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Methodenartikel

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

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DOI:

10.3791/63158

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30. September 2021

 ,  ,  ,  , 
1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt einen Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Speicheldrüsen-Sporozoiten in Mücken. Unter Verwendung leicht verfügbarer monoklonaler Antikörper ermöglicht die Methode einen kostengünstigen Hochdurchsatznachweis von Mücken, die Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax tragen. Die Methode eignet sich für die Erforschung der Malariaübertragung, einschließlich Vektoruntersuchungen.

Zusammenfassung

Plasmodium Sporozoiten sind das infektiöse Stadium von Malariaparasiten, die den Menschen infizieren. Die Sporozoiten, die sich in den Speicheldrüsen weiblicher Anopheles-Mücken befinden, werden bei der Blutfütterung über Mückenstiche auf den Menschen übertragen. Das Vorhandensein von Sporozoiten in den Speicheldrüsen der Mücke definiert somit die Infektiosität der Mücke. Um festzustellen, ob eine Anopheles-Mücke Plasmodium-Sporozoiten trägt, war die ELISA-Methode (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) das Standardwerkzeug zum Nachweis des Plasmodium circumsporozoit-Proteins (CSP), dem wichtigsten Oberflächenprotein der Sporozoiten. Bei dieser Methode wird der Kopf zusammen mit dem Thorax jeder Mücke vom Abdomen getrennt, homogenisiert und einem Sandwich-ELISA unterzogen, um das Vorhandensein von CSP nachzuweisen, das spezifisch für Plasmodium falciparum und jeden der beiden Subtypen VK210 und VK247 von Plasmodium vivax ist. Diese Methode wurde verwendet, um die Übertragung von Malaria zu untersuchen, einschließlich der saisonalen Dynamik der Mückeninfektion und der Spezies der wichtigsten Malariavektoren in den Untersuchungszentren.

Einleitung

Plasmodium Sporozoiten sind das infektiöse Stadium der Malariaparasiten in den Mücken. Die Sporozoiten werden über Mückenstiche auf den Menschen übertragen. In der Mücke bilden sich die Sporozoiten zunächst im Inneren der Oozysten an der Mitteldarmwand. Sobald sie fertig sind, werden sie in das Hämocoel abgegeben und wandern zu den Speicheldrüsen der Mücke. Dort reifen sie heran und sind bereit für die Übertragung auf den Menschen während der Blutfütterung. Beim Menschen lagern sich die Sporozoiten in der Dermis ab. Dann gelangen sie in das Blutgefäß und wandern entlang des Blutkreislaufs, um die Leber zu erreichen, um eine Infektion in den Hepatozyten zu etablieren 1,2.

Drei verschiedene Methoden wurden verwendet, um eine Sporozoiteninfektion der Speicheldrüsen der Mücke zu bestimmen. Die erste Methode ist die Dissektion der Speicheldrüsen mit anschließender direkter Untersuchung der Sporozoiten unter einem Lichtmikroskop. Diese Methode ist der Goldstandard zum Nachweis und zur Quantifizierung von Sporozoiten in den Speicheldrüsen der Anopheles-Mücke 3. Es erfordert jedoch einen Techniker, der sowohl in der Präparierung als auch in der mikroskopischen Untersuchung gut ausgebildet ist. Darüber hinaus kann es nicht zur Bestimmung von Plasmodium-Spezies und CSP-Subtypisierung (für P. vivax) verwendet werden4,5. Die zweite Methode verwendet die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um Plasmodium-DNA im oberen Teil des Mückenkörpers nachzuweisen6. Aufgrund der Spezifität der PCR sind sowohl eine Spezies als auch eine Subtypisierung des Parasiten möglich 7,8,9,10. PCR wird zwar zunehmend eingesetzt, erfordert aber relativ teure Geräte und gut ausgebildetes Personal. Die letzte Methode, der ELISA zum Nachweis des Plasmodium-spezifischen Circumsporozoiten-Proteins (CSP), ist seit drei Jahrzehnten die Hauptstütze 11,12,13. CSP ist sowohl in Oozystensporozoiten als auch in Speicheldrüsensporozoiten vorhanden12,14. Unter Verwendung spezifischer Antikörper ermöglicht diese Methode die Identifizierung von Plasmodium-Spezies und die CSP-Subtypisierung von P. vivax-Sporozoiten. Der Grund für diesen Assay ist die Notwendigkeit eines einfachen Hochdurchsatz-Assays zur Untersuchung einer großen Anzahl wilder Mücken, um die Malariaübertragung zu verstehen (d. h. die Infektionsrate der Sporozoiten zu bestimmen).

Die ELISA-Methode hat gegenüber der mikroskopischen Untersuchung zwei entscheidende Vorteile. Erstens ermöglicht es den Forschern, Mückenproben aufzubewahren, bis sie für die Probenverarbeitung bereit sind. Zweitens kann die ELISA-Methode zur Differenzierung von Plasmodium-Spezies durch speziesspezifische monoklonale Antikörper verwendet werden. Darüber hinaus kann der ELISA eine größere Anzahl von Mückenproben aufnehmen, was einen viel höheren Durchsatz ermöglicht15. Im Vergleich zur PCR, bei der Sporozoiten-DNA nachgewiesen wird, nimmt das ELISA-Verfahren mehr Zeit in Anspruch, kostet aber weniger16. Der hier beschriebene ELISA-Assay wurde entwickelt, um die Infektiosität von Mücken zu bestimmen und CSP von P. falciparum und jede der beiden CSP-Varianten von P. vivax, VK210 und VK247, separat nachzuweisen. Diese ELISA-Methode wurde in vielen Studien verwendet, um die saisonale Dynamik der Mückeninfektion zu bestimmen und die Spezies der wichtigsten Malariavektoren im Feld zu identifizieren 12,13,17,18. Für die Durchführung dieses Assays ist ein Standardlabor, das mit einem ELISA-Plattenlesegerät ausgestattet ist, ausreichend.

Der Gesamtansatz ist in Abbildung 1 zusammengefasst. Bei diesem Sandwich-ELISA wird zunächst der primäre (Capture) monoklonale Antikörper (mAb), der für jede Plasmodium-Spezies /jeden Subtyp spezifisch ist, zur Beschichtung der ELISA-Platte verwendet. Jede Platte ist mit einem einzelnen Capture-mAb beschichtet. Die Funktion des mAb besteht darin, das entsprechende CSP-Antigen in den Mückenhomogenaten einzufangen. Nach dem Antigen-Capture und den Plattenwaschungen wird ein zweiter CSP-spezifischer Antikörper, der mit Peroxidase markiert ist, verwendet, um das Vorhandensein von CSP nachzuweisen, das an den Capture-mAb gebunden ist. Die chemische Reaktion, die durch Peroxidase katalysiert wird, führt zu einer Farbentwicklung in Vertiefungen, die für CSP positiv sind.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Geräte, Reagenzien und anderen Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendet werden, und in Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Lösungen und ihrer Zusammensetzung.

  1. Capture und Peroxidase-konjugierte mAbs
    1. Um den mAb zu rekonstituieren, resuspendieren Sie den lyophilisierten mAb in einer 1:1-Mischung aus destilliertem Wasser:Glycerin bei 0,5 mg/ml. Bei Bedarf aliquote herstellen, um wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden, und bei -20 °C lagern.
  2. Blockierender Puffer (BB)
    1. Bereiten Sie den Blockierungspuffer vor, indem Sie 5 g ELISA-Casein in 100 mL 0,1 N NaOH auflösen. Fügen Sie 900 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu (siehe Tabelle 1), um das endgültige Volumen auf 1,0 l zu erhöhen.
    2. Fügen Sie 0,02 g Phenolrot als Indikator hinzu und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein. Lagern Sie BB bis zu einer Woche bei 4 °C oder aliquotieren Sie es in 50 mL für die Langzeitlagerung bei -20 °C.
  3. Positivkontrollen
    1. Um die Positivkontrollen zu rekonstituieren, rehydrieren Sie die lyophilisierten Proteine durch Zugabe von 1.000 μl BB. Die Stamm-Positivkontrolllösungen werden nach Bedarf aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
    2. Bei serieller Verdünnung wird jede Positivkontrolle wie folgt auf die endgültige Arbeitskonzentration in BB weiter verdünnt: Pf, 2 pg/μl; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 pg/μL.
      HINWEIS: Die genauen Konzentrationen der Positivkontrollen können von Charge zu Charge variieren. Konsultieren Sie das Produktinformationsblatt für die genaue erforderliche Konzentration. Die Positivkontrollkonzentrationen, ausgehend von der obigen Arbeitskonzentration, betragen 2, 1, 0,5, 0,25, 0,13, 0,06 pg/μl für Pf; 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μl für PV210; und 89, 45, 22, 11, 5,6, 2,8 pg/μL PV247.
  4. Negative Kontrollen
    HINWEIS: Die ideale Negativkontrolle ist das Kopf-Thorax-Homogenat weiblicher Anopheles-Mücken, das identisch mit den Testproben hergestellt wurde. BB kann aber auch als Negativkontrolle verwendet werden.
    1. Mit BB als Negativkontrolle verwenden Sie die 2-fache Absorptionsschwelle für zuverlässige positive Messwerte.

2. Vorbereitung der Mückenprobe

  1. Trennen Sie den Kopf und den Brustkorb jeder gesammelten erwachsenen Mücke mit einer sterilen Rasierklinge vom Bauch. Legen Sie den Kopf und den Thorax in ein vorbeschriftetes 1,5-ml-Zentrifugenmahlröhrchen. Poolköpfe und Thoracen von bis zu 10 Mücken, falls gewünscht.
    HINWEIS: Für die Probenvorbereitung wird in der Regel die Speicheldrüse einer infizierten Mücke präpariert und CS-ELISA unterzogen. Der Kopf und der Thorax gesammelter Mücken können jedoch auch direkt zur Durchführung von CS-ELISA verwendet werden (ohne Präparierung für Speicheldrüsen)12,13,19.
  2. Geben Sie 50 μl Mahlpuffer (GB) in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie die Probe mit einem sauberen Stößel (mit Seife gewaschen). Spülen Sie den gebrauchten Stößel mit 250 μl GB in das Röhrchen mit der homogenisierten Mücke(n) bis zu einem Endvolumen von ~300 μl.
  3. Bewahren Sie die Probe bis zur Verwendung in einem Gefrierschrank (-20 °C) auf oder fahren Sie sofort mit der Durchführung der ELISA fort.

3. Sporozoit-ELISA

  1. Füllen Sie das Sporozoiten-ELISA-Arbeitsblatt aus (siehe Zusatzmaterial 1). Bereiten Sie eine ELISA-Platte für jeden CSP (Pf, Pv-210 oder Pv-247) vor.
  2. Bereiten Sie die mAb-Arbeitslösung vor, indem Sie den Antikörper in PBS auflösen: 4 μg/mL Pf; 2 μg/ml Pv-210; 2 μg/ml Pv-247. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina basierend auf der Zugabe von 5 mL pro Platte. Wirbeln Sie die Lösung vorsichtig ein.
  3. Pipettieren Sie 50 μl jeder mAb-Arbeitslösung aus Schritt 3.2 in jede Vertiefung der ELISA-Platte. Decken Sie die Platte mit einem Plastikdeckel ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten oder über Nacht bei Raumtemperatur.
  4. Saugen Sie den Inhalt der Vertiefung ab und klopfen Sie die Platte mindestens 5 Mal kopfüber auf Küchenpapier, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen.
    HINWEIS: Wenn kein Absaugsystem (Mehrkanal-Vakuumabsaugung, die an saubere Spitzen angeschlossen ist) verfügbar ist, schütten Sie die Antikörper in das Waschbecken und klopfen Sie dann auf die Platte auf Papiertücher.
  5. Fügen Sie 200 μl BB hinzu, um alle Vertiefungen in der Platte zu füllen. Decken Sie den Teller mit einem Plastikdeckel ab. Inkubieren Sie die Platte 1 h lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Bohrlochinhalt an oder kippen Sie ihn aus. Klopfen Sie den Teller kopfüber 5 Mal auf Küchenpapier, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen.
  6. Laden Sie das Mückenhomogenat und die Steuerung wie folgt auf die Platte.
    1. 50 μl der Positivkontrolle werden in die Vertiefungen H1 und H2 gegeben.
    2. Geben Sie 50 μl BB in die Vertiefungen in den Spalten 1 und 2 von Reihe C bis G. Geben Sie dann 50 μl der Positivkontrolle in die Vertiefungen G1 und G2. Die Positivkontrolle wird seriell verdünnt, beginnend mit G1 und G2, gefolgt von F1 und F2 bis C1 und C2.
      HINWEIS: Alle positiven Kontrollvertiefungen sollten 50 μl enthalten.
    3. Geben Sie 50 μl BB (Negativkontrolle) in die Vertiefungen A1, A2, B1 und B2.
    4. Geben Sie 50 μl jeder Homogenatprobe in eine Vertiefung mit unbekannter (Unk).
    5. Die Platte abdecken und 2 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  7. Nach ca. 2 h beginnen Sie mit der Vorbereitung der Untergründe. Für das ABTS Substrat 2-Komponenten-Kit mischen Sie Substrat A und Substrat B im Verhältnis 1:1.
    HINWEIS: Für eine vollständige 96-Well-Platte sind 5 mL Substrat A und 5 mL Substrat B erforderlich.
  8. Bereiten Sie die Arbeitslösungen von Peroxidase-markierten mAbs für Pf, Pv-210 und Pv-247 vor, indem Sie BB zum rekonstituierten konjugierten mAb hinzufügen, um eine Arbeitskonzentration von 1 μg/ml zu erhalten.
    1. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina basierend auf der Zugabe von 5 mL konjugierter mAb-Arbeitslösung pro Platte.
    2. Die Peroxidaseaktivität wird getestet, indem 5 μl des in Schritt 3.8 hergestellten Peroxidase-markierten mAb mit 100 μl des in Schritt 3.7 hergestellten Substrats in einem separaten 1,5-ml-Röhrchen gemischt werden. Sanft vortexen.
      HINWEIS: Es sollte einen schnellen Farbwechsel von klar zu grün geben, was darauf hinweist, dass das Peroxidase-Enzym und die Substrate wirken.
  9. Saugen Sie den Brunneninhalt an oder kippen Sie ihn ab und klopfen Sie die Platte 5 Mal kopfüber auf Küchenpapier, um die gesamte Flüssigkeit zu entfernen.
  10. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit 200 μl PBS-Tween, saugen Sie den Vertiefungsinhalt an und klopfen Sie jeweils 5 Mal auf die Platte.
  11. Geben Sie 50 μl Peroxidase-markierten mAb, der in Schritt 3.8 hergestellt wurde, in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln. Aspirieren oder kippen Sie den Brunneninhalt und klopfen Sie die Platte kopfüber 5 Mal auf ein Papiertuch.
  12. Waschen Sie die Vertiefungen 3 Mal mit 200 μl PBS-Tween, saugen Sie den Vertiefungsinhalt an und klopfen Sie jeweils 5 Mal auf die Platte.
  13. 100 μl der in Schritt 3.7 hergestellten Substratlösung werden in jede Vertiefung gegeben. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  14. Nach 30 Minuten wird die Extinktion bei 405-414 nm mit einem ELISA-Platten-Reader abgelesen.
    HINWEIS: Befolgen Sie die spezifischen Anweisungen für den verwendeten ELISA-Plattenleser. Einzelheiten zu den Anweisungen für die Software, die für dieses Protokoll verwendet wird, finden Sie im Zusatzmaterial S2. In den Positivkontrollvertiefungen sollte es zu einer deutlichen Farbänderung von klar zu grün kommen.

4. Analyse

  1. Erkennung positiver Proben.
    1. Proben mit Absorptionswerten oberhalb des Cutoffs (das Doppelte des mittleren Absorptionswerts der negativen Proben) sind als positiv zu kennzeichnen.
  2. Quantifizierung von CSP
    1. Die CSP-Konzentration in der Probe ist unter Verwendung der Standardkurve, die aus der Kontrollverdünnungsreihe erstellt wurde, wie folgt zu schätzen.
      1. Erstellen Sie die Standardkurve, indem Sie die Absorptionswerte (y-Achse) der seriell verdünnten Kontrollen gegen ihre Konzentrationen (x-Achse) darstellen.
      2. Führen Sie eine lineare Regression durch, um die beste Anpassung mit y = A + Bx zu bestimmen, wobei A und B freie Parameter sind.
      3. Bestimmen Sie die CSP-Konzentration für jede positive Probe, indem Sie die Gleichung für einen gegebenen Absorptionswert lösen.

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Ergebnisse

Repräsentative ELISA-Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Experiment konnte der P. falciparum ELISA eine Sporozoiteninfektion in Vertiefung A7 nachweisen. Die positive Vertiefung konnte visuell an ihrer schwachen grünen Farbe erkannt werden (Abbildung 2A). Der Absorptionswert dieser Vertiefung lag über der Cut-off-Schwelle (doppelt so hoch wie der Mittelwert der vier negativen Kontrollbrunnen) (Abbildung 2B...

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Diskussion

Der CSP-ELISA bietet eine hochspezifische und kostengünstige Methode zum Nachweis von Plasmodium CSP. Es ermöglicht die Unterscheidung zwischen P. falciparum und P. vivax Sporozoiten sowie zwischen den beiden Subtypen VK210 und VK247 von P vivax11,13,14,15. Bestimmte kritische Punkte sollten beachtet werden, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu e...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Danksagungen

Wir danken Herrn Kirakorn Kiatibutr, MVRU, für die Schulung und Anleitung. Wir danken auch Frau Pinyapat Kongngen, MVRU, für ihre technische Unterstützung bei der Erstellung von Abbildung 2. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des National Institute for Allergy and Infectious Diseases und des National Institute of Health (U19 AI089672) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EquipmentELISA
PlattenleserBioTek Instrument, Inc.Synergy H1Extinktion wird mit dem UV-VIS-Absorptionsdetektionsmodus gemessen
Stößel für das ZerkleinerungswerkAxygenPES-15-B-SIZur Homogenisierung des Mückenkopfes/Thorax
ReagenzienABTS-Substrats
2-Komponenten-SubstratKPL50-62-00Für die peroxidasegesteuerte Detektion
Blockierungspuffer (BB)Hinweis: Lösung
Capture und Peroxidase-konjugierte monoklonale Antikörper (mAbs)Hinweis: mAbs können in lyophilisierter Form als Teil der Sporozoit-ELISA-Reagenzien-Kits (MRA-890 für P. falciparum und MRA-1028K für P. vivax) von BEI Resources (https://www.beiresources.org.)
CaseinSigma aldrich9000-71-9Zum Blockieren
Puffervorbereitung Schleifpuffer (GB)Hinweis: Lösung
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1Zur Aufbereitung des Schleifpuffers
KClSigma aldrich7447-40-7Zur Zubereitung von Phosphatpuffer Kochsalzlösung
KH2PO4 Sigma aldrich7778-77-0Für die Phosphatpuffer-Kochsalzaufbereitung
Na2HPO4Sigma aldrich7558-79-4Für die Phosphatpuffer-Kochsalzaufbereitung
NaClSigma aldrich7647-14-5Für die Phosphatpuffer-Kochsalzaufbereitung
NaOHSigma aldrich1310-73-2Für die Blockierung der Pufferzubereitung
PBS-Tween
Pf-Capture mAbCDCPf-CAPZum Einfangen von Pf Circumsporozoit-Protein
Pf Peroxidase mAbCDCPf-HRPZum Nachweis von Pf Circumsporozoit-Protein
Pf PositivkontrolleCDCPf-PCPf Positivkontrolle
PhenolrotSigma aldrich143-74-8Zum Blockieren der Puffervorbereitung
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Hinweis: Lösung
PositivkontrollenHinweis: Lösung
Pv210 Capture mAbCDCPv210-CAPZum Capture von Pv210 Circumsporozoit-Protein
Pv210 Peroxidase mAbCDCPv210-HRPZum Nachweis von Pv210 Circumsporozoit-Protein
Pv210 PositivkontrolleCDCPv210-PCPv210-Positivkontrolle
Pv247-Capture-mAbCDCPv247-CAPZum Erfassen von Pv247-Circumsporozoit-Protein
Pv247-Peroxidase mAbCDCPv247-HRPZum Nachweis von Pv247-Circumsporozoit-Protein
Pv247-PositivkontrolleCDCPv247-PCPv247-Positivkontrolle
Tween20Sigma aldrich9005-64-5Für die PBS-Tween-Vorbereitung
Verbrauchsmaterialien
Einweg-PipettierbehälterGenerischFür Arbeitsreagenzien
ELISA-Platten: 96 Well mit rundem Boden PVSCorning Life Science2797Für ELISA-Handschuhe
: Einweghandschuhe und GefrierhandschuheGenerikaFür den persönlichen Schutz
LaborkittelGenerischfür den persönlichen Schutz
Mehrkanalpipette P30-300GenerischFür den Lösungstransfer
Pipettensatz, P2, P20, P200 und P1000GenerischFür den Lösungstransfer
Pipettenspitzen 10 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1000 µ LGenerikaFür den Lösungstransfer
Serologische Pipetten 5 mL, 10 mLGenerikaFür den Lösungstransfer
TransferpipettenGenerischFür den Lösungstransfer
Die der

Referenzen

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Schlagwörter

Nachweis von Plasmodium SporozoitenCircumsporozoit ProteinSandwich ELISASpeicheldr sen von M ckenspeziesspezifische Antik rperMalaria bertragungStandardkurvePCR Best tigung
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