Organkultursystem zur Beurteilung der Toxizität von intraokularen Behandlungshilfsstoffen und Arzneimitteln

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Veränderungen der Stoffwechselaktivität und der Brechfunktion der Linse als Reaktion auf eine experimentelle Behandlung zu bewerten.

Zusammenfassung

Als Hauptursache für Erblindung sind Katarakte eine erhebliche Belastung für die zig Millionen Menschen, die weltweit von dieser Erkrankung betroffen sind. Chemische Belastungen sind neben anderen Umweltfaktoren eine nachgewiesene Ursache für Katarakte. Mit der Untersuchung der Augentoxizität kann beurteilt werden, ob Arzneimittel und ihre Bestandteile zu Linsenschäden beitragen können, die zu Katarakten führen können, oder die Behandlung von Katarakten unterstützen können.

In-vitro-Studien und In-vivo-Tierversuche können zur Bewertung der Sicherheit von Chemikalien vor klinischen Studien herangezogen werden. Der Draize-Test - der derzeitige In-vivo-Standard für die Prüfung der Augentoxizität und -reizung - wurde wegen mangelnder Sensitivität und objektiver Messungen zur Bestimmung der Augentoxizität kritisiert. In vitro zellbasierte Assays sind begrenzt, da Zellkulturen eine intakte funktionelle Linse nicht angemessen modellieren können.

Die hier beschriebene Methode ist eine empfindliche In-vitro-Alternative zu Tierversuchen, die entwickelt wurde, um das Ansprechen der intakten Rinderlinse auf die Behandlung sowohl auf dem Niveau der zellulären Aktivität als auch für die allgemeine Brechungsleistung zu bewerten. Das ungiftige Reagenz Resazurin wird proportional zum Grad der Zellaktivität metabolisiert. Der Linsen-Laser-Scanner-Assay misst die Fähigkeit der Linse, einfallende Lichtstrahlen mit minimalem Fehler auf einen einzigen Punkt zu brechen, der für ihre natürliche Funktion direkt relevant ist. Die Methode kann verwendet werden, um sowohl akute als auch verzögerte Veränderungen der Linse sowie die Erholung der Linse von chemischen oder Umwelteinflüssen zu bestimmen.

Einleitung

Mit mehr als 20 Millionen Menschen ist der Graue Star die häufigste Ursache für Erblindung weltweit ^1,2. Katarakte sind am häufigsten auf altersbedingte Veränderungen der Linse zurückzuführen, werden aber auch durch Traumata, genetische Bedingungen, Krankheiten oder toxische Expositionen induziert². Derzeit umfasst die Behandlung einen chirurgischen Eingriff, um die Linse zu ersetzen, ein teures und invasives Verfahren, das vor allem in Industrieländern zugänglich ist. Die umfangreiche Belastung durch den Grauen Star hat die jahrzehntelange Forschung au....

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den Ethikrichtlinien der University of Waterloo für die Forschung mit tierischem Gewebe durchgeführt. Die Rinderaugen für die aktuelle Studie wurden vom Schlachthof zur Verfügung gestellt, innerhalb weniger Stunden nach dem Tod von Nicht-Milchkühen gewonnen und sofort präpariert, ein Prozess, der bis zu 8 Stunden nach der Gewinnung der Augen dauert. Die Augen sollten sofort präpariert werden, um die Sterilität und die Präparierqualität zu erhalten. Das Kulturmedium wird auf einen pH-Wert von 7,4 vorbereitet und vor der Supplementierung mit FBS²¹ sterilfiltri....

Ergebnisse

Abbildung 2 und Abbildung 3 (n = 6) zeigen die Ergebnisse einer Studie, in der die Wirkung einer chemischen Behandlung (Lanosterol) auf die Rinderlinse untersucht wurde. Lanosterol ist ein natürlich vorkommendes Sterol in der Linse, das einst vielversprechende Ergebnisse als potenzieller pharmazeutischer Eingriff bei Katarakten zeigte²⁵, obwohl dies noch nicht bewiesen wurde²⁶. Das Studiendesign umfasste eine Medie.......

Diskussion

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, die Auswirkungen von Chemikalien oder Umwelteinflüssen auf die Linse in der primären Gewebekultur direkt zu bewerten. Zunächst werden Linsen präpariert und auf optische Qualität gescannt. Die Vermeidung von Kontaminationen und die Sicherstellung der Präparierqualität sind von entscheidender Bedeutung. Die Linsen werden in regelmäßigen Abständen gescannt, um Veränderungen der Brechfunktion in Bezug auf die Kontrollgruppe oder die Präexpositionsbe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(2-Hydroxypropyl)-β-Cyclodextrin	Sigma-Aldrich	H107	Pulver
1 L Flaschenaufsatz-Filtrationssystem	VWR	97066-204	Vollmontage, Flaschenaufsatz, 0,2 μ m
100 mm Petrischale	VWR	89022-320	Verschiebbar, Media Saver Style, steril
12 Well-Platten	Corning	353043	Sterile
Petrischale mit klarem Boden 35 mm	VWR	25373-041	Falcon Einweg-Petrischale, steril, Corning
96 Well-Platte	VWR	29442-072	Steril mit klarem Boden
Alamar blau (Resazurin)	Fischer Scientific	DAL1100	Molecular Probes Reagenz für die Zellviabilität
Benzalkoniumchlorid-Lösung	Sigma-Aldrich	63249	50% in H20
Biosicherheitswerkbank
Cytation 5 Platten-Reader	BioTek	CYT5MPV	Cell Imaging Multi-Mode-Reader
Fötales Rinderserum	ThermoFischer Scientific	12484028	Qualifiziert, hitzeinaktiviert, Kanada
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Für Zellkulturen, Pulver
Inkubator
Lanosterol	Sigma-Aldrich	L5768	≥ 93%, Pulver
L-Glutamin	Sigma-Aldrich		Für die Zellkultur, Pulver
Medium (M-199)	Sigma-Aldrich	M3769	Modifiziert, mit Earle′ s Salze, ohne L-Glutamin, Natriumbicarbonat und Phenolrot, Pulver, geeignet für Zellkulturen
Pasteur-Pipetten			5 3/4'', mit und ohne Baumwolle
Penicillin-Streptomycin	ThermoFischer Scientific	15140122	Liquid (10.000 U/ml)
Phospat Puffer Kochsalzlösung (PBS)			flüssig, steril, geeignet für Zellkultur
Pipettenspitzen (100 & Mikro; L, 1.000 & Mikro; L, 5.000 &Mikro; L)	VWR		Sterile
ScanTox (Linsen-Laser-Scanner)	Speziell entwickeltes hauseigenes	N/A	Scannt Objektiv mit einem Laser zur Bestimmung der optischen Qualität
der Linsen ScanTox-Kulturkammer	Speziell entwickeltes internes	N/A	Hält Rinderlinse während der Prüfung und Kultivierung an Ort und Stelle
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761	Für Zellkulturen, Pulver
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich	S2770	1,0 N, BioReagenz, geeignet für Zellkultur