Summary
Qui, presentiamo un protocollo per rilevare epitopi di neutralizzazione su particelle simili a virus che visualizzano l'antigene (VLP). L'immunoprecipitazione dei VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) viene eseguita utilizzando anticorpi monoclonali specifici della glicoproteina dell'involucro accoppiati a perle magnetiche coniugate con proteina G. I VLP catturati vengono successivamente sottoposti all'analisi SDS-PAGE e Western blot utilizzando anticorpi specifici della proteina virale Gag.
Abstract
Il test di cattura delle particelle simili al virus (VLP) è un metodo di immunoprecipitazione, comunemente noto come "test pull-down" utilizzato per purificare e isolare VLP che mostrano l'antigene. Gli anticorpi antigene-specifici di superficie sono accoppiati e quindi immobilizzati su una matrice solida e insolubile come le perline. A causa della loro elevata affinità con l'antigene bersaglio, questi anticorpi possono catturare VLP decorati con l'antigene affine ancorato nell'involucro di membrana dei VLP. Questo protocollo descrive il legame degli anticorpi antigene-specifici alle perle magnetiche coniugate con proteina A o G. Nel nostro studio, vengono esaminati i VLP derivati dal virus dell'immunodeficienza umana (HIV) formati dalla proteina precursore del nucleo virale dell'antigene specifico del gruppo (Gag) p55 Gag e che mostrano la glicoproteina dell'involucro (Env) dell'HIV. I VLP vengono catturati utilizzando anticorpi ampiamente neutralizzanti (bNAbs) diretti contro epitopi sensibili alla neutralizzazione in Env. Il test di cattura VLP qui delineato rappresenta un metodo sensibile e facile da eseguire per dimostrare che (i) i VLP sono decorati con il rispettivo antigene bersaglio, (ii) l'antigene di superficie ha mantenuto la sua integrità strutturale come dimostrato dal legame epitopo-specifico di bNAbs utilizzato nel test e (iii) l'integrità strutturale dei VLP rivelata dal rilevamento delle proteine Gag in una successiva analisi Western blot. Di conseguenza, l'utilizzo di bNAbs per l'immunoprecipitazione facilita una previsione se i vaccini VLP saranno in grado di suscitare una risposta neutralizzante delle cellule B negli esseri umani vaccinati. Prevediamo che questo protocollo fornirà ad altri ricercatori un approccio sperimentale prezioso e diretto per esaminare potenziali vaccini basati su VLP.
Introduction
Le particelle simili ai virus (VLP) assomigliano alla struttura delle particelle virali native pur mancando del genoma virale, fornendo così un elevato profilo di sicurezza1,2. I VLP rappresentano una classe individuale di vaccini sempre più sviluppati a causa della loro elevata immunogenicità3,4,5,6,7. Ciò è particolarmente vero per i VLP avvolti da membrana, che consentono la visualizzazione non solo di antigeni virali di superficie omologhi, ma anche di antigeni eterologhi come gli antigeni tumorali8,9,10. La Figura 1 fornisce una panoramica esemplare della struttura di un VLP rivestito con antigene avvolto. Durante il processo di sviluppo dei vaccini basati su VLP, i saggi sono indispensabili per consentire l'analisi del rispettivo antigene bersaglio visualizzato sulla superficie VLP. Tali saggi dovrebbero essere strumentali per chiarire la composizione di un vaccino contro il particolato: (i) I VLP sono decorati con il rispettivo antigene di superficie? (ii) L'antigene di superficie ha mantenuto la sua struttura nativa come dimostrato dal riconoscimento epitopico degli anticorpi neutralizzanti (bNAbs) e (iii) l'integrità strutturale dei VLP può essere confermata grazie all'individuazione della proteina virale che media la formazione di VLP?
Figura 1: Illustrazione schematica di un VLP avvolto da membrana. I VLP sono formati da proteine gag precursori immature e circondati da una membrana lipidica derivata dalla cellula ospite. Gli antigeni, ad esempio le glicoproteine dell'involucro, sono incorporati nella membrana lipidica e visualizzati sulla superficie del VLP (a destra). Gli anticorpi antigene-specifici riconoscono l'antigene. A sinistra, viene mostrato un VLP calvo senza decorazione antigenica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Soprattutto i VLP formati dalla proteina precursore del nucleo dell'antigene virale specifico (Gag) p55 del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) sono scaffold preferiti per la visualizzazione dell'antigene nello sviluppo del vaccino poiché sono disponibili numerosi anticorpi e kit ELISA, che consentono la quantificazione di questi VLP11,12. Le glicoproteine dell'involucro HIV-1 (Env), vale a dire la proteina transmembrana gp41 (gp41-TM) e l'unità di superficie solubile gp120 (gp120-SU) che formano eterodimeri, sono incorporate nell'involucro di membrana delle particelle e sono antigeni bersaglio cruciali per lo sviluppo di vaccini contro l'infezione da HIV13,14,15 . La visualizzazione di epitopi sensibili alla neutralizzazione in questi antigeni bersaglio è un prerequisito per suscitare una risposta anticorpale ampiamente neutralizzante nei vaccinati. Oltre a una risposta delle cellule T diretta contro le proteine Gag, questo è considerato un importante correlato di protezione contro l'infezione da HIV16. Di conseguenza, e al momento della progettazione e della produzione di VLP decorati con candidati antigeni bersaglio, la successiva analisi della qualità degli antigeni visualizzati rappresenta un passo critico nel processo di sviluppo del vaccino.
L'immunoprecipitazione (IP) è una tecnica ampiamente utilizzata per la rilevazione delle interazioni proteina-proteina e la purificazione di complessi proteici su piccola scala17. Barret et al. ha riferito per la prima volta sullo sviluppo della PI nel 1960, tuttavia, questo metodo è stato costantemente ulteriormente migliorato. L'IP consente la cattura e l'isolamento di un antigene bersaglio (preda) da una soluzione impiegando un anticorpo antigene-specifico (esca) immobilizzato mediante accoppiamento alle perline18,19. In questo protocollo, dimostriamo una variazione della classica applicazione IP utilizzando VLP formati da gag p55 avvolti a membrana come preda e bNAbs che riconoscono epitopi sensibili alla neutralizzazione nelle proteine dell'involucro visualizzate sulla superficie dei VLP come proteine esca. L'applicazione di successo di questo test di cattura VLP facilita la previsione se i VLP antigene positivi testati saranno in grado di suscitare una risposta neutralizzante delle cellule B nelle persone vaccinate. Tali proprietà immunogeniche dei candidati vaccini a base di VLP sono spesso dimostrate in modelli di piccoli animali20,21,22.
Al fine di valutare la qualità del candidato vaccino VLP di nuova concezione, sono stati utilizzati con successo i test di cattura VLP5,23,24. Tuttavia, il numero di metodi pubblicati è limitato. Il test di cattura VLP qui presentato inizia con l'immobilizzazione di bNAbs env-specifici su perline coniugate con proteina G, che si legano alla regione Fc degli anticorpi derivati dai mammiferi. Le matrici tipiche per l'immobilizzazione dell'anticorpo di scelta sono agarosio o perline magnetiche. Tuttavia, le perle magnetiche sono favorevoli per applicazioni ad alta produttività25. Nella fase successiva, i VLP che mostrano l'antigene bersaglio vengono catturati da perline rivestite di bNAb. I complessi immunitari formati costituiti da VLP Env-positivi e bNAb immobilizzati sono facilmente arricchiti utilizzando un magnete. Gli immunocomplessi isolati vengono eluiti nella fase finale. Successivamente, i VLP possono essere caratterizzati biochimicamente. Qui, abbiamo eseguito l'analisi Western blot impiegando anticorpi specifici della proteina del nucleo virale p55 Gag per dimostrare che gli antigeni Env bersaglio precipitati non solo ospitavano gli epitopi sensibili alla neutralizzazione, ma venivano anche visualizzati su VLP formati da Gag. Inoltre, il rilevamento delle proteine Gag del nucleo virale aumenta la sensibilità del test di cattura poiché le proteine Gag sono più abbondanti di Env in un VLP. Nell'HIV-1, le proteine Env sono presenti solo a una o due cifre26, mentre più di 3.500 molecole Gag formano il nucleo di una particella27.
Rispetto ad altre tecniche per l'esame delle interazioni proteina-proteina28,29, il saggio di cattura VLP fornisce un metodo alternativo per i laboratori di ricerca che non hanno accesso a costosi strumenti analitici. Ad esempio, l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) possono essere costose. Il test di cattura qui presentato consente anche di sottoporre successivamente campioni VLP antigene-positivi catturati a un'ulteriore caratterizzazione proteica, ad esempio impiegando rispettivamente elettroforesi su gel, immunoblotting, microscopia elettronica e spettrometria di massa (MS). Considerando che la struttura nativa dell'antigene bersaglio viene preservata durante il test di cattura VLP, è possibile utilizzare anche le prestazioni di una PAGE nativa e le successive tecniche di immunoblotting.
Il test di cattura VLP rappresenta un metodo facile da usare e sensibile per esaminare la decorazione di VLP con antigeni bersaglio che espongono epitopi sensibili alla neutralizzazione e quindi la loro utilità come futuri candidati vaccini.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Seminare le linee cellulari in sospensione del produttore VLP derivate da cellule 293-F che esprimono geni strutturali dell'HIV gag da solo o in concerto con env 30 a bassa densità cellulare di 0,5 x 106 cellule per mL in 293-F Expression Medium.
- Lasciarli espandere per 3-4 giorni a 37 °C e 8% di CO2 in una rotazione dell'incubatrice shaker con un'orbita di 5 cm e 135 colpi al minuto (rpm).
- Pellet le celle di produzione per centrifugazione a 100 x g per 5 min. Filtrare il surnatante chiarificato per rimuovere le cellule residue e i detriti cellulari utilizzando filtri a membrana a membrana in polivinilidenfluoruro (PVDF) da 0,45 μm per ottenere un surnatante di coltura cellulare privo di cellule (CFSN).
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Cfsn può essere conservato durante la notte a 4 °C. - Utilizzare il CFSN direttamente per l'esperimento o VLP a pellet da 35 ml di CFSN utilizzando l'ultracentrifugazione (112.700 x g, 4 °C, 1,5 h).
- Dopo l'ultracentrifugazione, scartare il surnatante e sospendere i pellet VLP in 200 μL di soluzione di trealosio al 15% (p/v) per tubo della centrifuga.
NOTA: Il pellet VLP spesso non è visibile ad occhio nudo. Il protocollo può essere messo in pausa qui. I VLP possono essere conservati a -80 °C. - Prima del test di cattura VLP, determinare le concentrazioni di proteina virale nel VLP contenente campioni utilizzando un ELISA. Questo passaggio è importante per standardizzare l'input del test di acquisizione.
2. Test di acquisizione VLP
NOTA: una panoramica del flusso di lavoro è illustrata nella Figura 2.
- Sospendere le perle magnetiche tubando su e giù o mescolando su un rotatore a 50 giri / min per almeno 5 minuti.
- Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale contenente i bNAbs. Utilizzare 10 μg di ogni bNAb in 200 μL di legame anticorpale e tampone di lavaggio (vedere Tabella dei materiali) per reazione.
NOTA: Le quantità di anticorpi possono variare a seconda dell'affinità del bNAb e della densità di decorazione dell'antigene sui VLP utilizzati. - Utilizzare 50 μL della soluzione di perline magnetiche (vedere Tabella dei materiali) per reazione e trasferire le perline in un tubo di reazione da 1,5 mL. Posizionare i tubi sul rack di separazione magnetica.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare un forte magnete singolo per ciascun tubo per separare le perline dal surnatante. - Attendere alcuni minuti fino a quando le perline si riuniscono sulla parete del tubo per assicurarsi che tutte le perline vengano raccolte. Rimuovere il surnatante.
- Rimuovere il magnete e sospendere le perline in 200 μL della soluzione bNAb preparata al punto 2.2. Incubare per 30 minuti a 3 ore mescolando su un rotatore a 50 giri / min a temperatura ambiente.
- Posizionare nuovamente i tubi di reazione nel rack di separazione magnetica, attendere e rimuovere il surnatante.
- Rimuovere i tubi dal magnete e lavare le perline riesempendo in 200 μL di legame anticorpale e tampone di lavaggio.
- Ripetere il passaggio 2.4. Rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio.
- Aggiungere i campioni ai bNAbs associati a perline.
NOTA: l'input VLP per il test di cattura utilizzando particelle derivate dall'HIV deve essere di almeno 15 ng di proteina core virale per reazione. Le quantità di VLP possono variare a seconda dell'affinità del bNAb e della densità di decorazione dell'antigene sui VLP utilizzati. - Se il volume del campione aggiunto nel passaggio 2.9 è inferiore a 1 ml, aggiungere PBS per regolare il volume del campione a 1 mL. Sospendere delicatamente le perline mediante pipettaggio.
- Incubare i campioni e le perline per 2,5 ore su un rotatore a temperatura ambiente. Assicurarsi che le perline rimangano in sospensione e che la soluzione sia accuratamente miscelata durante l'incubazione.
- Posizionare i tubi sul magnete e rimuovere il surnatante.
- Lavare le perle magnetiche sospendendole in 200 μL di tampone di lavaggio (vedi Tabella dei materiali). Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
- Sospendere le perline in 100 μL di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in un tubo di reazione pulito (resistente al calore).
- Posizionare il tubo sul rack di separazione magnetica (vedere Tabella dei materiali) e rimuovere completamente il surnatante.
- Preparare campioni SDS-PAGE denaturati seguendo i passaggi 2.16.1-2.16.2 o campioni non denaturati eluendo i VLP dalle perle magnetiche seguendo i passaggi 2.16.3-2.16.5.
- Per preparare campioni SDS-PAGE denaturati, sospendere le perline in 20-80 μL di tampone Laemmli (0,8 μL di tampone Laemmli per 1 ng di ingresso del saggio Gag p55) e incubare a 95 °C per 5 min.
- Procedere direttamente con SDS-PAGE o conservare i campioni a -20 °C.
ATTENZIONE: il tampone di Laemmli contiene 2-mercaptoetanolo e sodio dodecil solfato. Indossare guanti protettivi e protezione per gli occhi. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e i vestiti. Non inalare vapori. Lavora in uno spazio ben ventilato, ad esempio una cappa aspirante.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. - In alternativa, eseguire una fase di eluizione non denaturante per ottenere VLP con struttura proteica nativa preservata.
- Aggiungere 25 μL di tampone di eluizione (spesso fornito con le perline) alle perle magnetiche e incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere le perline e trasferire l'eluato in un tubo pulito. Utilizzare l'eluato per i test successivi o conservarlo a 4 °C.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. Analisi dei campioni VLP catturati
NOTA: per l'analisi dei VLP catturati, condurre una SDS-PAGE e successivamente un'analisi Western blot31,32.
- Posizionare i tubi campione sul rack magnetico per separare le perline dalla soluzione.
- Caricare 10 μL di ciascun campione in singoli pozzetti del gel.
NOTA: In questo protocollo, le proteine virali p55 Gag core sono state rilevate impiegando anticorpi policlonali di coniglio diretti contro HIV Gag e IgG secondario policlonale di pollo anti-coniglio accoppiato agli anticorpi della perossidasi di rafano (HRP). Le proteine del nucleo virale sono state visualizzate utilizzando il rilevamento della chemiluminescenza.
Figura 2: Illustrazione schematica dei passaggi chiave del test di acquisizione VLP utilizzando supernatanti privi di cellule. (1) Il test di cattura VLP inizia con il legame dei bNAbs HIV-1 alle perle magnetiche accoppiate alla proteina G. Nel frattempo, viene preparata la soluzione VLP con una concentrazione definita di p55. Il surnatante di coltura privo di cellule è costituito da una miscela di PLP Gag p55, proteine delle cellule ospiti e acidi nucleici. (2) Le perle magnetiche accoppiate a bNAbs e alla soluzione VLP vengono trasferite in un tubo di reazione da 1,5 ml seguito da incubazione in rotazione. (3) I VLP che mostrano l'antigene sono catturati dalle perle rivestite di bNAbs. La separazione di questi immunocomplessi dai contaminanti derivati dalle cellule ospiti viene eseguita in un campo magnetico. (4) Il surnatante viene rimosso mediante pipettaggio e le perline vengono lavate tre volte per rimuovere i VLP non legati. (5) Nella fase successiva, il tampone di carico proteico riducente viene aggiunto agli immunocomplessi costituiti da perline magnetiche rivestite di bNAbs e VLP catturati. (6) L'ebollizione del campione dissocia bNAbs e antigene bersaglio dalle perle magnetiche e lisi delle VLP. (7) Le perle magnetiche sono separate dalla soluzione in un campo magnetico. (8) I campioni proteici sono sottoposti a SDS-PAGE. (9) L'analisi Western blot viene eseguita al fine di rilevare le proteine virali p55 Gag core. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Representative Results
La Figura 3 mostra un risultato rappresentativo dei VLP catturati per la prima volta dai pellet CFSN e VLP, rispettivamente, utilizzando bNAbs e successivamente sottoposti all'analisi Western blot per rilevare le proteine del nucleo virale. Le perle utilizzate per il test di cattura sono state rivestite con tre diversi bNAb diretti contro epitopi sensibili alla neutralizzazione delle glicoproteine Env e anticorpi isotipici che fungono rispettivamente da controlli negativi. Utilizzando perline rivestite con anticorpi isotipici, nessuna proteina Gag era rilevabile in campioni contenenti Env-negativi (VLP calvi) o VLP che mostravano Env che impiegavano l'analisi Western blot. Ciò ha dimostrato che il legame non specifico dei VLP alle perle rivestite con anticorpi umani non ha mediato la cattura VLP. Anche i VLP calvi non erano legati da perline rivestite di bNAbs e, di conseguenza, ancora una volta, nessuna proteina Gag era rilevabile. Al contrario, tutti e tre i bNAb hanno catturato VLP che mostravano proteine Env (Env VLP) e, pertanto, le proteine Gag sono state successivamente prontamente rilevate. Come visibile nella Figura 3, il test di cattura può essere utilizzato per analizzare l'antigene bersaglio che mostra VLP in CFSN e campioni VLP pellettati, rispettivamente.
Figura 3: Rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione nelle glicoproteine dell'involucro dell'HIV-1 visualizzate su VLP a forma di gag p55 utilizzando anticorpi ampiamente neutralizzanti. Risultati rappresentativi dell'analisi Western blot utilizzando anticorpi virali specifici della proteina core Gag dopo aver eseguito un test di cattura VLP che impiega tre diversi anticorpi ampiamente neutralizzanti (bNAb 1, bNAb 2 e bnAb 3) mirati agli epitopi all'interno delle glicoproteine dell'involucro HIV-1 (Env). Gli anticorpi umani di isotipo raggruppati dai sieri umani servivano come controlli negativi. I supernatanti di coltura cellulare sono stati raccolti da colture cellulari in sospensione che producono VLP con proteine Env (Env VLP) e VLP calve (Env-negative), rispettivamente, nonché da cellule ingenue che non esprimono proteine virali (finto). Sia i supernatanti della coltura cellulare di produzione VLP calva che della finta coltura cellulare fungevano da controlli negativi. I supernatanti sono stati liberati dalle cellule contaminanti utilizzando la centrifugazione a bassa velocità e la successiva filtrazione per ottenere supernatanti privi di cellule (CFSN) per l'analisi. Dopo l'immunoprecipitazione, l'analisi Western blot è stata eseguita utilizzando anticorpi policlonali di coniglio diretti contro Gag e coniugati secondari anti-coniglio IgG-HRP. Il peso molecolare apparente in kilodalton (kDa) come visibile dal marcatore di peso molecolare (MW) è raffigurato a sinistra. Le frecce indicano la proteina precursore rilevata p55 Gag. (A) Per ciascun campione, la CFSN contenente 100 ng di proteina Gag è stata applicata al saggio di cattura per standardizzare la quantità in ingresso di VLP. La CFSN è stata incubata direttamente con perline rivestite di anticorpi. (B) I pellet VLP sono stati ottenuti mediante ultracentrifugazione della CFSN. Pellet contenenti 100 ng di proteina Gag sono stati applicati al test di cattura utilizzando anticorpi isotipici e bNAb 3. I campioni per bNAb 1 e bNAb 2 contenevano solo 25 ng di Gag. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Prima del test di cattura VLP, valutare la formazione di VLP e l'espressione dell'antigene bersaglio nelle linee cellulari produttrici di VLP. I metodi strumentali sono l'analisi citometrica a flusso dell'espressione della superficie cellulare dell'antigene e l'ELISA antigene e virale specifico della proteina core di CFSN e VLP pellettati.
Le fasi critiche del test di cattura VLP sono il rivestimento delle perline con anticorpi di cattura - qui bNAbs - e la successiva cattura dei VLP antigene-positivi da parte delle perle rivestite di anticorpi. Il successo del rivestimento delle perline con anticorpi dipende dalla scelta della proteina legante le immunoglobuline coniugate (Ig). Le specie donatrici e la classe Ig degli anticorpi determinano se le perle coniugate con proteina G o proteina A sono preferibili. Per la maggior parte delle specie e delle classi di Ig, la proteina G è il ligando di scelta33. In alternativa alle perle coniugate A/G proteiche, sono disponibili perline di streptavidina per il rivestimento con anticorpi biotinilati. Le perline possono anche essere accoppiate covalentemente con anticorpi.
La cattura dei VLP da parte di perline rivestite di anticorpi dipende da una miscelazione accurata, da un tempo di incubazione sufficiente, dall'abbondanza di antigene e dall'affinità dell'anticorpo di cattura. Nella nostra esperienza, la miscelazione accurata delle perle rivestite di anticorpi con i campioni VLP si ottiene al meglio utilizzando volumi > 500 μL in tubi da 1,5 mL in rotazione per almeno 2 ore a temperatura ambiente o 4 °C. Un altro potenziale ostacolo è la quantità troppo bassa di VLP nel campione. Per gli anticorpi che legano fortemente l'antigene bersaglio, gli input VLP a partire da 15 ng di proteina Gag di solito consentono quantità prontamente rilevabili delle proteine del nucleo virale utilizzando l'analisi Western blot. Tuttavia, gli anticorpi a bassa affinità richiedono quantità di input più elevate, ad esempio 100 ng di proteina Gag, per ottenere risultati conclusivi (Figura 3, bNAb 3).
Alcuni antigeni di superficie sono soggetti a degradazione della proteasi. Qui, raccomandiamo l'aggiunta di inibitori della proteasi ai campioni VLP e l'incubazione a 4 °C. L'adesione non specifica delle proteine delle cellule ospiti e dei VLP agli anticorpi legati alle perline è raramente osservata e dovrebbe essere esclusa utilizzando appropriati controlli negativi, come abbiamo dimostrato qui utilizzando campioni VLP finti e calvi e anticorpi di controllo dell'isotipo. Le strategie per ridurre la rilegatura non specifica includono fasi di lavaggio estese e l'aggiunta di caseina nel tampone di lavaggio34. Inoltre, il test di cattura può anche essere migliorato determinando il rapporto ottimale tra anticorpo e quantità di VLP che mostra l'antigene.
Nell'ultima fase del test di cattura VLP, descriviamo l'eluizione dei complessi immunitari dalle perline mediante ebollizione nel ridurre il tampone di Laemmli. Durante questa fase, i VLP vengono smontati e gli anticorpi di cattura e gli antigeni bersaglio vengono separati dalle perline. In particolare, la specie donatrice dell'anticorpo primario utilizzato nella successiva analisi Western blot deve differire dal donatore dell'anticorpo di cattura per evitare il rilevamento involontario dell'anticorpo di cattura da parte degli anticorpi coniugati secondari IgG HRP anti-donatore.
Il test di cattura VLP qui presentato fornisce un metodo facile da usare e sensibile per rilevare epitopi sensibili alla neutralizzazione in antigeni bersaglio strutturali intatti visualizzati su superfici VLP. Tuttavia, il test di cattura non consente la quantificazione diretta dell'epitopo. Gli ELISA eseguiti con bNAbs sono strumentali a tale scopo e dovrebbero essere condotti in parallelo, in particolare se i VLP esaminati sono destinati ad essere utilizzati in studi preclinici che impiegano modelli animali35. Questo è fondamentale, in quanto la quantità di antigene può essere direttamente correlata con l'elicitazione di una risposta anticorpale neutralizzante negli animali immunizzati, come dimostrato per i vaccini contro il circovirus suino di tipo 2 (PCV2)36.
Un vaccino ideale dovrebbe portare all'elicitazione di bNAbs mirati agli epitopi sensibili alla neutralizzazione sulla superficie del virione. L'analisi di questi epitopi, in particolare per quanto riguarda la loro piena integrità strutturale sulla superficie del vaccino contro il particolato, è fondamentale per identificare potenziali candidati vaccini. Questo non è solo il caso dei VLP derivati dall'HIV, ma anche di molti altri vaccini VLP in fase di sviluppo37. Importanti vaccini basati su VLP sono, ad esempio, derivati da virus parentali non avvolti o capside come il papillomavirus umano (HPV). A differenza delle particelle di HIV-1, che sono formate da una sola proteina core strutturale, vale a dire p55 Gag, e avvolte dalla membrana proveniente dalla cellula produttrice di VLP, le particelle di HPV sono costituite da una o due proteine del nucleo strutturale38,39. Allo stesso modo e come presentato qui per i VLP avvolti, il test di cattura VLP può anche essere applicabile al rilevamento di epitopi sensibili alla neutralizzazione di VLP non avvolti.
In alternativa al test di cattura, i campioni VLP possono essere sottoposti direttamente a PAGE nativo seguito da analisi Western blot utilizzando bNAbs e anticorpi secondari appropriati accoppiati a HRP40. Tuttavia, e per l'analisi dei VLP decorati con HIV Env, questo test è meno sensibile in quanto ci si può aspettare solo un basso numero di proteine antigeniche per VLP. Al contrario, il test di cattura facilita il rilevamento delle proteine core abbondanti a grandi quantità per VLP, nel caso di VLP derivate dall'HIV più di 3.500 proteine Gag formano un VLP27. Ciò consente il rilevamento indiretto molto sensibile degli epitopi in Env visualizzati anche a basse densità sui VLP.
Il numero di metodi consolidati per esaminare gli epitopi sensibili alla neutralizzazione negli antigeni di superficie delle VLP è limitato. L'etichettatura degli antigeni visualizzati sui VLP è possibile con coniugati anticorpo-fluoroforo epitopo-specifici e la successiva rilevazione mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA), consentendo il rilevamento e la quantificazione dei VLP. Questo metodo è stato inoltre sviluppato e ottimizzato con successo per gli esosomi che presentano marcatori di superficie cellulare41. Inoltre, la spettroscopia di risonanza plasmonica di superficie (SPR) consente l'analisi delle interazioni tra anticorpi neutralizzanti non coniugati ed epitopi affini presentati su VLP. Sebbene non siano adatti per l'analisi a throughput più elevato, i VLP possono anche essere etichettati con bNAbs accoppiati a particelle d'oro e successivo esame al microscopio elettronico a trasmissione (TEM)42.
In conclusione, il saggio di cattura VLP offre alcuni vantaggi considerevoli: (i) valutazione dell'integrità strutturale degli epitopi sensibili alla neutralizzazione sulla superficie dei VLP, (ii) rilevamento sensibile e indiretto di antigeni anche se visualizzati a basse densità su VLP e (iii) il metodo non richiede apparecchiature analitiche costose.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Ministero federale tedesco dell'Istruzione e della Ricerca, dal programma di finanziamento Forschung an Fachhochschulen, dai numeri di contratto 13FH767IA6 e 13FH242PX6 a JS. Le figure 1 e 2 sono state create con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | ||
| 10x PBS | gibco | 70011044 | |
| 4%–15% Mini-PROTEAN TGX stain-free protein gels | BioRad | 4568085 | |
| Antibodies (bnAbs) | Polymun Scientic | ||
| Isotype control antibody | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 02-7102 | |
| Chemidoc XRS+ imaging system | BioRad | 1708265 | |
| Chicken anti-rabbit IgG HRP-coupled | Life technologies | A15987 | 1:5000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Dynabeads Protein G Immunoprecipitation Kit | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 10007D | includes buffers and washing solutions |
| FreeStyle 293-F cells | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | R790-07 | |
| FreeStyle 293 Expression Medium | invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 12338026 | |
| Gel blotting papers | Whatman | GB005 | |
| Glycine | Carl Roth | 0079 | blotting buffer |
| Magnetic separation rack | New England Biolabs | S1509S | for 12 x 1.5 mL or 6 x 1.5 mL tubes |
| Methanol | Carl Roth | 4627 | blotting buffer |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell electrophoresis system | BioRad | ||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| PageRuler prestained protein ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| Polyvinylidene fluoride (PVDF) syringe filters, 0.45 µm | Carl Roth | KC89.1 | |
| Powdered milk | Carl Roth | T145 | blocking buffer |
| PVDF transfermembrane, 0.45 µm | Carl Roth | T830.1 | |
| QuickTiter HIV p24 ELISA | Cell Biolabs | VPK-108-H | |
| Rabbit polyclonal to HIV1 p55 + p24 + p17 | abcam | ab63917 | 1:2000 in TBS-T + 2 % (w/v) powdered milk |
| Rotator | Heidolph | REAX2 | |
| ROTI Load 1 (laemmli buffer) | Carl Roth | K929.1 | 4x concentrated reducing protein gel loading buffer |
| ROTIPHORESE 10x SDS-PAGE | Carl Roth | 3060 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957 | TBS-T buffer |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34579 | |
| SW28 rotor | Beckman Coulter | ||
| Thermomixer | Cel Media | basic | |
| Trans-Blot Turbo | BioRad | ||
| Trehalose dihydrate | Carl Roth | 8897.2 | |
| TRIS | Carl Roth | 5429 | blotting buffer |
| TRIS hydrochloride | Carl Roth | 9090 | TBS-T buffer |
| Tween-20 | Carl Roth | 9127 | TBS-T buffer |
| Ultra Clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 |
References
- Roldão, A., Mellado, M. C. M., Castilho, L. R., Carrondo, M. J. T., Alves, P. M.
- Noad, R., Roy, P.
- Qian, C., et al. Recent progress on the versatility of virus-like particles. Vaccines. 8 (1), 139 (2020).
- Zabel, F., Kündig, T. M., Bachmann, M. F. Virus-induced humoral immunity: On how B cell responses are initiated. Current Opinion in Virology. 3 (3), 357-362 (2013).
- Garg, H., Mehmetoglu-Gurbuz, T., Joshi, A. Virus Like Particles (VLP) as multivalent vaccine candidate against Chikungunya, Japanese Encephalitis, Yellow Fever and Zika Virus. Scientific Reports. 10 (1), 4017 (2020).
- Hodgins, B., Pillet, S., Landry, N., Ward, B. J. A plant-derived VLP influenza vaccine elicits a balanced immune response even in very old mice with co-morbidities. PLoS ONE. 14 (1), 0210009 (2019).
- Lai, C. C., et al. Process development for pandemic influenza VLP vaccine production using a baculovirus expression system. Journal of Biological Engineering. 13, 78 (2019).
- Caldeira, J. C., Perrine, M., Pericle, F., Cavallo, F. Virus-like particles as an immunogenic platform for cancer vaccines. Viruses. 12 (5), 488 (2020).
- Nika, L., et al. An HER2-displaying virus-like particle vaccine protects from challenge with mammary carcinoma cells in a mouse model. Vaccines. 7 (2), 41 (2019).
- Mohsen, M. O., Zha, L., Cabral-Miranda, G., Bachmann, M. F. Major findings and recent advances in virus-like particle (VLP)-based vaccines. Seminars in Immunology. 34, 123-132 (2017).
- Fontana, D., Garay, E., Cevera, L., Kratje, R., Prieto, C., Gòdia, F. Chimeric VLPs based on hiv-1 gag and a fusion rabies glycoprotein induce specific antibodies against rabies and foot-and-mouth disease virus. Vaccines. 9 (3), 251 (2021).
- Cervera, L., et al. Production of HIV-1-based virus-like particles for vaccination: achievements and limits. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (18), 7367-7384 (2019).
- Gonelli, C. A., King, H. A. D., Mackenzie, C., Sonza, S., Center, R. J., Purcell, D. F. J. Immunogenicity of HIV-1-based virus-like particles with increased incorporation and stability of membrane-bound env. Vaccines. 9 (3), 1-36 (2021).
- Trkola, A. HIV not as simple as one, two, three. Nature. 568, 321-322 (2019).
- Berman, P. W., et al. Protection of chimpanzees from infection by HIV-1 after vaccination with recombinant glycoprotein gp120 but not gp160. Nature. 345 (6276), 622-625 (1990).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455 (7213), 613-619 (2008).
- DeCaprio, J., Kohl, T. O. Immunoprecipitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (11), 449-461 (2020).
- Barret, B., Wood, P. A., Volwiler, W. Quantitation of gamma globulins in human serum by immunoprecipitation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 55, 605-615 (1960).
- Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 424, Clifton, N.J. 349-364 (2008).
- Lee, S. H., Chu, K. B., Kang, H. J., Quan, F. S. Virus-like particles containing multiple antigenic proteins of Toxoplasma gondii induce memory T cell and B cell responses. PLoS ONE. 14 (8), 0220865 (2019).
- Lee, Y. T., et al. Intranasal vaccination with M2e5x virus-like particles induces humoral and cellular immune responses conferring cross-protection against heterosubtypic influenza viruses. PLoS ONE. 13 (1), 0190868 (2018).
- Wang, J., et al. Large-scale manufacture of VP2 VLP vaccine against porcine parvovirus in Escherichia coli with high-density fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (9), 3847-3857 (2020).
- Swenson, D. L., et al. Generation of Marburg virus-like particles by co-expression of glycoprotein and matrix protein. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (1), 27-31 (2004).
- Latham, T., Galarza, J. M. Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. Journal of Virology. 75 (13), 6154-6165 (2001).
- Doyle, J., Ray, M., Ouyang, A., Benton, B., Bell, P. A. Abstract 4877: High throughput proteomic applications using protein A/G magnetic beads. Association for Cancer Research (AACR) 102nd Annual Meeting. 20, 4877 (2011).
- Zhu, P., et al. Electron tomography analysis of envelope glycoprotein trimers on HIV and simian immunodeficiency virus virions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (26), 15812-15817 (2003).
- Lavado-García, J., Jorge, I., Boix-Besora, A., Vázquez, J., Gòdia, F., Cervera, L. Characterization of HIV-1 virus-like particles and determination of Gag stoichiometry for different production platforms. Biotechnology and Bioengineering. 118 (7), 2660-2675 (2021).
- Miura, K. An overview of current methods to confirm protein-protein interactions. Protein & Peptide Letters. 25 (8), 728-733 (2018).
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Advances in molecular techniques to study diversity. Plant Biotechnology, Volume 1: Principles, Techniques, and Applications. , 341-365 (2017).
- Rosengarten, J. F., Schatz, S., Wolf, T., Barbe, S., Stitz, J. Components of a HIV-1 vaccine mediate virus-like particle (VLP)-formation and display of envelope proteins exposing broadly neutralizing epitopes. Virology. , 41-48 (2022).
- JoVE, JoVE. Grundlegende Methoden in der Zell- und Molekularbiologie. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359 (2010).
- Sheng, S., Kong, F. Separation of antigens and antibodies by immunoaffinity chromatography. Pharmaceutical Biology. 50 (8), 1038-1044 (2012).
- Guzzo, C., et al. Virion incorporation of integrin 47 facilitates HIV-1 infection and intestinal homing. Science Immunology. 2 (11), (2017).
- Wei, M., et al. Bacteria expressed hepatitis E virus capsid proteins maintain virion-like epitopes. Vaccine. 32 (24), 2859-2865 (2014).
- Jin, J., Park, C., Cho, S. H., Chung, J. The level of decoy epitope in PCV2 vaccine affects the neutralizing activity of sera in the immunized animals. Biochemical and Biophysical Research Communications. 496 (3), 846-851 (2018).
- Zhang, X., et al. Lessons learned from successful human vaccines: Delineating key epitopes by dissecting the capsid proteins. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 11 (5), 1277-1292 (2015).
- DiGiuseppe, S., Bienkowska-Haba, M., Guion, L. G. M., Keiffer, T. R., Sapp, M. Human papillomavirus major capsid protein L1 remains associated with the incoming viral genome throughout the entry process. Journal of Virology. 91 (16), 00537 (2017).
- Wang, J. W., Roden, R. B. S.
- Binley, J. M., et al. Profiling the specificity of neutralizing antibodies in a large panel of plasmas from patients chronically infected with human immunodeficiency virus type 1 subtypes B and C. Journal of Virology. 82 (23), 11651-11668 (2008).
- Thane, K. E., Davis, A. M., Hoffman, A. M. Improved methods for fluorescent labeling and detection of single extracellular vesicles using nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 9 (1), 12295 (2019).
- Mulder, A. M., et al. Toolbox for non-intrusive structural and functional analysis of recombinant VLP based vaccines: A case study with hepatitis B vaccine. PLoS ONE. 7 (4), 0033235 (2012).
