Biologische Präparation und mechanische Technik zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern

Summary

Das Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung der viskoelastizität der extrazellulären Matrix und ihrer Abhängigkeit von der Proteinzusammensetzung oder Umweltfaktoren. Das zielgerichtete Matrixsystem ist die Mauszonule. Die Leistungsfähigkeit der Methode wird durch den Vergleich des viskoelastischen Verhaltens von Wildtyp-Zonularfasern mit denen ohne Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein-1 demonstriert.

Abstract

Elastizität ist essentiell für die Funktion von Geweben wie Blutgefäßen, Muskeln und Lungen. Diese Eigenschaft leitet sich hauptsächlich von der extrazellulären Matrix (ECM) ab, dem Proteingeflecht, das Zellen und Gewebe miteinander verbindet. Wie sich die elastischen Eigenschaften eines ECM-Netzwerks auf seine Zusammensetzung beziehen und ob die Relaxationseigenschaften des ECM eine physiologische Rolle spielen, sind Fragen, die noch nicht vollständig geklärt sind. Ein Teil der Herausforderung liegt in der komplexen Architektur der meisten ECM-Systeme und der Schwierigkeit, ECM-Komponenten zu isolieren, ohne deren Struktur zu beeinträchtigen. Eine Ausnahme ist die Zonule, ein ECM-System, das im Auge von Wirbeltieren vorkommt. Die Zonule besteht aus hunderten bis tausenden Mikrometer langen Fasern, die den zellfreien Raum zwischen Linse und Augenwand überspannen. In diesem Bericht beschreiben wir eine mechanische Technik, die die hochorganisierte Struktur der Zonule nutzt, um ihre viskoelastischen Eigenschaften zu quantifizieren und den Beitrag einzelner Proteinkomponenten zu bestimmen. Die Methode beinhaltet die Dissektion eines festen Auges, um die Linse und die Zonule freizulegen, und verwendet eine Pull-up-Technik, die die Zonularfasern gleichmäßig dehnt, während ihre Spannung überwacht wird. Die Technik ist relativ kostengünstig, aber empfindlich genug, um Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Zonularfasern bei Mäusen ohne spezifische zonuläre Proteine oder mit zunehmendem Alter nachzuweisen. Obwohl die hier vorgestellte Methode in erster Linie für die Untersuchung der Augenentwicklung und -erkrankung konzipiert ist, könnte sie auch als experimentelles Modell dienen, um breitere Fragen zu den viskoelastischen Eigenschaften elastischer ECMs und der Rolle externer Faktoren wie Ionenkonzentration, Temperatur und Wechselwirkungen mit Signalmolekülen zu untersuchen.

Introduction

Das Auge eines Wirbeltiers enthält eine lebende optische Linse, die hilft, Bilder auf die Netzhaut zu ^fokussieren1. Die Linse wird an der optischen Achse durch ein System empfindlicher, radial orientierter Fasern aufgehängt, wie in Abbildung 1A dargestellt. An einem Ende heften sich die Fasern an den Linsenäquator und am anderen Ende an die Oberfläche des Ziliarkörpers. Ihre Längen reichen von 150 μm bei Mäusen bis zu 1 mm beim Menschen. Zusammen sind diese Fasern als die Zonule von ^Zinn2, die Ziliarzonule oder einfach die Zonule bekannt. Augentraumata, Krankheiten und bestimmte genetische S....

Protocol

Alle Tierversuche wurden vom Animal Studies Committee der Washington University genehmigt und hielten sich an die ARVO-Erklärung für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung.

1. Herstellung von Spezialteilen und Konstruktion von Apparaten

1. Herstellung von Spezialteilen
   1. Sondenfertigung. Halten Sie eine Glaskapillare in einem Winkel, wie in der linken Abbildung 2A dargestellt. Legen Sie eine Flamme aus einem Zigarettenanzünder etwa 2 cm von einem Ende entfernt und halten Sie sie dort, bis sich das Ende um 90° biegt, wie in der rechten Abbildung

Results

Die hier beschriebene Pull-up-Technik bietet einen einfachen Ansatz zur Bestimmung der viskoelastischen Eigenschaften von zonulären Fasern in Mäusen. Kurz gesagt, das Mausauge wird zuerst durch Injektion eines Fixiermittels beim physiologischen Augeninnendruck konserviert. Dieser Ansatz behält die natürliche Inflation des Auges bei und hält die Fasern richtig vorgespannt (die Fixierung wurde als akzeptabel angesehen, nachdem vorläufige Experimente gezeigt hatten, dass sie die Elastizität oder Festigkeit der Fasern nicht .......

Discussion

Die Zonule ist ein ungewöhnliches ECM-System, bei dem die Fasern symmetrisch angeordnet sind und identisch manipuliert werden können, indem die Augenlinse entlang der optischen Achse verschoben wird. Der Raum kann auch ohne zelluläre Störung leicht zugänglich gemacht werden, so dass die Fasern in einer Umgebung in der Nähe ihres ursprünglichen Zustands untersucht werden können. Die Pull-up-Technik nutzt diese ECM-Präsentation, um die empfindlichen Fasern von Mäusen, einem genetisch handhabbaren System, zu manipulieren un.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 Sechskantschrauben 3/4 Zoll lang	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 Mutter	Baumarkt
3D SLA Drucker	Anycubic	Photon
4-40 Schrauben 3/8 Zoll lang, 2	Baumarkt
Kapillaren, AD 1,2 mm und 3 Zoll lang, kein Filament	WPI	1B120-3
Cyanacrylat (super) Kleber	Loctite
Digitalwaage mit einer Genauigkeit von 0,01 g	Nonius	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas-Zigarettenanzünder
Inspektions-/Seziermikroskop	Amscope	Artikelnummer: SM-4NTP	Arbeitsabstand ~ 15 cm
Mikromanipulator, Economy 4-Achsen	WPI	Kite-L
Motorisiertes Mikrometer	Thorlabs	Z812B
Negative Zylinderlinse	Thorlabs		LK1431L1-75 mm Brennweite
Petrischale, 50 mm
Pfostenhalter, 3 Zoll	Thorlabs	PH3
Pfosten, 4 Zoll	Thorlabs	TR4
Scale Logging Software	Vernier	LoggePro
Servomotorsteuerung	Thorlabs	KDC101
Servomotorsteuerung Software	Thorlabs	APT
Schlitzsockel, 1	Thorlabs	BA1S
Schlitzsockel, 2	Thorlabs	BA2
Ständer für mikromanipulare	WPI	M-10
USB-Kamera für Mikroskop		Amscope SKU: MD500
UV-aktivierter Kleber mit UV-Quelle	Amazon