDMS-Vorlage mit E. coli-Zellen (Stamm MG1655 prpsM-GFP). (A) REM-Aufnahme einzelner E. coli-Zellen , die in 2 μm langen, 1 μm breiten und 500 nm tiefen Fallen gefangen sind. Zellen wurden nach einer einzigen Ablagerung gefangen. Maßstabsbalken = 2 μm. (B) Epifluoreszenzbilder eines kleinen Teils der PDMS-Schablone (ca. 80 μm x 80 μm) mit eingeschlossenen Zellen von E. coli , nachdem der mikrofluidische Kanal mit Kulturmedium (Lysogeniebrühe) mit einer Anfangsgeschwindigkeit von 1,3 mm/min gefüllt wurde, die dann auf 10 mm/min erhöht wird. Gefangene Zellen wachsen und teilen sich mehrmals für 4 h, verschmelzen schließlich mit Zellen aus benachbarten Fallen und bedecken die Oberfläche. Maßstabsbalken = 10 μm. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Kolloidale Cluster, zusammengesetzt durch sequentielle kapillaritätsunterstützte Partikelanordnung in der mikrofluidischen Plattform (erste Kanalgeometrie). Epifluoreszenzmikroskopieaufnahme von (A) 15 Dimeren, zusammengesetzt aus Polystyrolpartikeln mit einem Durchmesser von 2 μm und zwei aufeinanderfolgenden Ablagerungen. (B) Dimere (n = 15), zusammengesetzt aus Polystyrolpartikeln mit einem Durchmesser von 1 μm und zwei aufeinanderfolgenden Ablagerungen. (C) Trimere (n = 15), zusammengesetzt aus Polystyrolpartikeln mit einem Durchmesser von 1 μm und drei aufeinanderfolgenden Ablagerungen. (D) Fallen (n = 15) mit Partikeln, die an den Enden jeder Falle strukturiert sind, indem zwei aufeinanderfolgende Ablagerungen in entgegengesetzte Richtungen laufen. Der Abstand zwischen den Partikeln in einer Falle beträgt 2 μm. Maßstabsbalken = 4 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.