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Methodenartikel

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

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DOI:

10.3791/63166

⸱

10. Februar 2022

 , 
1Biomedical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2DBT-AIST International Laboratory for Advanced Biomedicine, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Zusammenfassung

Während Zebrafische eine überlegene Fähigkeit haben, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren, hat Medaka eine geringere ZNS-Regenerationsfähigkeit. Es wurde ein Hirnverletzungsmodell im adulten optischen Tectum von Zebrafischen und Medaka entwickelt und vergleichende histologische und molekulare Analysen wurden durchgeführt, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die hohe Regenerationsfähigkeit dieses Gewebes bei diesen Fischarten regulieren. Hier wird ein Stichwundenmodell für das adulte optische Tectum unter Verwendung einer Nadel und histologischer Analysen zur Proliferation und Differenzierung der neuralen Stammzellen (NSCs) vorgestellt. Eine Nadel wurde manuell in den zentralen Bereich des optischen Tectums eingeführt, und dann wurden die Fische intrakardial perfundiert und ihre Gehirne wurden seziert. Diese Gewebe wurden dann kryosektioniert und mittels Immunfärbung gegen die entsprechenden NSC-Proliferations- und Differenzierungsmarker bewertet. Dieses Tectum-Verletzungsmodell liefert robuste und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka, so dass die NSC-Reaktionen nach einer Verletzung verglichen werden können. Diese Methode ist für kleine Teleosten wie Zebrafische, Medaka und afrikanische Killifische verfügbar und ermöglicht es uns, ihre Regenerationsfähigkeit zu vergleichen und einzigartige molekulare Mechanismen zu untersuchen.

Einleitung

Zebrafische (Danio rerio) haben im Vergleich zu anderen Säugetieren eine erhöhte Fähigkeit, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren 1,2,3. Um die molekularen Mechanismen, die dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, besser zu verstehen, wurden kürzlich vergleichende Analysen der Geweberegeneration mit Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt 4,5,6. Die Gehirnstrukturen bei Zebrafischen und Tetrapoden sind sehr unterschiedlich 7,8,9. Dies bedeutet, dass mehrere Hirnverletzungsmodelle mit kleinen Fischen mit ähnlichen Gehirnstrukturen und biologischen Merkmalen entwickelt wurden, um die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erleichtern, die zu dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit beitragen.

Darüber hinaus ist Medaka (Oryzias latipes) ein beliebtes Labortier mit einer geringen Kapazität für die Herz- und neuronale Regeneration10,11,12,13 im Vergleich zu Zebrafischen. Zebrafische und Medaka haben ähnliche Gehirnstrukturen und Nischen für adulte neurale Stammzellen (NSCs)14,15,16,17. Im Zebrafisch und in der Medaka umfasst das optische Tectum zwei Arten von NSCs, neuroepithelähnliche Stammzellen und radiale Gliazellen (RGCs)15,18. Eine Stichwundenverletzung für das optische Tectum von erwachsenen Zebrafischen wurde zuvor entwickelt, und dieses Modell wurde verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Gehirnregeneration bei diesen Tieren regulieren 19,20,21,22,23. Dieses junge, erwachsene Zebrafisch-Stichverletzungsmodell induzierte eine regenerative Neurogenese aus RGCs 19,24,25. Diese Stichwundenverletzung im optischen Tectum ist eine robuste und reproduzierbare Methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Wenn das gleiche Verletzungsmodell auf adulte Medaka angewendet wurde, wurde die geringe neurogene Kapazität von RGCs im Medaka Optic Tectum durch die vergleichende Analyse der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach der Verletzung13 aufgedeckt.

Stichwundenverletzungsmodelle im optischen Tectum wurden auch in Mummichog-Modellen26 entwickelt, aber Details der Tectumverletzung wurden im Vergleich zur telenzephalen Verletzung27 nicht gut dokumentiert. Die Stichwundenverletzung im optischen Tectum mit Zebrafisch und Medaka ermöglicht die Untersuchung der differentiellen zellulären Reaktionen und der Genexpression zwischen Arten mit unterschiedlicher Regenerationsfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Stichwunde im optischen Tectum mit einer Injektionsnadel durchgeführt wird. Diese Methode kann auf kleine Fische wie Zebrafische und Medaka angewendet werden. Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die histologische Analyse und die zelluläre Proliferations- und Differenzierungsanalyse mittels fluoreszierender Immunhistochemie und Kryosektionen werden hier erläutert.

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Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology genehmigt. Zebrafische und Medaka wurden nach Standardverfahren gehalten28.

1. Stichwundenverletzung im erwachsenen optischen Tectum

  1. Bereiten Sie eine 0,4% (w/v) Tricain-Stammlösung für die Anästhesie vor. Für eine 100-ml-Stammlösung werden 400 mg Tricainmethansulfonat (siehe Materialtabelle) in 90 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) auf 7,0 eingestellt. Sobald der pH-Wert eingestellt ist, fügen Sie Wasser bis zu 100 ml hinzu, stellen Sie dann geeignete Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
  2. Um den erwachsenen Zebrafisch oder Medaka zu betäuben, bereiten Sie eine 0,02 %ige (w/v) Tricain-Lösung vor, indem Sie die 0,4 %ige Tricain-Stammlösung mit Fischwasser verdünnen.
  3. Betäuben Sie den Fisch mit 0,02% iger Tricainlösung; Sie werden betäubt, wenn sie sich nicht bewegen oder auf Berührung reagieren (1-2 min).
  4. Legen Sie den betäubten Fisch auf eine Styroporschale (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-G-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden.
  5. Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie vertikal eine 30-G-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectum-Hemisphären ein (Abbildung 1A, B). Die Einstecktiefe beträgt ~0,75 mm und entspricht damit fast der halben Länge der 30-G-Fase. Diese Einstichtiefe führt aufgrund der ähnlichen Körpergröße dieser Fische zu Hirnverletzungen bei Zebrafischen und Medaka.
    HINWEIS: Medaka hat Schuppen auf dem Schädel. Kratzen und entfernen Sie die Schuppen mit der 30-G-Nadel, um die Stichwunde effizient und genau zu induzieren (Abbildung 1C).
  6. Bringen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischwasser und bringen Sie das Aquarium in das Fischzuchtsystem, sobald sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
    HINWEIS: Die Fische erholen sich und beginnen sich innerhalb weniger Minuten frei zu bewegen.
  7. Für die Abstammungsanalyse nach der Verletzung bereiten Sie frisches Fischwasser mit 5 mM Bromdesoxyuridin (BrdU) vor (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Fische dann mit dieser 5 mM BrdU-Lösung für eine vorbestimmte Zeitspanne13,19 (wie durch ein Versuchsdesign bestimmt). Dann sezieren Sie diese Fische gemäß Schritt 2 und bewerten Sie gegebenenfalls den BrdU-Einbau und die Identität der Zelllinie.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für die Analyse der Zelllinie. Um BrdU-Signale zu erkennen, führen Sie den Antigenabruf wie in Schritt 4.3 gezeigt durch.

2. Dissektion des Gehirns

  1. Bereiten Sie eine 0,02%ige Tricainlösung, eine Styroporschale zur Dissektion und eine 10-ml-Spritze mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) mit einem Verlängerungsschlauch und 30 G-Nadeln (siehe Materialtabelle) für die intrakardiale Perfusion vor.
  2. Betäuben Sie die verletzten Fische zu ausgewählten Zeitpunkten.
  3. Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale und legen Sie den betäubten Fisch auf die Papiertücher.
  4. Halten Sie den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-G-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen (Abbildung 2A).
  5. Machen Sie einen ventralen Schnitt vom Anus zum Herzen (Abbildung 2B) und halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite dieses Organs zwei weitere 30-G-Nadeln einführen (Abbildung 2C).
    HINWEIS: Das Herz ist sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka mit der silbrigen Epithelschicht der Hypodermis bedeckt (Abbildung 2C).
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Silberepithelschicht mit der Spitze der Pinzette (Abbildung 2D).
  7. Führen Sie die 30-G-Nadel unter Beibehaltung der Abschrägung in den Ventrikel ein und machen Sie mit der Pinzette einen Schnitt in den Vorhof (Abbildung 2E). Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um das 1x PBS zu drücken, und bestätigen Sie, dass der Vorhof das Blut gespült hat.
    HINWEIS: Um zu verhindern, dass die Nadel in den Ventrikel eindringt, führen Sie die Nadel vorsichtig bis zur Tiefe der halben Fase ein und stellen Sie dann die Einstichtiefe ein. Wenn die Perfusion gut ist, färben sich die Kiemen weiß (Abbildung 2F,G).
  8. Stoppen Sie die Perfusion, nachdem das Blut abgelassen wurde und die Kiemen weiß werden.
  9. Entfernen Sie die Nadeln, mit denen der Fischkörper fixiert ist, und fixieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten (Abbildung 2H). Schneiden Sie das Rückenmark ab und entfernen Sie den Schädel aus dem optischen Tectum und dem Telencephalon (Abbildung 2I). Schneiden Sie dann die Sehnerven ab und sezieren Sie das Gehirn vorsichtig.
    HINWEIS: Achten Sie während der Dissektion auf die Sehnerven, da die Nerven mit dem Tectum verbunden sind. Wenn der Sehnerv gezogen wird, kann das optische Tectum vom Gehirn gelöst werden. Wenn die Blutentnahme nicht abgeschlossen ist, sieht das Gehirn hellrosa aus (die rechte Gehirnhälfte in Abbildung 2J).
  10. Das Gehirn wird in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd in 1x PBS überführt und über Nacht bei 4 °C fixiert.

3. Vorbereitung von Tiefkühlschnitten

  1. Waschen Sie die fixierten Gehirne dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
  2. Um das Gehirn zu kryoprotektieren, überführen Sie es in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 30 % (w/v) Saccharose in 1x PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Die Einbettmasse (2:1-Mischung aus OCT-Verbindung und 30 % Saccharose, siehe Materialtabelle) wird durch Kombinieren von 30 ml OCT und 15 ml 30 %iger Saccharose hergestellt. Lagern Sie diese bei 4 °C.
    HINWEIS: Um die Blasen aus der gemischten Masse zu entfernen, zentrifugieren Sie die 50-ml-Röhrchen bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur oder stellen Sie die Röhrchen über Nacht aufrecht auf.
  3. Inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei -80 °C, um den Kryomold (siehe Materialtabelle) unmittelbar nach dem Einbetten des präparierten Gehirns in den Kryomold mit der Einbettungsmasse zu kühlen.
    HINWEIS: Flüssiger Stickstoff kann auch zur Kühlung des Aluminiumblocks verwendet werden. In diesem Fall sollte der Aluminiumblock in eine Styroporbox gelegt werden, die mit genügend flüssigem Stickstoff gefüllt ist, um den Aluminiumblock kurz vor dem Einbetten abzudecken. Nachdem Sie die Flüssigstickstoffsublimation bestätigt haben, legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock. Es ist besser zu bestätigen, wie viele Kryoformen gleichzeitig auf dem Aluminiumblock platziert werden können. Es ist ratsam, flüssigen Stickstoff oder einen zusätzlichen vorgekühlten Block zu verwenden, um genügend Platz für eine schnelle Kühlung aller Proben zu gewährleisten.
  4. Legen Sie den vorgekühlten Aluminiumblock in eine Styroporbox. Verwenden Sie eine Styroporbox mit Deckel, um ein Erwärmen des Aluminiumblocks zu verhindern.
  5. Für koronale Schnitte betten Sie das Gehirn in einen Kryomold ein und passen Sie die Ausrichtung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop an (Abbildung 3A).
  6. Legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung einfrieren (Abbildung 3B). Wenn die OCT-Verbindung zu gefrieren beginnt, wird sie weiß.
  7. Tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf und montieren Sie den Kryoblock, um den Kryoblock an der Probenscheibe zu befestigen.
  8. Legen Sie die Probenscheibe in den Kryostaten und frieren Sie die OCT-Verbindung vollständig ein.
  9. Legen Sie die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.
  10. Legen Sie die Ausrichtung des Kryoblocks fest und schneiden Sie das OAT zu, um zusätzliche Bereiche zu entfernen.
    HINWEIS: Passen Sie die Ausrichtung der Schnittebene an, während Sie das Telencephalon schneiden. Die Klinge ist mit einem Kryostaten ausgestattet. Es ist möglich, die Ausrichtung der Schnittebene durch Ändern des Winkels des Probenkopfes anzupassen.
  11. Schneiden Sie 14 μm dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum. Lagern Sie die Objektträger bei -25 °C.
    HINWEIS: Die Langzeitlagerung sollte bei -80 °C erfolgen.

4. Fluoreszierende Immunfärbung

  1. Trockene Glasobjektträger in einem Objektträgergestell für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Objektträger in 1x PBS für 30 min bei RT waschen. Wenn eine Immunfärbung mit Anti-PCNA- oder BrdU-Antikörpern durchgeführt werden soll, fahren Sie mit Schritt 4.2 oder Schritt 4.3 fort.
  2. Bereiten Sie 500 ml 10 mM Natriumcitrat in einem 500-ml-Becherglas vor und erwärmen Sie den Citratpuffer auf einem Heizplatten-Magnetrührer auf 85 °C, legen Sie dann die Objektträger in ein Objektträger-Färbegestell und inkubieren Sie das Gestell im Citratpuffer bei 85 °C für 30 Minuten. Um ein Kochen zu vermeiden, halten Sie die Temperatur bei etwa 85 °C. Nach der Antigenentnahme werden die Objektträger dreimal in 0,1 % Triton in 1x PBS (PBSTr) gewaschen, wobei jeder Waschgang 5 min bei RT dauert.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA).
  3. Bereiten Sie eine 2 N HCl-Lösung vor, indem Sie 12 N HCl in destilliertem Wasser verdünnen. Zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker (siehe Materialtabelle) eine Linie als hydrophobe Barriere, um die 2 N HCl-Lösung um die Abschnitte herum zu halten.
    1. Legen Sie die Objektträger auf Immunfärbungsschalen und tragen Sie 200-300 μl der 2N HCl-Lösung auf. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 °C für 30 Minuten. Nach der Antigengewinnung dreimal in 0,1 % PBSTr waschen, wobei jede Wäsche 5 Minuten bei RT dauert.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des BrdU-Antigens.
  4. Nehmen Sie die restliche Lösung auf und entfernen Sie sie mit Papiertüchern. Verwenden Sie dann einen Flüssigkeitsblocker, um eine hydrophobe Barriere zu ziehen, um die Antikörperlösung bei Bedarf um die Abschnitte herum zu halten.
  5. Legen Sie die Objektträger auf Tabletts und tragen Sie 200-300 μl Blockierlösung, 3% (v/v) Pferdeserum in PBSTr) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei RT.
  6. Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
  7. Bereiten Sie die Primärantikörper (siehe Materialtabelle) mit der Blockierlösung (200-300 μl Antikörperlösung für jeden Objektträger) vor. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die primäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Schalen über Nacht bei 4 °C.
  8. Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
  9. Fluoreszierende sekundäre Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) wird mit dem Blockierungspuffer (1:500) hergestellt. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und beschatten Sie sie mit Aluminiumfolie. 1-2 h bei RT inkubieren.
  10. Waschen Sie die Schnitte dreimal 5 Minuten lang mit PBSTr bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.
  11. Hoechst-Lösung (1:500 Verdünnung in 1x PBS, siehe Materialtabelle) für die Kernfärbung vorbereiten. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die Hoechst-Lösung auf jeden Objektträger auf und decken Sie die Schalen mit Alufolie ab. 30 Minuten bei RT inkubieren.
  12. Waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 10 min bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.
  13. Absorbieren und entfernen Sie die restlichen 1x PBS mit Papiertüchern und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern mit einem wasserlöslichen Einbettmedium (siehe Materialtabelle) für die fluoreszierende Immunfärbung. Setzen Sie langsam ein 24 x 45 mm großes Deckglas auf die Abschnitte. Bei 4 °C lagern, ohne die Objektträger dem Licht auszusetzen.
  14. Beobachten und befotografieren Sie die Schnitte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie.

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Ergebnisse

Eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum durch Einführen der Nadel in die rechte Hemisphäre (Abbildung 1, Abbildung 4A und Abbildung 5A) induziert verschiedene zelluläre Reaktionen, einschließlich der Proliferation radialer Gliazellen (RGC) und der Bildung neugeborener Neuronen. In ähnlicher Weise wurden gealterte Populationen von Zebrafischen und Medaka verwendet, um Alterungseffekten in der regenerativen Reaktion entgegenzuw...

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Diskussion

Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um Stichwundverletzungen im optischen Tectum unter Verwendung einer Nadel zu induzieren, um die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach einer Hirnverletzung zu erleichtern. Nadelvermittelte Stichwunden sind eine einfache, effizient implementierte Methode, die mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden kann. Es wurden Stichwundenmodelle für verschiedene Regionen des Zebrafischgehirns...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 und 21K15195 sowie ein internes Stipendium des AIST, Japan, unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 mL SpritzeTERUMOSS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9,0)NIPPON GENE314-90381
30 G NadelDentronicsHS-2739A
4% Paraformaldehyd Phosphate Buffer SolutionWako163-20145
Aluminiumblock115 x 80 x 37 mm (B x T x H) hat genug Größe zum Einfrieren von 6 Kryoformen
Anti-BLBPMilliporeABN141:500
Anti-BrdUAbcamab18931:500
Anti-HuCInvitrogenA212711:100
Anti-PCNASanta Cruz Biotechnologysc-561:200
BrmodeoxyuridinWako023-15563
Konfokalmikroskop C1 plusNikon
CryomoldSakura Finetek Japan456510 x 10 x 5 mm (B x T x H)
KryostatLeicaCM1960<
em>Danio rerio WT Stämme RW
VerlängerungsrohrTERUMOSF-ET3520
Fluoromount (TM) Wässriges Eindeckmedium, zur Verwendung mit fluoreszierenden Farbstoffen gefärbten GewebenSIGMA-ALDRICHF4680-25ML
PinzetteDUMONT11252-20
Ziege Anti-Maus IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723
Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 546InvitrogenA11035
Hoechst 33342 LösungDojindo23491-52-3
SalzsäureWako080-01066
Inkubationskammer für 10 Objektträger DunkelorangeCOSMO BIO CO., LTD.10DO
MAS coat SchiebeglasMatsunami GlasMAS-01
Micro DeckglasMatsunami GlasC024451
MikroskopieNikonSMZ745T
Normale Pferdeserum BlockierungslösungVECTOR LABRATORIESS-2000-20
O.C.T CompoundSakura Finetek Japan83-1824
Oryzias latipes WT Stämme Cab
PAP Pen Super-Liquid BlockerDAIDO SANGYOPAP-S
Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Tabletten, pH 7,4TaKaRaT9181
Styroportablette100 x 100 x 10 mm (B x T x H) Styroporplatte ist als Tablett erhältlich
SaccharoseWako196-0001530 % (w/v) Saccharose in PBS
Tricain (MS-222)nacarai tesque14805-24
Trinatriumcitrat-DihydratWako191-01785
Triton X-100Wako04605-250

Referenzen

  1. Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).
  2. Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish. BMC Developmental Biology. 6, 36(2006).
  3. März, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strähle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).
  4. Kang, J., et al. Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements. Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).
  5. Simões, F. C., et al. Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair. Nature Communications. 11 (1), 600(2020).
  6. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370 (6519), (2020).
  7. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  8. Diotel, N., Lübke, L., Strähle, U., Rastegar, S. Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals. Frontiers in Neuroscience. 14, 568930(2020).
  9. Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525(2020).
  10. Ito, K., et al. Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury. Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).
  11. Lai, S. L., et al. Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration. eLife. 6, 25605(2017).
  12. Lust, K., Wittbrodt, J. Activating the regenerative potential of Müller glia cells in a regeneration-deficient retina. eLife. 7, 32319(2018).
  13. Shimizu, Y., Kawasaki, T. Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755(2021).
  14. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).
  15. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
  16. Alunni, A., et al. Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones. Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).
  17. Kuroyanagi, Y., et al. Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain. Brain Research. 1323, 33-40 (2010).
  18. Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).
  19. Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish. Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).
  20. Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury. Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).
  21. Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).
  22. Shimizu, Y., Kawasaki, T. Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum. Neuroscience Letters. 756, 135978(2021).
  23. Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408(2021).
  24. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  25. Yu, S., He, J. Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish. eLife. 8, 48660(2019).
  26. Bisese, E. C., et al. The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus). Molecular Brain. 12 (1), 119(2019).
  27. Schmidt, R., Beil, T., Strähle, U., Rastegar, S. Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration. Journal of Visualized Experiments. (4), e51753(2014).
  28. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , University of Oregon Press. (2007).
  29. Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration. Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).
  30. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  31. Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain. Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).
  32. Godoy, R., et al. Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio). Scientific Reports. 10 (1), 12825(2020).
  33. Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae. Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).

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