Method Article

Eine robuste Entdeckungsplattform zur Identifizierung neuartiger Mediatoren der Melanommetastasierung

DOI:

10.3791/63186

⸱

March 8th, 2022

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1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In This Article

Summary

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Dieser Artikel beschreibt einen Workflow von Techniken, die zum Testen neuartiger Kandidatenmediatoren von Melanommetastasen und deren Wirkmechanismus eingesetzt werden.

Abstract

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Metastasierung ist ein komplexer Prozess, bei dem Zellen Barrieren überwinden müssen, die nur unvollständig durch In-vitro-Assays modelliert werden. Ein systematischer Workflow wurde unter Verwendung robuster, reproduzierbarer In-vivo-Modelle und standardisierter Methoden etabliert, um neue Akteure in der Melanommetastasierung zu identifizieren. Dieser Ansatz ermöglicht Datenrückschlüsse in bestimmten experimentellen Stadien, um die Rolle eines Gens bei Metastasen genau zu charakterisieren. Modelle werden erstellt, indem genetisch veränderte Melanomzellen über intrakardiale, intradermale oder subkutane Injektionen in Mäuse eingeführt werden, gefolgt von einer Überwachung mit serieller In-vivo-Bildgebung . Sobald vordefinierte Endpunkte erreicht sind, werden Primärtumoren und/oder metastasentragende Organe entnommen und für verschiedene Analysen verarbeitet. Tumorzellen können sortiert und einer von mehreren "Omics"-Plattformen unterzogen werden, einschließlich der Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Organe werden bildgebenden und immunhistopathologischen Analysen unterzogen, um die Gesamtbelastung durch Metastasen zu quantifizieren und ihren spezifischen anatomischen Standort abzubilden. Diese optimierte Pipeline, einschließlich standardisierter Protokolle für Transplantation, Überwachung, Gewebeernte, -verarbeitung und -analyse, kann für patientenabgeleitete, kurzfristige Kulturen und etablierte menschliche und murine Zelllinien verschiedener solider Krebsarten übernommen werden.

Introduction

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Die hohe Mortalität im Zusammenhang mit metastasierendem Melanom in Kombination mit einer zunehmenden Inzidenz von Melanomen weltweit 1 (geschätzter Anstieg von 7,86% bis2025) erfordert neue Behandlungsansätze. Fortschritte in der Zielentdeckung hängen von reproduzierbaren Metastasenmodellen ab, einem hochkomplexen Prozess. Während der Schritte der metastasierenden Kaskade müssen Melanomzellen unzählige Barrieren überwinden, um eine Umgehung des Immunsystems und die Besiedlung entfernter Gewebe zu erreichen2. Die Widerstandsfähigkeit und Anpassungsfähigkeit von Melanomzellen ergibt sich aus einer Vielzahl von Faktoren, d....

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Protocol

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HINWEIS: Die Tierverfahren, die mit dem folgenden Protokoll verbunden sind, wurden vom New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. Alle Verfahren werden in Einrichtungen durchgeführt, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) zugelassen sind. Abbildung 1 zeigt den allgemeinen experimentellen Ansatz.

1. Von Patienten abgeleitete Melanom-Kurzzeitkulturen (STCs)

  1. Geben Sie das Gewebe in eine 60 mm große Petrischale mit 1 ml vollständigem RPMI (RPMI 1640 ergänzt mit 10% fetalem Rinderseru....

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Results

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Die folgenden Abbildungen veranschaulichen, wie der beschriebene Workflow zur Identifizierung neuartiger Treiber der Melanommetastasierung angewendet wurde. Abbildung 2 fasst die Ergebnisse einer veröffentlichten Studie zusammen, in der die Auswirkungen der Stilllegung der Fucosyltransferase FUT8 in vivo Melanommetastasen untersucht wurden26. Kurz gesagt, die Analyse der glykomischen Daten des menschlichen Patienten (erhalten durch Lektin-Arrays) und die tran.......

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Discussion

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Ziel dieses technischen Berichts ist es, einen standardisierten, von oben nach unten gerichteten Workflow für die Untersuchung potenzieller Akteure bei Melanommetastasen anzubieten. Da In-vivo-Experimente kostspielig und zeitaufwendig sein können, sind Strategien zur Maximierung der Effizienz und zur Steigerung des Wertes der erhaltenen Informationen von größter Bedeutung.

Es ist unerlässlich, komplementäre Ansätze zu verwenden, um die Ergebnisse innerhalb desselben Experiments zu übe.......

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Disclosures

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgements

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Wir danken der Division of Advanced Research Technologies (DART) an der NYU Langone Health und insbesondere dem Experimental Pathology Research Laboratory, dem Genome Technology Center, dem Cytometry and Cell Sorting Laboratory, dem Pre-Clinical Imaging Core, die teilweise durch den Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087 unterstützt werden. Wir danken der NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) für den Zugang zu patientenabgeleiteten Melanom-Kurzzeitkulturen + (10-230BM und 12-273BM), die durch IRB-genehmigte Protokolle (Universal Consent Study #s16-00122 und Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group S....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#15 Scapel-Klinge WPI500242Für chirurgische
Eingriffe#3 Scapel GriffWPI500236Für chirurgische Eingriffe
1 ml Tuberkulin-Spritze, Stülpspitze BD309626Injektionen
10 mL Spritze, Slipspitze BD301029Perfusion
10% Formalin Natrium gepuffertEK Industries4499-20LFür Perfusions-/Gewebefixiermittel
15 mL ConicalCorning 430052Zellkultur
15 mL Konische Polypropylen-ZentrifugenröhrchenFalcon352196Zellkultur
200 Proof EthanolDeacon Labs04-355-223Histology
22G – 22mm NadelBD305156Perfusion
4-0 Vicryl NahtEthiconJ464GNaht
4% Carson's Phosphat gepuffert Paraformaldehyd EMS15733-10Für Perfusions-/Gewebefixiermittel
40µ mCorning431750Gewebeaufbereitung
5-0 Resorbierbares NahtmaterialEthicon6542000Verschluss
50 mL konischCorning 430828Zellkultur
50 ml konische Zentrifugenröhrchen aus PolypropylenFalcon352070Zellkultur
7-0 Seidennaht FST18020-70Ligatur
70µ mCorning431751Tissue-Verarbeitung
Anti-Fade-Eindeckmedien   Vector LabsH-1000-10Immunfluoreszenz-Approximator
mit Pinzette, 10cm WPI14189Für mikrochirurgische Eingriffe
AvanceBruker3 HDNMR-Konsole 
Biospec 7030 Bruker7030Micro MRT
BSABioregA941NuMA
, gerade Spitzen 5,5 mm Bindeplattform, 11 cmWPIWP5025501Für mikrochirurgische Eingriffe
Coplin FärbeglasBel-Art F44208-1000Histologie
DAPISigma-AldrichD9542-1MGImmunfluoreszenz
dCas9-KRABAddgene110820Genmanipulation
DNase INEBM0303LGewebeaufbereitung
DPBSCorning21-030-CMGewebeaufbereitung
Extra scharfe unbeschichtete EinkantklingeGEM62-0167Verarbeitung von Gewebe
Extrazelluläres Matrixsubstrat Corning354234den Wachstumsfaktor als reduziert betrachten (als Alternative 
FBSCytivaSH30910.03Zellkultur
Fidschi Image JFidschi Image JSoftwareImmunfluoreszenz
Ziege Anti-Kaninchen HRP konjugiertes Multimer Thermo FisherA16104NuMA
Färbendes ZiegenserumGibcoPCN5000Immunfluoreszenz
HBSSCorning21-020-CV
HämatoxylinRichard-Allan Wissenschaftlicher Verein7231Histologie
Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI Instrument
Insulinspritze 28G - 8mm NadelBD329424Injektionen
Insulinspritze 31G - 6mm Nadel BD326730Injektionen
Iriszange, 10,2 cm, Full Curve, gezacktWPI504478Für Perfusionen und chirurgische Eingriffe
Isofluran USPCovetrus11695067772Anästhesie
Jewelers #7 Pinzette Titan 11 cm 0,07 x 0,01 mm SpitzeWPI WP6570Für mikrochirurgische Eingriffe
Ketamin HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anästhesie
lentiCRISPRv2Addgene98290Genmanipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lektin, DyLight 649InvitrogenL32472Marker für vaskuläre Endothelzellen
MEM nicht-essentielle Aminosäuren X 100Corning25-025-CIZellkultur
Metzenbaum SchereWPI503269Für chirurgische Eingriffe Verfahren
MikroinjektionseinheitKOPF5000Intrakardiale Injektionen
NaClFisherS25877 NuMA Färbung
Nadel 30G x 25mmBD305128Intrakardiale
Injektionsnadel 33G x 15mmHamilton7747-01Intrakarotis-Injektionsnadelhalter
, Castroviejo, 14cm, mit Lock, 1,2mm gezackte BackenWPI14137-GFür mikrochirurgische Eingriffe
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ MäuseDas Jackson Laboratory005557Mausmodell
NU/J MäuseDas Jackson Laboratory002019Mausmodell
Nuklearer Mitotic Apparat Protein polyklonales Kaninchen anti-human Abcam97585NuMA Färbung
Penicillin-Streptomycin 10000U/mLGibco15140122Zellkultur
PercollGE0891-01Dichtetrennlösung 
PI Classic Chirurgische HandschuheCardinal Health2D72PT75XChirurgie
pLKO Tet-OnAddgene21915Genetische Manipulation
Povidon-Jod 10% LösungMedlineMDS093943Chirurgie
Proparacain Tropfen 0,5%Akorn PharmaAX0501Opthalmisches Lokalanästhetikum
Puralube Petrolatum AugensalbeDechra83592Anästhesie-Rasierklinge
Doppelschneidige Klingen EMS72000Rasieren und Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip BraintreeEZC-  KITWundverschluss
RPMI 1640 Corning10-040-CMZellkulturschere
, Feder 10,5 cm Str, 8 mm KlingenWPI501235Für mikrochirurgische Eingriffe
Halbautomatische vibrierende Klinge MikrotomLeicaVT1200Brain Slice Immunfluoreszenz
Einkanal Anästhesie VerdampferSystem Kent ScientificVetFlo-1210S Anästhesie
Smartbox Tischkammersystem und AbluftgebläseEZ SystemsTT4000CO2 Euthanasie
Steriles gefenstertes EinwegtuchMedlineNON21002Chirurgie
Sterile unverstärkte Aurora OP-Mäntel mit eingesetzten ÄrmelnMedlineDYNJP2715Chirurgie
T25Flask Corning 430639Zellkultur
TrisCorning46-031-CMNuMA Färbung
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500MLImmunfluoreszenz
Troutman Bindezange, 10cm, gebogenes G-Muster, 0,52mm Spitze mit BindeplattformWPIWP505210Für mikrochirurgische
Eingriffe Gefäßclips 10G Druck 5x 0,8mm Backen, 5/PackungWPI15911Für Mikrochirurgische Eingriffe
VisiopharmVisiopharmVisiopharmNuMA Quantifizierungssoftware für Färbemittel
Xylasin 100mg/mLAkorn Pharma59399-111-50Anästhesie
XylolFisherX3P-1GALHistologie
Färbe-Castroviejo-Nahzange für die Gewebeaufbereitung

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J.

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Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsIntracardiac InjectionIntradermal InjectionSubcutaneous InjectionBioluminescence ImagingTumor Cell SortingSingle Cell RNA SequencingImmunohistopathologyMetastasis Suppressor

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