Chicken Recombinant Limbs Assay, um Morphogenese, Musterung und frühe Schritte in der Zelldifferenzierung zu verstehen

Zusammenfassung

Rekombinante Gliedmaßen sind ein leistungsfähiges experimentelles Modell, das es ermöglicht, den Prozess der Zelldifferenzierung und die Erzeugung von Mustern unter dem Einfluss embryonaler Signale zu untersuchen. Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung rekombinanter Gliedmaßen mit Mesodermalzellen von Hühnergliedmaßen vor, die an andere Zelltypen angepasst werden können, die aus verschiedenen Organismen gewonnen werden.

Zusammenfassung

Zelldifferenzierung ist der fein abgestimmte Prozess der Zellbindung, der zur Bildung verschiedener spezialisierter Zelltypen während der Etablierung von sich entwickelnden Geweben und Organen führt. Dieser Prozess wird im Erwachsenenalter aktiv aufrechterhalten. Die Zelldifferenzierung ist ein fortlaufender Prozess während der Entwicklung und Homöostase von Organen. Das Verständnis der frühen Schritte der Zelldifferenzierung ist unerlässlich, um andere komplexe Prozesse wie die Morphogenese zu kennen. Somit sind rekombinante Hühnergliedmaßen ein experimentelles Modell, das die Untersuchung der Zelldifferenzierung und Mustergenerierung unter embryonalen Mustersignalen ermöglicht. Dieses experimentelle Modell imitiert eine In-vivo-Umgebung ; Es setzt reaggregierte Zellen zu einer ektodermalen Hülle zusammen, die aus einer frühen Gliedmaßenknospe gewonnen wird. Später werden Ektoderme übertragen und in einen Kükenembryorezeptor implantiert, um seine Entwicklung zu ermöglichen. Dieser Assay wurde hauptsächlich verwendet, um mesodermale Gliedmaßenknospenzellen zu bewerten; Es kann jedoch auf andere Stamm- oder Vorläuferzellen aus anderen Organismen angewendet werden.

Einleitung

Die Wirbeltierextremität ist ein beeindruckendes Modell zur Untersuchung der Zelldifferenzierung, der Zellproliferation, des Zelltods, der Musterbildung und der Morphogenese ^1,2. Während der Entwicklung treten Gliedmaßen als Ausbuchtungen aus den Zellen aus, die aus dem lateralen Plattenmesoderm¹ stammen. Gliedmaßenknospen bestehen aus einem zentralen Kern mesodermaler Zellen, die von einem Ektoderm bedeckt sind. Aus dieser frühen Struktur entsteht ein ganzes und wohlgeformtes Gliedmaß. Nachdem die Gliedmaßenknospe entstanden ist, werden drei Achsen erkannt: (1) die proximo-distale Achs....

Protokoll

Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt. Ein schematisches Flussdiagramm der allgemeinen Schritte dieses Protokolls ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Inkubation von Embryonen und Bestimmung der Lebensfähigkeit

1. Befruchtete Hühnereier bei 38 °C und 60% relativer Luftfeuchtigkeit etwa dreieinhalb Tage lang bebrüten, bis sie das Stadium 22 HH erreichen (nach Hamilton und Hamburger,

Ergebnisse

Erkennen einer gut funktionierenden rekombinanten Extremität
Nach der Transplantation wurden die manipulierten Embryonen in den Inkubator zurückgebracht, damit sich die RL entwickeln konnte. Die Inkubationszeit korrelierte mit den Anforderungen des Experiments. Dennoch kann die RL nach 12 h Implantation leicht unterschieden werden. Um festzustellen, ob die Implantation ausreichend war, wurde die RL als Protuberanzung beobachtet, die sicher an der mesodermalen Wand des Spenderembryos befestigt war (

Diskussion

Im Allgemeinen kann das RL-Protokoll in fünf Schritte unterteilt werden: (1) Embryoneninkubation, (2) Gewinnung von Mesodermalzellen der Gliedmaßen zur Füllung der Ektoderme, (3) Gewinnung der Ektoderme, (4) Zusammenstellung mesodermaler Zellen in den ektodermalen Hüllen und (5) Transplantation der gefüllten Ektoderme in die Wirtsembryonen. Die Haupteinschränkung der RL-Technik ist das lange, detaillierte Protokoll, das viele kritische Punkte enthält, die Geduld erfordern, um angemessen zu funktionieren. Um das Protokoll.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alcian Blue 8GX	Sigma	A5268
Abgewinkeltes Schlitzmesser	Alcon	2,75 mm DB
Blunt Pinzette	Fine Science Tools	11052-10
Kollagenase Typ IV	Gibco	1704-019
DMEM-HG	Sigma	D5796
Brutapparat	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Fötales Rinderserum	Gibco	16000069
Feine chirurgische Zange	Fine Science Tools	9115-10
Hanks Balanced Salt Solution	Sigma	H6648
Mikrozentrifuge	Eppendorf	5417R
Mikropipette	NA	NA
Palladiumdraht	GoodFellow	7440 05-3
Petrischale	Nest	705001
Pippette	crmglobe	PF1016
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA	NA
Trypsin Schwein	Merck	9002 07-7
Wolframnadel	GoodFellow	E74-15096/01