Analyse der Zelldifferenzierung, Morphogenese und Musterung während der Hühnerembryogenese mit dem Soaked-Bead-Assay

Summary

Der durchnässte Perlenassay beinhaltet die gezielte Abgabe von Testreagenzien zu jedem Entwicklungszeitpunkt, um die Regulation der Zelldifferenzierung und Morphogenese zu untersuchen. Es wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, das auf jedes Versuchstiermodell anwendbar ist, um drei verschiedene Arten von getränkten Perlen herzustellen und diese in die Zwischenziffer eines Hühnerembryos zu implantieren.

Abstract

Eine Vielzahl von genetischen Programmen wird während der Embryonalentwicklung aktiviert, die die Zelldifferenzierung orchestrieren, um eine erstaunliche Vielfalt an somatischen Zellen, Geweben und Organen zu erzeugen. Die präzise Aktivierung dieser genetischen Programme wird durch Morphogene reguliert, diffusible Moleküle, die das Zellschicksal an verschiedenen Schwellenwerten lenken. Um zu verstehen, wie die genetische Aktivierung die Morphogenese koordiniert, müssen lokale Wechselwirkungen untersucht werden, die während der Entwicklung durch Morphogene ausgelöst werden. Die Verwendung von Perlen, die mit Proteinen getränkt sind, oder von Medikamenten, die in verschiedene Regionen des Embryos implantiert werden, ermöglicht es, die Rolle bestimmter Moleküle bei der Etablierung von Ziffern und anderen Entwicklungsprozessen zu untersuchen. Diese experimentelle Technik liefert Informationen über die Kontrolle der Zellinduktion, des Zellschicksals und der Musterbildung. Somit ist dieser durchnässte Perlen-Assay ein äußerst leistungsfähiges und wertvolles experimentelles Werkzeug, das auf andere embryonale Modelle anwendbar ist.

Introduction

Durchbrüche in den molekularen Mechanismen, die die Genexpression während der Embryonalentwicklung steuern, haben es uns ermöglicht zu verstehen, wie das Schicksal der Zellen bestimmt wird. Die Bindung an verschiedene Zelllinien erfolgt, sobald die Zellen mit der molekularen Expression von Transkriptionsfaktoren¹ beginnen. Dieses Expressionsmuster ist räumlich und zeitlich hochgradig koordiniert und steuert dadurch die Formgebung, Positionierung und Musterung von Zellen, Geweben und Organen 1,2,3,4,5.

Protocol

Diese Forschung wurde vom Institutional Review Board for the Care and Use of Laboratory Animals des Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Mexiko-Stadt, Mexiko) überprüft und genehmigt.

1. Eizellinkubation und Embryo-Staging

HINWEIS: Befruchtete Hühnereier können von lokalen Bauernhöfen bezogen werden. Befruchtete Hühnereier aus weißem Leghorn werden am häufigsten verwendet. Lagern Sie die frisch befruchteten Hühnereier bis zu 1 Woche vor der Inkubation bei 15 °C.

1. Die befruchteten Hühnereier vertikal mit der spitzen Seite nach unten in ei....

Results

Verwendung von getränkten Perlen zur Beurteilung des Zellverhaltens im embryonalen Kükenglied
Um die Wirksamkeit dieses Assays zu gewährleisten, muss die Perle konsistent und präzise an der richtigen Stelle platziert werden; in diesem Fall der distale Most der dritten Ziffer unterhalb des apikalen ektodermalen Rückens AER (Abbildung 1A). Diese Positionierung ermöglicht es dem betreffenden Molekül, sich gleichmäßig im Interdigitalgewebe auszubreiten. Darüber hinaus enthält.......

Discussion

Der Hauptvorteil des in diesem Protokoll beschriebenen experimentellen Werkzeugs besteht darin, dass es in der Lage ist, den Zeitpunkt und den Ort der Exposition gegenüber Perlen zu kontrollieren, die in einem bestimmten experimentellen Molekül getränkt sind. Die Kombination der richtigen Positionierung mit präzisem Entwicklungstiming bietet enorme Möglichkeiten, Zelldifferenzierungsprozesse zu untersuchen. Die Durchführung dieser Experimente in undifferenziertem Gewebe ermöglicht die Untersuchung der ersten entscheidend.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Affi-Gel Blue Gel Kügelchen	Bio-Rad	153-7302
AG1-X2 Kügelchen	Bio-Rad	1400123
Inkubator	Incumatic de Mexico	Incumatic 1000
Feine chirurgische Zange	Fine Science Tools	9115-10
Heparin Sepharose Kügelchen	Abcam	ab193268
	Petrischale Nest
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi DV4
Tape	NA
NA Wolframnadel	GoodFellow	E74-15096/01