Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.
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Methodenartikel
In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Histonproteine assoziieren mit DNA, um das eukaryotische Chromatin zu bilden. Die Grundeinheit von Chromatin ist ein Nukleosom, das aus einem Histon-Oktamer besteht, das aus zwei Kopien der Kernhistone H2A, H2B, H3 und H4 besteht, die von der DNA umwickelt sind. Das Oktamer besteht aus zwei Kopien eines H2A/H2B-Dimers und einer einzigen Kopie eines H3/H4-Tetramers. Die hochgeladenen Kernhistonen neigen zu unspezifischen Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen im zellulären Zytoplasma und im Zellkern. Histon-Chaperone bilden eine vielfältige Klasse von Proteinen, die Histone aus dem Zytoplasma in den Zellkern transportieren und deren Ablagerung auf der DNA unterstützen, wodurch der Nukleosomenzusammenbauprozess unterstützt wird. Einige Histonchaperone sind spezifisch für H2A / H2B oder H3 / H4, und einige fungieren als Chaperone für beide. Dieses Protokoll beschreibt, wie In-vitro-Labortechniken wie Pull-Down-Assays, analytische Größenausschlusschromatographie, analytische Ultrazentrifugation und Histon-Chaperoning-Assay zusammen verwendet werden können, um zu bestätigen, ob ein bestimmtes Protein als Histon-Chaperon funktionsfähig ist.
Einleitung
Nukleosomen, die aus DNA und Histonproteinen bestehen, bilden die strukturelle Einheit des Chromatins und regulieren mehrere kritische zelluläre Ereignisse. Nukleosomen werden dynamisch neu positioniert und umgestaltet, um DNA für verschiedene Prozesse wie Replikation, Transkription und Translation zugänglich zu machen 1,2. Sehr basische Histone neigen entweder dazu, mit sauren Proteinen im zellulären Milieu zu interagieren oder eine Aggregation zu durchlaufen, was zu verschiedenen zellulären Defekten führt 3,4,5. Ein....
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Protokoll
1. Analytische Größenausschlusschromatographie zur Aufklärung des oligomeren Status und der Stabilität von Histon-Chaperonen
- Analyse des oligomeren Status von Histon-Chaperonen
- Eine analytische 24-ml-Säule zur Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einem Volumen von 1,2 Säulen (CV), d. h. 28,8 ml entgastem SEC-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl und 1 mM β-Mercaptoethanol (β-ME)] bei 4 °C (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Säulentyp, Pufferzusammensetzung und Puffer-pH-Wert können basierend auf dem interessierenden Protein ausgewählt werden. Das Probeninjektionsvolumen sollte 500 μL für eine 24-ml-Säule ....
- Eine analytische 24-ml-Säule zur Größenausschlusschromatographie (SEC) mit einem Volumen von 1,2 Säulen (CV), d. h. 28,8 ml entgastem SEC-Puffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl und 1 mM β-Mercaptoethanol (β-ME)] bei 4 °C (siehe Materialtabelle).
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Ergebnisse
Die rekombinante N-terminale Nukleoplasmin-Domäne des Proteins FKBP53 aus Arabidopsis thaliana wurde einer analytischen SEC unterzogen. Das Elutionspeakvolumen wurde gegen die Standardkurve aufgetragen, um seinen oligomeren Zustand zu identifizieren. Die analytischen SEC-Ergebnisse zeigten, dass die Domäne als Pentamer in Lösung mit einer ungefähren Molekülmasse von 58 kDa existiert (Abbildung 1A,B). Weiterhin wurde die Nukleoplasmindomäne in Verbindung mit analytis.......
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Diskussion
Diese Arbeit demonstriert und validiert einen umfassenden Satz von Protokollen für die biochemische und biophysikalische Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons. Hier wurden rekombinant exprimierte und gereinigte Proteine der NAP-Familie, AtNRP1 und AtNRP2, und die N-terminale Nukleoplasmindomäne von AtFKBP53 verwendet, um die Protokolle zu demonstrieren. Die gleiche Reihe von Experimenten könnte sehr gut verwendet werden, um die funktionellen Eigenschaften von bisher nicht charakterisierten Histon-Chaperon.......
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Offenlegungen
Es wurde kein Interessenkonflikt erklärt.
Danksagungen
Die außerordentlichen Zuschüsse an Dileep Vasudevan vom Science and Engineering Research Board, Government of India [CRG/2018/000695/PS] und dem Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], sowie die interne Unterstützung durch das Institute of Life Sciences, Bhubaneswar, werden sehr gewürdigt. Wir danken Frau Sudeshna Sen und Frau Annapurna Sahoo für ihre Hilfe bei der Histonvorbereitung. Die Gespräche mit unseren Kollegen Dr. Chinmayee Mohapatra, Manas Kumar Jagdev und Dr. Shaikh Nausad Hossain werden ebenfalls gewürdigt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Essigsäure (eiskalt) | Sigma | A6283 | |
| Acrylamid | MP Biomedicals | 814326 | |
| Agarose | MP Biomedicals | 193983 | |
| AKTA Pure 25M FPLC | Cytiva | 29018226 | Instrument zur Proteinreinigung |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Sigma | A3678 | |
| An-60Ti Rotor | Beckman Coulter | 361964 | Rotor für die analytische Ultrazentrifugation |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Chloroform | Sigma | C2432 | |
| Coomassie brillantblau R 250 | Sigma | 1.15444 | |
| Dialyseschlauch (7 kDa Cut-off) | Thermo Fisher | 68700 | Zur Dialyse von Proteinproben |
| Dithiothreitol ( DTT) | MP Biomedicals | 100597 | |
| DNA Loading Dye | New England Biolabs | B7025S | |
| EDTA Dinatriumsalz | MP Biomedicals | 194822 | |
| Elektronische Waage | Shimadzu | ATX224R | |
| Ethanol | Sigma | E7023 | |
| Ethidiumbromid (EtBr) | Sigma | E8751 | |
| Gel Doc System | Bio-Rad | 12009077 | Für die Bildgebung von Gelen nach der Färbung |
| Horizontales Gelelektrophoresegerät | Bio-Rad | 1704405 | Instrument für die Agarose-Gelelektrophorese |
| Salzsäure (HCl) | Sigma | 320331 | |
| Imidazol | MP Biomedicals | 102033 | |
| Magnesiumchlorid (MgCl2) | Sigma | M8266 | |
| Mikropipetten | Eppendorf | Z683779 | Zum Pipettieren von Mikrovolumina |
| Mini-PROTEAN Elektrophoresesystem | Bio-Rad | 1658000 | Gerät für SDS-PAGE |
| N,N-Methylen-bis-acrylamid | MP Biomedicals | 800172 | |
| Nano | drop Thermo Fisher | ND-2000 | Zur Messung von Protein- und DNA-Konzentrationen |
| Ni-NTA Agarose | Invitrogen | R901-15 | Harzkügelchen für Pull-Down-Assay |
| Optima AUC analytische Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | B86437 | Instrument für analytische Ultrazentrifugation |
| pH-Messgerät | Mettler Toledo | MT30130863 | |
| Phenol | Sigma | P4557 | |
| Plasmid-Isolationskit | Qiagen | 27104 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 1.07393 | |
| pUC19 | Thermo Fisher | SD0061 | Plasmid für Supercoiling-Assay |
| Gekühlte Hochgeschwindigkeitszentrifuge | Thermo Fisher | 75002402 | |
| SDS-PAGE Proteinmarker | Bio-Rad | 1610317 | |
| SEDFIT | Kostenloses Softwareprogramm für analytische Ultrazentrifugationsdaten Analyse | ||
| SEDNTERP | Kostenloses Softwareprogramm zur Schätzung der Viskosität und Dichte des Puffers und des partiellen spezifischen Volumens eines | ||
| Proteins SigmaPrep Spin Columns | Sigma | SC1000 | Für den Pull-Down-Assay |
| Natriumacetat | Sigma | S2889 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Merck | S9888 | |
| Natriumdodecylsulfat (SDS) | MP Biomedicals | 102918 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 Säule für die analytische Größenausschlusschromatographie | |
| Superdex 75 Increase 10/300 GL | Cytiva | 29148721 | Säule für die analytische Größenausschlusschromatographie |
| TEMED | Sigma | 1.10732 | |
| Topoisomerase I | Inspiralis | WGT102 | Enzym verwendet in Plasmid-Supercoiling-Assay |
| Tris-Base | Merck | T1503 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Harnstoff | MP Biomedical | 191450 | |
| Wasserbad | Nü ve | NB 5 | Zur Wärmebehandlung von Proteinproben |
| β-Mercaptoethanol (β-ME) | Sigma | M6250 |
Referenzen
- Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
- Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nu....
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Nachdrucke und Genehmigungen
