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Methodenartikel

Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen

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DOI:

10.3791/63189

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18. Mai 2022

 ,  , 
1Biology department, University of Virginia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Methode zur Reaktivierung ruhender neuraler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen wurde etabliert. Mit dieser Methode kann die Rolle systemischer Signale von gewebeintrinsischen Signalen bei der Regulation der Ruhe, des Eintritts und des Austritts neuronaler Stammzellen entkoppelt werden.

Zusammenfassung

Neurale Stammzellen (NSCs) haben die Fähigkeit, sich zu vermehren, zu differenzieren, Apoptose zu durchlaufen und sogar in die Ruhephase einzutreten und sie zu verlassen. Viele dieser Prozesse werden durch das komplexe Zusammenspiel von NSC-intrinsischen genetischen Programmen mit NSC-extrinsischen Faktoren, lokalen und systemischen, gesteuert. Im genetischen Modellorganismus Drosophila melanogaster wechseln NSCs, bekannt als Neuroblasten (NBs), während des Übergangs von Embryo zu Larve von Ruhe zu Proliferation. Während dieser Zeit tauchen Larven aus ihren Eierschalen auf und beginnen zu krabbeln, um Nährstoffe zu suchen. Als Reaktion auf die Tierernährung produziert der Fettkörper, ein endokrines Organ mit Lipidspeicherkapazität, ein Signal, das systemisch in die zirkulierende Hämolymphe abgegeben wird. Als Reaktion auf das Fettkörper-abgeleitete Signal (FBDS) werden Drosophila insulinähnliche Peptide (Dilps) produziert und aus neurosekretorischen Neuronen und Gliazellen des Gehirns freigesetzt, was zu einer nachgeschalteten Aktivierung der PI3-Kinase-Wachstumssignale in NBs und ihrer Glia- und Trachealnische führt. Obwohl dies das aktuelle Modell dafür ist, wie NBs von Ruhe zu Proliferation wechseln, bleibt die Art des extrinsischen FBDS-Hinweises schwer fassbar. Um besser zu verstehen, wie extrinsische systemische Hinweise auf NB den Austritt aus der Ruhephase regulieren, wurde eine Methode entwickelt, um frühe Larvengehirne in vitro vor der Tierernährung zu kultivieren. Mit dieser Methode können exogene Faktoren an die Nährmedien abgegeben und NB-Austritt aus der Ruhezeit untersucht werden. Wir fanden heraus, dass exogenes Insulin ausreicht, um NBs aus der Ruhephase in Ganzhirnexplantaten zu reaktivieren. Da sich diese Methode gut für großflächige Bildschirme eignet, wollen wir zusätzliche extrinsische Hinweise identifizieren, die die NB-Ruhephase im Vergleich zu Proliferationsentscheidungen regulieren. Da die Gene und Signalwege, die NSC-Proliferationsentscheidungen regulieren, evolutionär konserviert sind, könnten die Ergebnisse dieses Assays einen Einblick in die Verbesserung regenerativer Therapien in der Klinik geben.

Einleitung

Stammzellen sind aufgrund ihres Potenzials für den Einsatz in der regenerativen Medizinvon großem Interesse 1,2. Viele Tiere, insbesondere solche, die langlebig sind, behalten Stammzellen in ihrem erwachsenen Gewebe. Diese residenten Stammzellen dienen der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase und werden zur Reparatur nach körperlichen Verletzungen oder Krankheitenverwendet 3,4. Die meisten Stammzellen bei erwachsenen Tieren sind ruhig, ein relativ ruhender Zustand, der durch Zellzyklusstillstand und Inaktivierung der Wachstumssignalisierunggekennzeichnet ist 5. Als Reaktion auf extrinsische Hinweise verlassen Stammzellen die Ruhe, treten in den Zellzyklus ein und beginnen, Tochternachkommen zu erzeugen, die für ihren Gewebetyp spezifisch sind. Um beispielsweise eine effektive Immunantwort aufzubauen, induzieren Antigen-präsentierende Zellen ruhende naive T-Zellen, in den Zellzyklus einzutreten und sich klonalauszudehnen 6. Als Reaktion auf Schäden an der Skelettmuskulatur treten Muskelsatellitenstammzellen in den Zellzyklus ein und erzeugen Tochtermyoblasten, um beschädigte Myofibrillen zu ersetzen 5,7. Während es klar ist, dass ruhende Stammzellen auf extrinsische Signale reagieren, bleibt in vielen Fällen die Art des extrinsischen Hinweises unklar, ebenso wie der Mechanismus der Cue-induzierten Stammzellaktivierung. Ein besseres Verständnis dafür, wie ruhende Stammzellen auf extrinsische Hinweise reagieren und in den Zellzyklus eintreten, wird bei der Entwicklung besserer Stammzelltherapien in der Klinik helfen und die wissenschaftlichen Kenntnisse erweitern.

Seit Jahrzehnten werden Modellorganismen verwendet, um die Gene und Zellsignalwege aufzudecken, die die Stammzellproliferation während der Entwicklung und im Erwachsenenalter regulieren. Bei Drosophila teilen sich neuronale Stammzellen (NSCs), bekannt als Neuroblasten (NBs), während der gesamten Entwicklung, um alle Neuronen und Gliazellen zu erzeugen, die sich letztendlich integrieren und den neuronalen Schaltkreis bilden, der für die Gehirnfunktion erforderlich ist 8,9. Wie andere Stammzellen teilen sich NBs asymmetrisch, um sich selbst zu erneuern, und in einigen Fällen symmetrisch, um den Stammzellpool zu erweitern. Die NB werden während der Embryogenese spezifiziert und die meisten treten gegen Ende in die Ruhephase ein, was mit einem Rückgang der mütterlichen Nährstoffspeicher einhergeht (Abbildung 1). Nachdem die Embryogenese abgeschlossen ist, schlüpfen die Larven und beginnen mit der Fütterung. Als Reaktion auf die Tierfütterung reaktivieren sich die NBs aus der Ruhephase und nehmen die Zellteilungen 10,11,12,13,14,15,16 wieder auf. Da das Drosophila-ZNS relativ einfach ist und NBs zu definierten Zeiten in die Ruhephase ein- und austreten, erweist sich die Verwendung von Drosophila zur Untersuchung der Regulation von Ruhe, Ein- und Ausgang als ideal.

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Abbildung 1: Relative Proliferation von CB-NBs (zentrale Gehirnneuroblasten, rot) und MB-NBs (Pilzkörper-Neuroblasten, blau) über die Entwicklungszeit. Am Ende der Embryogenese stellen die meisten NBs (rote Linie) die Proliferation ein und treten in die Ruhephase ein. Die Ruhephase dauert an, bis frisch geschlüpfte Larven ihre erste vollständige Mahlzeit zu sich nehmen. Die Zeitpunkte des Fokus für diese Methodik sind in roten Kreisen angegeben (1, Ruhezustand und 2, Reaktivierung). MB NBs (blau) sind eine Teilmenge der zentralen Gehirn-NBs, die sich während der gesamten Entwicklung kontinuierlich teilen (4 pro Gehirnhälfte). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Als Reaktion auf die Tierfütterung werden PI3-Kinase- und TOR-Wachstumssignalwege in NBs und in ihrer Glia- und Trachealnische10,11,15,16 aktiv. Wenn Nährstoffe aus der Nahrung entzogen werden oder wenn der PI3-Kinasespiegel reduziert wird, können NBs nicht reaktiviert werden und das Wachstum von Glia und Luftröhre wird ebenfalls reduziert10,11,15,16. Das aktuelle Modell postuliert, dass die NB-Reaktivierung durch den Fettkörper an das Larvenwachstum gekoppelt ist, was ein systemisches Signal als Reaktion auf die Tierfütterungfreisetzt 12,17,18. Dieses Signal, das schwer fassbar bleibt, fördert wahrscheinlich die Expression und Freisetzung von Drosophila insulin-like peptide (Dilps) im Gehirn, was zur nachgeschalteten Aktivierung der PI3-Kinase in NBs und ihrer Glia- und Trachealnische führt. Um die Art der systemischen Cue(s) besser zu verstehen, haben wir eine Methode entwickelt, um ruhende NBs in kultivierten Gehirnexplantationen zu reaktivieren. Mit dieser Methode kann die Reaktivierung von NBs in Abwesenheit von systemischen Hinweisen für das gesamte Tier untersucht werden. Exogene Faktoren können den Kulturmedien wieder zugeführt und die NB-Reaktivierung basierend auf der Aufnahme des Thymidinanalogons EdU untersucht werden. Mit dieser Methode stellten wir fest, dass exogenes Insulin ausreicht, um ruhende NBs in Gehirnexplantaten zu reaktivieren. Zukünftige Arbeiten werden darauf abzielen, zusätzliche Faktoren zu identifizieren, die, wenn sie wieder hinzugefügt werden, entweder positiv oder negativ die NB-Ruhe in Gehirnexplantationen regulieren.

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Protokoll

1. Sammlung von Drosophila-Larven

HINWEIS: Bereiten Sie die Hefeplatte, die Traubenpaste und die Fly-Wohnung vor, bevor Sie beginnen:

  1. Hefepaste: In einem kleinen Behälter 5 g aktive Trockenhefe mit 10 ml Wasser mischen, um eine Paste zu bilden, die die Konsistenz von Erdnussbutter hat. Decken Sie die Hefepaste mit Plastikfolie ab und befestigen Sie sie mit einem Gummiband fest am Behälter.
    HINWEIS: Frische Hefepaste dehnt sich in ihrem Behälter aus und springt vom Deckel ab, wenn sie nicht fest befestigt ist. Hefepaste hält bei Raumtemperatur (RT) mehrere Tage.
  2. Traubenteller: Befolgen Sie das Rezept für die Herstellung von Traubentellern (Tabelle 1). Wenn Sie Platten verwenden, die bei 4 ° C gelagert werden, stellen Sie sicher, dass Sie die Platten vor dem Gebrauch vorwärmen, indem Sie sie 1 Stunde lang bei RT platzieren.
    1. Wasser (750 ml) und Agar (18,75 g) in einem 4-l-Kolben, Wirbel und Autoklaven für 20 min (Flüssigkeitszyklus) mischen.
    2. Traubensaft (250 ml) und Saccharose (25 g) in einem 1 L Kolben mit einem großen Rührstab auf einer beheizten Platte (geringe Hitze) vermischen. Wenn die Saccharose aufgelöst ist, schalten Sie die Hitze aus, warten Sie, bis der Kolben berührt werden kann, bevor Sie Tegosept (10%, 4 ml) und Propionsäure (5 ml) hinzufügen. Lassen Sie die Rührstange an.
    3. Wenn die Autoklavierung abgeschlossen ist, lassen Sie sie abkühlen, bis der Kolben berührt werden kann (~ 60 ° C), und mischen Sie dann die Traubensaftmischung ein.
    4. Alle Lösungen in einem Kolben vereinen und auf dem Teller umrühren lassen.
    5. Die Lösung in Deckel von kleinen Petrischalen (35 mm) pipettieren. Pipette ca. 9 ml pro Deckel oder bis eine konvexe Kuppel erhalten wird.
    6. OPTIONAL: Zünden Sie die Deckel an, um Blasen loszuwerden.
    7. Wenn die Platten erstarren, stapeln Sie die Traubenteller in eine Schachtel mit einem luftdichten Deckel und stellen Sie die Schachtel bei 4 ° C auf. Platten können bis zu 1 Monat gelagert werden.
  3. Fly Condo : Stanzen Sie ~ 20 Löcher in eine 6-Unzen-Polypropylen-Drosophila-Flasche mit einer 18-G-Nadel.
  4. Übertragen Sie erwachsene Fliegen (~ 100 OregonR oder einen beliebigen Genotyp) in eine Fliegenwohnung und verschließen Sie die Wohnung mit einer Traubenagarplatte, die mit einem Klecks Hefepaste belegt ist. Platzieren Sie den Tupfer in Richtung der Mitte der Platte und befestigen Sie die Platte mit Laborband an der Wohnung.
  5. Drehen Sie den Behälter so um, dass sich die Traubenagarplatte auf dem Boden befindet, und legen Sie sie 24 Stunden lang in einen 25 °C-Inkubator (Abbildung 2).

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Abbildung 2: Visuelle Darstellung der umgekehrten Fliegenflasche (Condo) mit männlichen und weiblichen Drosophila-Erwachsenen . Die Plastikflasche hat kleine Einstiche, die mit einer 18-G-Nadel für den Sauerstoffaustausch erzeugt werden. Der Mund der Flasche wird mit einer Agar-Traubensaftkappe verschlossen und invertiert und in einem 25 °C Inkubator gelagert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Wechseln Sie nach 24 Stunden die Traubenagarplatte und ersetzen Sie sie durch eine neue Platte, die mit Hefepaste belegt ist. Wechseln Sie schnell die beiden Platten, während Sie die Wohnung kontinuierlich leicht auf die Bank klopfen, damit die erwachsenen Fliegen nicht entkommen.
  2. Untersuchen Sie die Platte mit dem Auge und beurteilen Sie die Anzahl der Embryonen auf der Platte. Drosophila-Embryonen sind länglich und weiß mit zwei schnurartigen Anhängseln.
  3. Wenn sich nur sehr wenige Embryonen auf dem Teller befinden (weniger als 100), entsorgen Sie die Platte (kratzen Sie das Agar in den Fliegenmüll und bewahren Sie den Plastikdeckel zur Wiederverwendung auf). In vielen Fällen legen erwachsene Frauen in der ersten Nacht nicht viele Embryonen in eine neue Wohnung. Wenn dies der Fall ist, geben Sie den erwachsenen Fliegen weitere 24 Stunden, um sich zu akklimatisieren.
  4. Wenn sich eine große Anzahl von Embryonen auf der Platte befindet (mindestens 100), bewahren Sie sie auf und entfernen Sie die Hefepaste vorsichtig mit einem flachen Bodenspatel.
  5. Sobald die Hefepaste entfernt ist, verwenden Sie einen Metallpickel, um alle Larven manuell von der Traubenplatte unter einem Seziermikroskop zu entfernen. Bei der Betrachtung der Platte unter einem Seziermikroskop sollten kriechende Larven sowie Embryonen beobachtet werden.
  6. Entfernen Sie alle Larven, indem Sie den Metallplektrum zur Seite einer Larve streichen. Larven sind klebrig und bleiben an der Spitzhacke haften. Sobald sich eine Larve auf dem Pick befindet, können zusätzliche Larven leicht aufgenommen werden, indem die Larve auf dem Werkzeug verwendet wird, um mehr zu befestigen.
    HINWEIS: Larven bleiben gerne aneinander. An dieser Stelle spielt es keine Rolle, ob Larven beschädigt werden. Diese Larven werden verworfen.
  7. Nachdem Sie alle Larven gepflückt und entfernt haben, legen Sie die Platte wieder in den 25 ° C-Inkubator. Stellen Sie sicher, dass Sie die Platte in einen größeren Behälter legen, der versiegelt werden kann. Legen Sie nasse Papierhandtücher in den Boden des größeren Behälters, um Feuchtigkeit zu halten.
  8. Nach 30-60 Minuten bringen Sie die Platte zurück zum Seziermikroskop und pflücken Sie nun vorsichtig ~ 20-25 Larven von derselben Traubenagarplatte, um sicherzustellen, dass die gepflückten Larven innerhalb eines Zeitfensters von 30-60 Minuten frisch geschlüpft sind.
  9. Tauchen Sie die Spitze des Werkzeugs mit den 20-25 frisch geschlüpften Larven für 2 min in eine Petrischale (60 mm), die mit 1-2 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist.
  10. Nach 2 Minuten kippen Sie die Schale in einem Winkel, um die Flüssigkeit am Boden zu sammeln. Bürsten Sie die Larven mit einem kleinen Pinsel aus der Flüssigkeit am Boden der Petrischale.
  11. Sammeln Sie alle Larven auf dem Pinsel und geben Sie die Larven in eine neue Petrischale (60 mm), die 1-2 ml 70% Ethanol enthält. Wiederholen Sie die Schritte 1.15, um Larven mit einem Pinsel zu sammeln und sie in eine neue Petrischale mit 1-2 ml 1x PBS zu übertragen.

2. Kulturmedien und Werkzeugvorbereitung

  1. Füllen Sie die Bank und den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und lassen Sie sie trocknen.
  2. Besprühen Sie die Sezierwerkzeuge, die Pinzette und zwei Glasuhrenschalen mit 70% Ethanol und lassen Sie sie auf der Bank trocknen.
  3. Machen Sie die ergänzten Schneider's Medien (SSM, Tabelle 2) und legen Sie sie auf Eis.
  4. Pipette 1 ml SSM in jede der Glasuhrschüsseln.
  5. Übertragen Sie die frisch geschlüpften Larven mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der PBS-Platte in die SSM in der ersten Glasuhrenschüssel. Mit einer Mikropipette mit steriler Spitze die frisch geschlüpften Larven in die zweite Glasuhrenschale zum SSM bringen.

3. Sezierungen und Hirnkulturen

  1. Sobald sich die Larven in der zweiten Glasuhrenschale mit SSM befinden, sezieren Sie die Gehirne mit einer Pinzette und einem Seziermikroskop aus den Larven. Passen Sie die Vergrößerung nach Bedarf an.
  2. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Mundhaken zu greifen, und mit der anderen, greifen Sie den Körper vorsichtig auf halber Höhe nach unten und ziehen Sie in die entgegengesetzte Richtung (Abbildung 3), um die Larve in zwei Stücke zu teilen.
    HINWEIS: Das Gehirn befindet sich direkt hinter den Mundhaken. Beachten Sie, dass das Gehirn möglicherweise andere Gewebe umgibt. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie diese Gewebe entfernen, da dies zu einer Schädigung des Gehirns führen kann

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Abbildung 3: Drosophila-Larven in einer gläsernen Uhrenschale mit SSM. Pinzetten sind für die Dissektion richtig positioniert. Die Position des Larvengehirns (dunkelgrau) ist posterior zu den Mundhaken (schwarz), und beide sind in der Larve gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Sobald 15-20 Gehirne seziert wurden, fügen Sie 1 ml SSM in eine Vertiefung einer sterilen 12-Well-Kulturschale hinzu. Übertragen Sie die frisch sezierten Gehirne mit einer Mikropipette und einer sterilen Spitze in den SSM (Abbildung 4A).
  2. Legen Sie die Gehirne in den SSM-Medien in der 12-Well-Kulturschale für 24 Stunden in einen Inkubator bei 25 °C (Abbildung 4A).

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Abbildung 4: Gehirnkultur und Immunfärbelung . (A) Ganze Gehirne in einer 12-Well-Kulturschale, die 1 ml SSM enthält. Die Kulturschale wird dann für 24 Stunden in einen 25 ° C-Inkubator gegeben. (B) 72-Well-Mini-Tablett, das während der Immunfärbung Gehirnexplantationen enthält. Gehirne werden gewaschen und Lösungen mit einem P20-Mikropipettenset auf 10 μL übertragen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Proliferationsassay, Hirnfixierung und Antikörperfärbung

  1. Machen Sie am nächsten Tag 1 ml EdU SSM-Lösung. Pipette 10 μL eines 10 mM Vorrats von 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) mit 990 μL SSM (endgültige EdU-Konzentration entspricht 0,1 mM) in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und mischen. Nachdem die 24-Stunden-Inkubation abgeschlossen ist, pipettieren Sie die 1 ml EdU SSM in eine Vertiefung der sterilen 12-Well-Kulturschale.
  2. Übertragen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette mit steriler Spitze von der Welle, die SSM enthält, nur auf die neue Welle, die die EdU SSM-Lösung enthält. 1 h bei 25 °C inkubieren.
  3. Als nächstes übertragen Sie die EdU-markierten Gehirne für 20 min in eine andere Vertiefung in derselben Kulturschale, die 1 ml Fixiermittel (4% Paraformaldehyd, siehe Tabelle 3 für Rezept) enthält.
    ACHTUNG: Paraformaldehyd ist eine biologische Gefahr und muss ordnungsgemäß entsorgt werden.
  4. Nach der Fixierung bringen Sie die Gehirne mit einer Mikropipette schnell in die Vertiefungen eines 72-Well-Mini-Trays. Jede Vertiefung kann 10 Gehirne und 10-15 μL Flüssigkeit aufnehmen (Abbildung 4B). Sobald die Gehirne in die Mini-Schale (nicht mehr als 10 Gehirne pro Well) übertragen wurden, entfernen Sie die Korrektur und spülen Sie die Gehirne 3 Mal in 10 μL 1x PBT (Phosphatpuffer, pH 7,4 mit 0,1% Triton-X 100).
    HINWEIS: Spülen bedeutet, 10 μL 1x PBT auf das Gehirn zu pipettieren, zu entfernen und 3 Mal zu wiederholen.
  5. Als nächstes waschen Sie das Gehirn 3 Mal für jeweils 10 Minuten, wieder in 10 μL 1x PBT. Stellen Sie sicher, dass das Gehirn jederzeit mit etwas Flüssigkeit bedeckt ist.
  6. Nachdem die Wäschen abgeschlossen sind, pipettieren Sie 10 μL blockierende Lösung (1x PBT mit 10% normalem Ziegenserum) auf das Gehirn. Decken Sie das Tablett ab und verschließen Sie es mit einem Streifen Parafilm am Rand.
  7. Nach dem Versiegeln legen Sie das Mini-Tablett in eine versiegelte Box mit nassen Handtüchern, um eine feuchte Umgebung zu schaffen, um eine Verdunstung zu verhindern. Stellen Sie die Box mit dem Fach über Nacht auf 4 °C.
  8. Machen Sie am nächsten Tag eine primäre Antikörperlösung.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde Kaninchen-Anti-Kritzel verwendet, um Zellmembranen zu markieren, und Ratten-Anti-Deadpan, um Neuroblasten zu markieren, obwohl eine beliebige Anzahl anderer primärer Antikörper verwendet werden konnte.
    1. Um die primäre Antikörperlösung herzustellen, machen Sie zuerst Verdünnungen von primären Antikörpern in der blockierenden Lösung. Zum Beispiel wird Kaninchen-Anti-Kritzel in einer Endkonzentration von 1:1000 verwendet. Verdünnen Sie daher zuerst den Kaninchen-Anti-Scribble-Antikörper bei 1:100 (1 μL Antikörper plus 99 μL blockierende Lösung). Ratten-Deadpan wird in einer Endkonzentration von 1:100 verwendet. Verdünnen Sie daher zuerst den Ratten-Deadpan-Antikörper bei 1:10 (1 μL Antikörper plus 9 μL blockierende Lösung).
      HINWEIS: Diese Verdünnungen können langfristig bei 4 °C gelagert werden, wenn Natriumazid (0,05%) ebenfalls hinzugefügt wird, um das Bakterienwachstum zu hemmen.
    2. Zählen Sie als Nächstes die Anzahl der Vertiefungen, die Gehirne enthalten. Die Anzahl der Vertiefungen bestimmt das Volumen der zu produzierenden primären Antikörperlösung. Zum Beispiel, wenn es 2 Vertiefungen von Gehirnen gibt, bereiten Sie 20 μL primäre Antikörperlösung vor (für 10 Vertiefungen, 100 μL usw.). Um eine primäre Antikörperlösung von 20 μL herzustellen, fügen Sie 2 μL jeder primären Antikörperverdünnung und 16 μL der blockierenden Lösung hinzu.
      HINWEIS: Die Endkonzentration jedes der primären Antikörper beträgt 1:1000 bzw. 1:100. Kurz gesagt, machen Sie die erste Verdünnung der primären Antikörper in einer Konzentration, so dass die zweite Verdünnung immer 1:10 ist, um zu den jeweiligen Endkonzentrationen zu gelangen. In diesem Fall 1:1000 für Kaninchen-Anti-Kritzeleien und 1:100 für Ratten-Anti-Deadpan.
  9. Entfernen Sie die blockierende Lösung, wobei die Mikropipette auf 10 μL eingestellt ist, und pipettieren Sie 10 μL primäre Antikörperlösung in jede Vertiefung.
  10. Decken Sie das Tablett mit Parafilm ab, verschließen Sie es und legen Sie es wieder in die versiegelte Box mit nassen Handtüchern. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Schütteln ist nicht erforderlich und es wird dringend davon abgeraten. Antikörper dringen in das Gehirn ein, ohne zu zittern oder sich zu vermischen.
  11. Entfernen Sie am folgenden Tag die primäre Antikörperlösung mit einer Mikropipette und spülen Sie das Gehirn 3 Mal mit 10 μL 1x PBT aus. Als nächstes waschen Sie das Gehirn 4 Mal mit 10 μL von 1x PBT für jeweils 10 Minuten. Bereiten Sie während der 10-minütigen Wäschen die sekundäre Antikörperlösung vor.
  12. Um die sekundäre Antikörperlösung herzustellen, wählen Sie sekundäre Antikörper, die die primären Antikörper erkennen. In diesem Protokoll wurden Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa Fluor 488 und Ziegen-Anti-Ratte Alexa 555 verwendet.
    1. Pipette 1 μL von jedem der sekundären Antikörper in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 298 μL der blockierenden Lösung, um die Endkonzentration 1:300 für jeden sekundären Antikörper zu erhalten.
  13. Nach der letzten 10-minütigen Wäsche das 1x PBT entfernen und 10 μL der sekundären Antikörperlösung in jede Vertiefung pipettieren. Verschließen Sie das Tablett mit Parafilm und legen Sie es mit feuchten Handtüchern zurück in die Box. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
    HINWEIS: Machen Sie sich keine Sorgen, jeden letzten μL in den Vertiefungen zwischen Spülungen, Waschungen oder bei der Zugabe von primären und sekundären Antikörperlösungen zu entfernen. Das Gehirn wird immer in ein paar μL Flüssigkeit eingetaucht bleiben, was in Ordnung ist.
  14. Entfernen Sie am folgenden Tag die sekundäre Antikörperlösung mit einer Mikropipette und spülen Sie das Gehirn 3 Mal mit je 10 μL von 1x PBT aus. Als nächstes waschen Sie das Gehirn 4 mal mit je 10 μL von 1x PBT für jeweils 10 Minuten.
  15. Bereiten Sie während der 10-minütigen Wäschen die EdU-Reaktionsmischung vor, um die EdU-Einarbeitung zu erkennen. Bereiten Sie den EdU-Reaktionsmix gemäß den Richtlinien der Hersteller vor.
  16. Nach der letzten Wäsche das 1x PBT entfernen und 10 μL des EdU-Reaktionsmixes in jede Vertiefung mit dem Gehirn pipettieren. Die Mikrotiterplatte mit Parafilm versiegeln und mit Aluminiumfolie abdecken. Lassen Sie die Platte für 30 Minuten auf der Bank.
  17. Nach 30 min das Gehirn 3 mal mit je 10 μL von 1x PBT spülen und das Gehirn 3 mal mit je 10 μL von 1x PBT für jeweils 5 min waschen.
  18. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das 1x PBT und pipettieren Sie 10 μL einer Glycerin-basierten Montagemedienlösung. Die Platte versiegeln und über Nacht auf 4 °C stellen.

5. Montage und Abbildung der Gehirne

  1. Bereiten Sie am folgenden Tag Objektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) vor: Kleben (z. B. Sekundenkleber) ein 22 mm x 22 mm x 1 mm großes quadratisches Deckglas an jedes Ende des Objektträgers, um eine "Brücke" zu schaffen, über die das größere 22 mm x 50 mm x 1 mm Abdeckglas platziert wird, um einen Raum zwischen dem Objektträger und dem größeren Deckglas zu schaffen (Abbildung 5A). Dieser Raum ermöglicht es dem Gehirn, gerade genug Bewegung zu haben, um richtig ausgerichtet zu sein, während verhindert wird, dass es zerquetscht wird.

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Abbildung 5: Schematische Darstellung des Objektträgers, der Orientierung und der Zelltypen im Larvengehirn . (A) Visuelle Darstellung des Objektträgers, auf dem ein Larvengehirn montiert ist und bereit ist, abgebildet zu werden. (B) Es wird auch gezeigt, dass eine Richtlinie zur Gewebeorientierung verwendet wird. (C) Objektträger des Mikroskops, der für die Bildgebung auf einem konfokalen Mikroskop bereit ist. (D) Karikatur, die einige der Zelltypen im Larvengehirn zeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Nachdem Sie die 22 mm x 22 mm x 1 mm große Deckgläser auf den Objektträger geklebt haben, pipettieren Sie 9,3 μL der Glycerin-basierten Montagemedienlösung, die ein Gehirn aus einer Vertiefung der Mikrowellenplatte enthält, und legen Sie sie auf die Mitte des Objektträgers (Abbildung 5A).
    HINWEIS: Larvengehirne können an der Pipettenspitze haften, also seien Sie vorsichtig. Um eine Adhäsion zu vermeiden, beginnen Sie mit der Aspiration des Antifades und dann mit der Aspiration des einzelnen Gehirns gegen Ende des 9,3 μL-Volumens.
  2. Sobald sich das Gehirn auf dem Schlitten befindet, legen Sie das 22 mm x 50 mm x 1 mm große Deckglas vorsichtig darauf. Positionieren Sie das Gehirn wie in Abbildung 5B dargestellt. Bewegen Sie den Deckglas vorsichtig, um das Gehirn zu orientieren. Die Probe ist dann bereit für die Bildgebung.
  3. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit hoher Vergrößerung und einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (Abbildung 5C), um die besten Bilder zu erfassen. Zum Beispiel: 60x oder 63x, 1,4 NA Öl-Tauchlinse.
    1. Stellen Sie sich die Gehirne mit der dorsalen Oberfläche ab, die dem Deckglas (und dem Ziel) am nächsten ist. Erfassen Sie die Z-Stapel durch die gesamte Gehirnhälfte, beginnend an der ventralen Oberfläche (am weitesten vom Objektiv entfernt) in Intervallen von 1 μm oder Z-Schrittgröße.
      HINWEIS: Die verwendeten Laser hängen von den sekundären Antikörpern ab. In diesem Protokoll wurden 488 nm zur Erkennung von Scribble-Flecken, 555 nm zum Erkennen von Deadpan und 633 nm zum Nachweis von EdU verwendet.

6. Datenanalyse

  1. Verwenden Sie Fidschi-Open-Source-Software, um Gehirnhälften zu analysieren, und verwenden Sie das Fiji-Zellzähler-Plugin, um die Zellen zu zählen.

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Ergebnisse

Frisch geschlüpfte OregonR-Wildtyp-Gehirne wurden seziert und 24 Stunden lang in Schneiders Medien (SSM) mit Insulin kultiviert. Gewebe wurden gemäß dem Protokoll fixiert und gefärbt. Primäre Antikörper, die gegen Deadpan (Dpn) zum Nachweis von NBs und Scribble zur Markierung von Zellmembranen erzeugt wurden, wurden verwendet. Das Thymidinanalogon 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (Edu) wurde hinzugefügt, um den Eintritt in die S-Phase und die NB-Reaktivierung nachzuweisen. Wir fanden großformatige Edu positive und Dpn positive ...

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode zur Kultur von Hirnexplantationen kann in den meisten Laborumgebungen durchgeführt werden. Die benötigten Werkzeuge sowie die Vorgehensweise und Datenerfassung sind einfach und unkompliziert. Mit dieser Methode kann man eine Vielzahl von Hypothesen testen, einschließlich derjenigen, die sich auf die Zellsignalkaskaden und extrinsischen Faktoren beziehen, die die Reaktivierung und Proliferation von NB regulieren. Hier fanden wir unter Verwendung von Wildtyp-OregonR-Tieren heraus, dass exogene...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Danksagungen

Wir erkennen das LSAMP Bridges to Doctorate Programm zur Finanzierung (CNK) sowie NIH / NIGMS (R01-GM120421 und R35-GM141886) an. Wir danken Dr. Conor Sipe für Abbildung 1. Wir danken auch allen Siegrist Lab-Mitgliedern für ihre anhaltende Unterstützung und Mentorschaft. Wir danken insbesondere Chhavi Sood und Gary Teeters für ihre sorgfältige Lektüre des Manuskripts und für ihre Kommentare.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10 & Mikro; L PipettenspitzenDenville SciP2102
1000 µ L PipettenspitzenDenville SciP2103-N
1000 & micro; L PipettiererGilsonP1000
16% Paraformaldehyd (10 x 10 mL)Elektronenmikroskopie Sciences2912.60.0000Zur Fixierung von Larvengehirnen
20 & Mikro; L PipetteGilsonP20
200 µ L PipettenspitzenDenville Sci1158U56
24-Well-Multiwell-KulturplattenFisher Scientific50-197-4477
35 mm PetrischalenFisher Scientific08-757-100ATraubenplatte Zutaten
4 > C KühlschrankFisher ScientificBietet eine ideale Temperatur für >24 h Inkubationen in Antikörperlösung
63x ObjektivLecia
Active TrockenhefeDie meisten Supermärkte
AgaroseFisher Scientific214010Traubenplatte Zutaten
Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 647 FarbstoffThermo Fisher ScientificC10340zur Beschriftung proliferierender Zellen
Konfokales MikroskopLeicaSP8
Deckgläser 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10er Pack à 4 ozFisher Scientific12-544-10Zwei Deckgläser werden mit Sekundenkleber auf die Enden des Objektträgers geklebt. Dadurch entsteht ein Raum, in dem das Gehirn während der Abbildung in Antifade schweben kann.
Deckgläser, 22 mm x 50 mm x 1 mmFisher Scientific12-545EDas Deckglas wird auf zwei quadratische Deckgläser auf dem Objektträger platziert, um sicherzustellen, dass sich das Gehirn im Antifade während der Bildgebung nicht bewegt.
PräpariermikroskopZeissStemi 2000
Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 Gallone FlascheFisher Scientific2701Wird verwendet, um die Larven vor dem 24-stündigen Halten in Kulturmedium abzuwaschen
Fötales Rinderserum (10%)SigmaF4135-100MLErgänzung für Zellkulturmedien.
Feine Pinzette zum SezierenFine Science Tools11295-20Rezepte für die Sektion. Sie funktionieren am besten, wenn sie geschärft sind.
Fliegenflaschen für die ÜberquerungGenessee Scientific32-130Diese Flasche wird als Behälter verwendet, der es den Fliegen ermöglicht, Eier auf der Traubenplatte abzulegen.
Glasdissektionsschale (3 Well)Diese sind nicht mehr erhältlich
GlutathionSigmaG6013Bietet oxidativen Schutz während der Zellkultur.
ZiegenserumSigmaG9023- 10MLBlockierungsmittel
TraubenplattenHergestellt im HausHergestellt im Haus Traubensaft/ Agarose-Platten zum Sammeln frisch geschlüpfter Eier
Image JImagej.net/fiji/downloadsKostenloser Download:  https://fiji.scBildgebungsplattform, die zum Zählen von Zellen und Edu-Reaktivierung
verwendet wird InkubatorThermo Fisher ScientificStellt sicher, dass Temperatur, Luftfeuchtigkeit und Lichteinwirkung während des gesamten Experiments genau gleich sind.
InsulinSigmaI0516Unabhängig vom Experiment
Laminar-Flow-HaubeZur Aliquotierung von Kulturmedien
L-GlutaminSigmaG7513Bietet Unterstützung während der Zellkultur
Nunc 72-Well-Microwell-Mini-TablettsFisher Scientific12-565-154Immunfärbeschritte werden in diesem Tablett durchgeführt
ParafilmFisherScientific S37440Folie zum Versiegeln von Platten, um Verdunstung zu verhindern
Pen-StrepSigmaP4458-100mlAntibiodika zur Verhinderung einer bakteriellen Kontamination von Zellen während der Kultur.
Phosphatpuffer, pH7,4Im Haushergestellt Im Haus hergestelltLösungsmittel zum Waschen des Gehirns nach den Fixier- und Färbeschritten
PickFine Science Tools10140-01Wird verwendet, um Larven von der Traubenplatte zu pflücken
PropionsäureFisher ScientificA-258Zutaten für die Traubenplatte
Kaninchen 405Abcamab175653Antikörper für die Immunfärbung
Rat 555Abcamab150166Antikörper für die Immunfärbung
Rb ScribbleEin Geschenk von Chris DoeAntikörper für die Immunfärbung
Rt DeadpanAbcamab195173Antikörper für die Immunfärbung
Schneiders Culture MediumLife Tech21720024Enthält Nährstoffe, die den Zellen beim Wachstum und der Vermehrung helfen
SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL)Life TechS36963Reagenz, das Schutz vor verblassenden Fluorophoren bietet
Steriles WasserAutoklav Milli-Q Wasser aus eigenerBenötigt für Lösungen
SaccharoseFisherS2-12Traubenplatte Zutaten
Superfrost Objektträger FisherScientific12-544-7
SekundenkleberDie meisten Supermärkte
TegoseptGenesee Scientific20-259Traubenteller Zutaten
Triton-X 100SigmaT9284-100MLPBT
Welch's 100% Traubensaftmeisten SupermärkteTraubenteller Zutaten
Herstellung Die

Referenzen

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Reaktivierung neuronaler Stammzellen in kultivierten Drosophila-Hirnexplantationen
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