ACT1-CUP1-Assays bestimmen die substratspezifischen Sensitivitäten von spleißeosomalen Mutanten in knospender Hefe

Zusammenfassung

Der ACT1-CUP1-Assay, ein Kupferwachstumsassay, ermöglicht eine schnelle Ablesung des Precursor-Messenger-RNA-Spleißens (pre-mRNA) und des Einflusses mutierter Spleißfaktoren auf die spleißöosomale Funktion. Diese Studie bietet ein Protokoll und hebt die Anpassungsmöglichkeiten hervor, um die interessierende Spleißfrage zu beantworten.

Zusammenfassung

Mutationen, die in das Spleißosom oder sein Substrat eingebracht wurden, haben wesentlich zum Verständnis der Feinheiten der spleißeosomalen Funktion beigetragen. Ob krankheitsbedingt oder funktionell selektiert, viele dieser Mutationen wurden mit Wachstumstests im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae (Hefe) untersucht. Der spleißspezifische Kupferwachstumsassay oder ACT1-CUP1-Assay bietet eine umfassende Analyse der Mutation auf phänotypischer Ebene. Der ACT1-CUP1-Assay verwendet Reporter, die bei korrektem Spleißen Kupfertoleranz verleihen. In Gegenwart von Kupfer korrelieren also Veränderungen der Hefelebensfähigkeit mit Veränderungen der mRNA-Produktion durch Spleißen. In einem typischen Experiment wird das Hefespleißosom mit verschiedenen Nicht-Konsens-Spleißreportern und der interessierenden Spleißfaktor-Mutation herausgefordert, um synergetische oder antithetische Auswirkungen auf das Spleißen nachzuweisen. Hier wird eine vollständige Beschreibung der Kupferplattenherstellung, der Beschichtung von Hefezellen und der Datenauswertung gegeben. Eine Auswahl ergänzender Experimente wird beschrieben, die die Vielseitigkeit der ACT1-CUP1-Reporter hervorheben. Der ACT1-CUP1-Assay ist dank des direkten Auslesens von Mutationseffekten und der Vergleichsmöglichkeiten aus der fortgesetzten Verwendung im Feld ein praktisches Werkzeug in der Spleiß-Toolbox.

Einleitung

Das Spleißosom ist eine große, biologische Maschine, die die Entfernung von Introns, nicht-kodierenden Regionen in der Vorläufer-Boten-RNA (pre-mRNA)^1,2, katalysiert. Die Charakterisierung der Wirkung einer Einzelpunktmutante in 1 der fast 100 Proteine und 5 nicht-kodierenden RNAs ist oft mehrdeutig, wenn das Protein oder die RNA isoliert untersucht wird. Die Veränderung der Funktion der mutierten Komponente kann am besten in vivo im Kontext des vollen, funktionierenden Spleißosoms beurteilt werden.

Der hier beschriebene Kupferwachstumstest ist ein schnelles Maß für die Spleißeffizienz in Saccharomyces cerevisiae oder Knospungshefe. Dieser von C.F. Lesser und C. Guthrie entwickelte und 1993 veröffentlichte Assay kombiniert die einfache Arbeit mit einem einfachen Modellorganismus und dem einfachen Auslesen der Zelllebensfähigkeit³. Die Lebensfähigkeit korreliert damit, wie gut die Spleißosomen in diesen Zellen das Reportertranskript erkennen und spleißen können.

Dieser Kupferwachstumstest wird häufiger als ACT1-CUP1-Assay bezeichnet. Der Name ACT1-CUP1 stammt von den beiden Genen, die fusioniert wurden, um einen Reporter der Spleißeffizienz zu schaffen. ACT1 ist das Aktin-Gen der Hefe, das stark exprimiert wird und ein effizient gespleißtes Intron ^4,5 aufweist. Cup1p ist ein Kupferchelator, der Kupfer in der Zelle sequestriert, um Störungen mit regulären Zellfunktionen^{zu verhindern 6,7,8}. Der ACT1-CUP1-Reporter enthält diese Gene sequenziell, so dass CUP1 nur dann im richtigen Leserahmen ist, wenn das Intron von ACT1 vor der mRNA gespleißt wird (Abbildung 1). Das resultierende Fusionsprotein enthält die ersten 21 Aminosäuren des Aktins und das Cup1p-Protein in voller Länge, was die Lebensfähigkeit der Hefe in einer kupferreichen Umgebung erhöht³. So führt eine Erhöhung der Spleißmenge des Reporters zu einer höheren Konzentration von Cup1p und einer höheren Kupferbeständigkeit (Abbildung 1). Im Vergleich zu anderen Reportergenen beeinflusst CUP1 die Zelllebensfähigkeit bereits bei niedrigen Konzentrationen, hat einen großen Sensitivitätsbereich und kann verwendet werden, um Mutationen ^3,6,7 direkt für das Spleißen^auszuwählen. Darüber hinaus ist CUP1 für das Standard-Hefewachstum nicht essentiell, so dass die zelluläre Homöostase während des Aufbaus für diesen Assay nicht beeinflusst wird. Ergänzend zu Deletions- oder Temperaturwachstumsassays liefert ACT1-CUP1 Informationen über die Auswirkungen auf das Spleißen unter ansonsten optimalen Hefewachstumsbedingungen.

Das Spleißosom erkennt sein Substrat durch drei intronische Sequenzen, nämlich die 5'-Spleißstelle (5' SS), die Zweigstelle (BS) und die 3'-Spleißstelle (3' SS). Zahlreiche ACT1-CUP1-Reporter wurden an diesen Standorten generiert, die Nicht-Konsens-Sequenzen enthalten. Eine Auswahl der häufigsten ACT1-CUP1-Reporter ist in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt. Da das Spleißosom mit jeder Spleißstelle an verschiedenen Punkten des Spleißzyklus einzigartig interagiert, kann die Robustheit des Spleißosoms in verschiedenen Schritten getestet werden, je nachdem, welcher Nicht-Konsens-Reporter verwendet wird. Nicht-Konsens-Reporter werden nach der mutierten Position innerhalb des Introns und der Basis, zu der es mutiert wurde, benannt. Zum Beispiel ist A3c ein Reporter mit einer Mutation am 5' SS, insbesondere Position 3 vom Konsensadenosin zu einem Cytosin. Dieser Reporter wird stark mit Spleißosomenmutationen interagieren, die die 5'-SS-Selektion und -Verwendung beeinflussen. In ihrer ersten Studie bestimmten Lesser und Guthrie, welche 5'-SS-Mutationen das Spleißen hemmten³. Später im selben Jahr wurden Nicht-Konsens-Reporter an allen drei Spleißstellen von Burgess und Guthrie in einem Suppressor-Screening von Mutationen in der ATPase Prp16p⁹ veröffentlicht. Der ACT1-CUP1-Assay war ein wichtiger Schlüssel zum Verständnis der Robustheit und Selektivität des Hefespleißosoms und zur Ableitung der Funktion der Spleißosomen anderer Eukaryoten.

Da ACT1-CUP1-Reporter ohne Konsens das Spleißosom für weitere Störungen sensibilisieren, kann der Einfluss einer einzelnen Spleißfaktormutation durch die Reporter charakterisiert werden, die sie positiv oder negativ beeinflusst. Dies wurde auf vielfältige Weise auf das Spleißen von Forschungsfragen angewendet. Erstens kann und wurde der ACT1-CUP1-Assay als genetischer Screen für Mutationen in Spleißfaktoren verwendet. So dient beispielsweise Prp8p, das größte Spleißprotein, als Plattform, auf der der RNA-Kern des Spleißosoms die Spleißreaktion katalysiert. Dies wurde zum Teil dadurch abgeleitet, wie Prp8p-Mutanten das Spleißen verschiedener ACT1-CUP1-Reporter verbesserten oder reduzierten 10,11,12,13,14,15,16,17. Andere Proteinkomponenten des Spleißosoms wurden ebenfalls mit ACT1-CUP1 untersucht, darunter Hsh155p, Cwc2p, Cef1p und Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. Die energetischen Schwellenwerte für Prp16p und vier weitere ATPasen, die am spleißeosomalen Übergang beteiligt sind, wurden ebenfalls mit diesem Assay 9,26,27,28,29,30 untersucht. Die kleinen nukleären RNAs (snRNAs) wurden ebenfalls umfassend unter Verwendung von ACT1-CUP1 untersucht, um die von ihnen koordinierten prä-mRNA-Sequenzen und die Veränderungen in der Sekundärstruktur der snRNAs während des Spleißens zu identifizieren 3,31,32,33,34,35,36,37.

Der ACT1-CUP1-Assay erfordert einen Hefestamm, bei dem alle Kopien des CUP1-Gens ausgeschaltet wurden. Da CUP1 eine hohe Exemplarzahl ^6,38 haben kann, kann die Vorbereitung eines vollständigen Knock-out-Stammes mehrere Runden oder ein umfangreiches Screening erfordern. Infolgedessen wurden Cup1Δ-Hefestämme oft zwischen Laboren geteilt, ebenso wie die Reporter.

Wenn Mutation(en) in einem Spleißfaktor anhand einer Plasmidkopie beurteilt werden, sollte das Wildtyp-Gen für diesen Faktor ausgeschaltet werden. Darüber hinaus sollte der Hefehintergrund die Auswahl von mindestens zwei Plasmiden ermöglichen, von denen eines einen ACT1-CUP1-Reporter enthält, das historisch auf einem Leucin-Nährstoffselektionsplasmid basiert, und eines, das eine Mutation oder Störung in der zu untersuchenden Spleißmaschinerie enthält (Abbildung 2). In der Regel testen in einem einzigen Assay mehrere Hefestämme, von denen jeder die QSP (Query Splicing Perturbation) trägt, und ein anderer Reporter die Auswirkungen der Abfrage auf das Spleißen.

Die unabhängigen Variablen im ACT1-CUP1-Assay ermöglichen es einem Forscher, den Schweregrad eines QSP zu beurteilen. Diese unabhängigen Variablen sind die Konzentration von Kupfer und die Auswahl mehrerer Nicht-Konsens-Spleißreporter. Erstens, da die Hefestämme auf Platten gezüchtet werden, die eine Reihe von Kupferkonzentrationen enthalten (Abbildung 2), beinhaltet die Erstellung des Assays die Auswahl des verwendeten Konzentrationsgradienten. Studien können einen Kupferkonzentrationsgradienten verwenden, um eine erste Anzeige der Lebensfähigkeit zu erhalten, und dann den Assay mit einem feineren Gradienten wiederholen, um subtile Rentabilitätsunterschiede zu identifizieren. Die zweite Variable ist die große Auswahl an ACT1-CUP1-Reportern, die getestet werden können (Abbildung 1 und Tabelle 1). Wenn der QSP die Lebensfähigkeit der Hefe in Gegenwart eines Nicht-Konsens-Reporters anders beeinflusst als der Wildtyp, kann der Schluss gezogen werden, dass der QSP einen Schritt beim Spleißen oder einen Bereich des Spleißosoms beeinflusst, der während der Erkennung oder Verarbeitung dieser Region des Introns wichtig ist.

Die Hefe-Toolbox ist umfangreich und der ACT1-CUP1-Assay ist ein integraler Bestandteil der Spleißforschung. Der ACT1-CUP1-Assay wird häufig zusammen mit einer eingehenderen genetischen, strukturellen und/oder biochemischen Analyse auf die Auswirkungen eines QSP durchgeführt. Da diese detaillierteren Studien in der Regel ein längeres Verfahren und/oder einen höheren Preis haben, ist ein häufiger Ansatz, zuerst mit ACT1-CUP1 nach interessanten Mutanten zu suchen.

Hier wird ein ACT1-CUP1-Assay-Protokoll einschließlich Kupferplattenvorbereitung bereitgestellt. Dieser Assay liefert den Forschern eine erste Antwort auf die Wirkung eines QSP auf das Spleißen und welche intronischen Regionen am stärksten von der Störung betroffen sind.

Protokoll

1. Hefestammkonstruktion

1. Erzeugen oder erhalten Sie einen S. cerevisiae-Stamm , dessen Hintergrund leu2 und cup1Δ umfasst. Um diesen Hintergrund zu erzeugen, verwenden Sie die etablierte Hefemethode, die Lithiumacetat und einzelsträngige DNA³⁹ verwendet.
   HINWEIS: Haploide Hefestämme können eine, zwei oder mehr Kopien von CUP1 ^6,38 enthalten. Beziehen Sie sich auf genomische Informationen für den ausgewählten Hefestamm, wenn Sie Knock-out-Primer entwerfen, die die CUP1-Genorte flankieren.
2. Führen Sie eine Hefetransformation durch, um das QSP entweder durch genomische Inkorporation oder auf einem Plasmid einzubauen. Verwenden Sie ein etabliertes Protokoll, wie es in früheren ^Forschungen 40,41,42 beschrieben wurde.
3. Führen Sie eine Hefeumwandlung mit den resultierenden Stämmen aus Schritt 1.2 durch. , um das gewünschte ACT1-CUP1-Reporterplasmid hinzuzufügen.
   HINWEIS: Die Zellen müssen auf Leucin-Drop-out-Platten (-Leu) und -Medien gehalten werden, um die Retention der ACT1-CUP1-Reporterplasmide nach dieser Transformation sicherzustellen.
4. Führen Sie die Schritte 1.2 aus. und 1.3. für jedes zu testende QSP- und jedes ACT1-CUP1-Reporterplasmid, einschließlich Kontrollstämme.

2. Kupferplattenvorbereitung

1. Wählen Sie einen Kupferkonzentrationsbereich, der zu den zu testenden Reportern geeignet ist (siehe Tabelle 1 für die Letalität häufig verwendeter Reporter).
   HINWEIS: Ein Beispiel für einen umfassenden Kupferkonzentrationsbereich sind 30 verschiedene Kupferkonzentrationen von 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM und 2,5 mM Cu²⁺.
2. Stellen Sie eine Stammlösung aus 1 M_CuSO4 und einen sterilen Filter durch einen 0,22 μm PES (Polyethersulfon) Sterilfilter her.
3. Bereiten Sie pro gewünschter Kupferplatte eine 2 ml Verdünnung der CuSO_4-Brühe in sterilem Wasser vor.
   HINWEIS: Da die Platte mit 0 mM Cu 2+ immer als Referenz analysiert und abgebildet wird, wird empfohlen, zwei 0 mM Cu²⁺ Platten herzustellen, eine am Anfang und eine am Ende des Galvanisierungsschritts (Schritt 3.4.).
   1. Berechnen Sie die Lagermenge für die gewünschte Kupferendkonzentration in 40 ml des Plattenvolumens (Zusatztabelle 1).
   2. Die berechnete Menge steriles Wasser und 1 M CuSO₄ Schaft in ein steriles 2 ml Röhrchen geben.
4. Gießen Sie Platten für den ACT1-CUP1-Assay.
   HINWEIS: Eine Alternative zum folgenden Protokoll besteht darin, die Medien und Agar zunächst in einem großen Behälter zu kombinieren und nach dem Autoklavieren in kleinere Behälter aliquot zu machen, um unterschiedliche Kupferkonzentrationen für jede Platte zu erreichen. Unabhängig davon, welche Methode gewählt wird, ist es wichtig sicherzustellen, dass die Medienkonzentration zwischen allen Platten konsistent ist, obwohl jede eine andere Kupferkonzentration aufweist.
   1. Beschriften Sie jede leere Platte, die gegossen werden soll, mit der endgültigen Kupferkonzentration, die sie enthält. Bereiten Sie mindestens eine quadratische Platte pro zu prüfender Kupferkonzentration vor.
   2. Kennzeichnen Sie eine 100-ml-Flasche pro zu testender Kupferkonzentration.
   3. Zu jeder Flasche fügen Sie 790 mg Agar (2% w/v Agar) und einen Rührriegel hinzu.
   4. In einem großen Becherglas das -Leu-Wachstumsmedium für alle zu gießenden Kupferplatten vermischen. Pro herzustellender Platte werden 265 mg Hefestickstoffbase (YNB) und 64 mg Drop-out-Mischung minus Leucin (und alle anderen Nährstoffe, die zur Aufrechterhaltung des QSP-Plasmids in den Zellen erforderlich sind) in 34 ml entionisiertem Wasser gelöst.
   5. Zu jeder vorbereiteten 100-ml-Flasche 34 mL der -Leu-Wachstumsmedienlösung geben und mit Aluminiumfolie verschließen. Beschriften Sie die Folie mit der vorgesehenen Kupferkonzentration.
   6. Autoklav zum Sterilisieren und Auflösen des Agars unter Verwendung des empfohlenen Flüssigkeitszyklus für den Autoklaven.
   7. Geben Sie so schnell wie möglich 4 ml 20% w/v Glukose (steril gefiltert) in jede Flasche.
   8. Passen Sie die Etiketten an und fügen Sie die 2-ml-Verdünnungen von CuSO₄ in die beabsichtigte Flasche hinzu.
      HINWEIS: Da Dutzende von Kupferplatten gleichzeitig hergestellt werden können, jede mit einer anderen Konzentration, verhindert das Kennzeichnen aller Flaschen, Röhrchen und Platten deutlich mit der beabsichtigten Kupferkonzentration Verwechslungen beim Gießen der Platte.
   9. Verwenden Sie eine Rührplatte, um ~ 30 s zu mischen und gießen oder pipeten Sie 35 ml in die beschriftete Platte, um Blasen zu vermeiden. Vor der Lagerung oder Verwendung abkühlen lassen.
      HINWEIS: Häufig werden die Platten 1 Tag oder 2 Tage vor dem Test hergestellt und bei 4 °C bis einige Stunden vor Gebrauch gelagert. Die Platten sollten Raumtemperatur (RT) haben, bevor die Beschichtung beginnt (Schritt 3.4.).

3. ACT1-CUP1 Assay

1. Streifen Sie die gewünschten Stämme auf -Leu-Platten aus.
   HINWEIS: Wenn Sie mit Kryobeständen arbeiten, sollte darauf geachtet werden, dass die Zellen vor der Beschichtung ausreichend aus der Lagerung wiederbelebt werden. Ein empfohlenes Verfahren hierfür ist es, aus dem kryogenen Bestand zu streifen und ihn 3-5 Tage bei 30 °C wachsen zu lassen. Dann ein kleines Muster umwerfen und weitere 2-3 Tage bei 30 °C wachsen lassen.
2. Züchten Sie über Nacht Kulturen in 10 ml Medien.
   1. Die -Leu-Wachstumsmedien werden mit den gleichen Verhältnissen wie in Schritt 2.4.2 beschrieben hergestellt. Pro 10 ml Medium werden 66 mg Hefestickstoffbase (YNB) und 16 mg Drop-out-Mischung minus Leucin zu 9 ml entionisiertem Wasser gegeben. Durch einen 0,22 μm PES-Sterilfilter geleitet.
   2. Pro Hefestamm werden 9 ml -Leu-Wachstumsmedien und 1 ml 20% w/v-Glucose (steril gefiltert) in ein steriles 50-ml-konisches Röhrchen gegeben.
   3. Sammeln Sie mit einem sterilen Stab oder einer Pipetenspitze ein kleines (~ 1 mm rundes) Hefemuster und impfen Sie das Medium.
   4. Alle Nachtkulturen bei 180 U/min und 30 °C schütteln.
      HINWEIS: Falls verfügbar, können Rotatoren anstelle eines Shakers verwendet werden.
3. Die Stämme werden auf einen OD₆₀₀ 0,5 ± 0,05 in 10% Glycerin verdünnt.
   1. Pro Stamm 100 μL Kultur in eine Küvette mit 900 μL Wasser geben.
   2. Messen Sie den OD₆₀₀ mit einem Spektralphotometer.
   3. Berechnen Sie die erforderliche Verdünnung bei einem OD₆₀₀ von 0,5 in einem Endvolumen von 2 ml.
   4. Verdünnen Sie jeden Stamm auf OD₆₀₀ 0,5 in 10% Glycerin (steril).
   5. Messen Sie den OD₆₀₀ erneut, um zu bestätigen, dass die Zelldichte im gewünschten Bereich von 0,5 ± 0,05 liegt.
4. Platten Sie die Dehnungen auf den Kupferplatten.
   HINWEIS: Eine Vielzahl von Methoden kann verwendet werden, um die Stämme zu beschichten, einschließlich Handpipettieren von 5-10 μL-Volumina, Verwendung eines Wiederholungs- oder Mehrkanalpipettors oder Stanzen mit einem Pin-Replikator. Diese letzte Methode wird unten beschrieben, obwohl die meisten Schritte unabhängig von der Methode ähnlich sind.
   1. Richten Sie einen sterilen Arbeitsplatz und einen brennenden Bunsenbrenner ein.
   2. Bei einem 48-poligen Replikator pipieren Sie 200 μL jedes verdünnten Stammes in eine separate Vertiefung einer 96-Well-Platte. Füllen Sie die leeren Räume im 6 x 8 Raster mit 200 μL 10% Glycerin (steril).
      HINWEIS: Ein Beispiel für ein Beschichtungsschema für neun Hefestämme ist in Zusatztabelle 2 enthalten.
   3. Tauchen Sie den Replikator in eine flache Schale mit 95% (v / v) Ethanol und flammen Sie zur Sterilisation. Lassen Sie es mindestens 2 Minuten abkühlen, nachdem die Flamme erloschen ist, um einen Hitzeschock der Zellen zu vermeiden.
   4. Stellen Sie vier Teller in die Nähe des Brenners und entfernen Sie die Deckel.
   5. Tauchen Sie den Replikator in die 96-Well-Platte und heben Sie ihn in einer schnellen Bewegung an.
   6. Vorsichtig auf den Teller legen und leicht hin und her schaukeln, um einen guten Transfer zu erleichtern.
   7. Mit einer schnellen Bewegung anheben und in genau der gleichen Ausrichtung in die 96-Well-Platte legen.
   8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für bis zu drei weitere Platten. Wiederholen Sie den Vorgang, indem Sie den Replikator in Ethanol tauchen, brennen, um zu sterilisieren, und warten, um alle vier Platten abzukühlen.
   9. Nachdem eine Platte beschichtet wurde, bewegen Sie sich mit einer sanften Bewegung zur Seite, aber immer noch innerhalb des Sterilisationsschirms der Flamme.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Hefeverdünnungen und -beschichtungen in der Nähe einer Flamme durchzuführen. Die Platten können beim Trocknen leicht verunreinigen.
   10. Lassen Sie die Teller vollständig trocknen, bevor Sie die Deckel aufsetzen, normalerweise 3-5 min.
   11. Die Platten 3 Tage bei 30 °C inkubieren.

4. Datenerhebung und -analyse

1. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und prüfen Sie sie visuell.
2. Nehmen Sie die Bilder der Platten mit einer verfügbaren Kamera oder einem anderen digitalen Bildgebungssystem auf.
3. Aufzeichnung (oder Punktzahl) für jede Sorte wird das letzte sichtbare Wachstum der Kupferkonzentration beobachtet.
   HINWEIS: Die Zellen sind in der Lage, sich zu spleißen und bis zu dieser Konzentration lebensfähig zu bleiben. Verwenden Sie aus Gründen der Konsistenz immer die gleiche Methode, entweder mit dem Auge oder anhand der Plattenbilder, um die letzte lebensfähige Kupferkonzentration zu ermitteln. Sehr kleine Kolonien sind manchmal mit dem Auge sichtbar, aber nicht auf dem Bild. Der Unterschied zwischen direkter visueller Inspektion oder Aufzeichnung von Bildern ist gering, normalerweise ein Schritt im Farbverlauf. Da Bilder der Kolonien häufig in Publikationen verwendet werden, wird eine Bewertung anhand der Bilder empfohlen.
4. Kombinieren Sie Daten aus mehreren ACT1-CUP1-Assays für denselben Stamm, um Rückschlüsse darauf zu ziehen, wie sich der QSP auf das Spleißen auswirkt.
   HINWEIS: Die Veröffentlichungszahlen zeigen üblicherweise Bilder der Hefekolonien bei 0 mM Cu²⁺ Konzentration, der letzten lebensfähigen Kupferkonzentration und der nachfolgenden Konzentration, in der die Kolonie gestorben ist. Daten können auch als Balkendiagramm mit Fehlerbalken für die Standardabweichung zwischen Replikaten angezeigt werden. Die Daten müssen nicht normalisiert werden, sondern können durch Setzen der Lebensfähigkeit der WT-Spleißfaktorkontrolle auf 1 und Vergleich der Wirkung der eingeführten Mutation(en) erfolgen.

Ergebnisse

Wachstumsassays wie ACT1-CUP1 erfordern die visuelle, vergleichende Beurteilung mehrerer Kolonien. Hier wurde jeder Stamm über Nacht bis zur Sättigung gezüchtet, auf einen OD₆₀₀ von 0,5 verdünnt und auf 20 Platten mit einem Bereich von Kupferkonzentrationen von 0 mM bis 1,1 mM CuSO₄ plattiert (Abbildung 3). Dieser Bereich ist kleiner als der im Protokoll aufgeführte, da er eine vollständige Bewertung der Auswirkungen der verwendeten und unten beschriebenen QSPs und ACT1...

Diskussion

ACT1-CUP1 ist ein Wachstumstest, und es muss darauf geachtet werden, dass beobachtete Wachstumsunterschiede nur auf Spleißfehler zurückzuführen sind. Alle Stämme sollten vor der Beschichtung auf ähnliche Weise gehandhabt werden, einschließlich einer ähnlichen Länge und Art von Wachstums- und Lagerbedingungen. Bei Verwendung temperaturempfindlicher Stämme sollten ACT1-CUP1-Assays nur unter Bedingungen durchgeführt werden, unter denen diese Stämme vergleichbar mit Wildtypen wachsen. In diesem Zusammenhang wird für die QSP-...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-129	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
2 mL sterile Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-138	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
50 mL sterile Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	07-201-332	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
96-Well-Mikrotiterplatte mit rundem Boden	Fisher Scientific	07-200-760	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
190 Proof Ethanol	Fisher Scientific	22-032-600	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
500 mL Filtersystem (0,22 &Mikro; m)	CellTreat Scientific Products	229707	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Agar	Fisher Scientific	BP1423-500	Jedes Agar in molekularer Qualität funktioniert.
Autoklav	Tuttnauer	3870EA	oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Bunsenbrenner	Humboldt	PN6200.1	oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Zelldichtemessgerät	VWR	490005-906	Oder ein anderes Spektralgerät, das die Absorption bei 595 nm messen kann.
Kupfersulfat Pentahydrat	Fisher Scientific	LC134051	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Digitales Bildgebungssystem	Cytiva	29399481	ImageQuant 4000 (verwendet für Abbildung 3)  Amersham ImageQuant 800, oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Dropout-Mix (-Leu)	USBiological Life Sciences	D9525	Verwenden Sie den passenden Dropout-Mix für Ihr Experiment. Es ist möglich, dass Sie auch einen Hefenährstoffmarker für Ihre Abfragestörung verwenden. In diesem Fall sollte die Drop-Out-Mischung für diesen Marker und Leu
D-Glucose	Fisher Scientific	AAA1682836	Oder einen vergleichbaren Artikel von einem anderen Hersteller sein.
Gelband-Quantifizierungssoftware	Cytiva	29-0006-05	ImageQuant TL v8.1 (verwendet für Abbildung 5A) oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Handkamera	Nikon	D3500	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Nahinfrarot-Gel-Bildgebungsgerät	Cytiva	29238583	Amersham Typhoon NIR (in Abbildung 5a verwendet) oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Klemme in Laborqualität	Fisher Scientific	05-769-7Q	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Ständer und Klemme in Laborqualität	Fisher Scientific	12-000-101	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Magnetrührstäbchen	Fisher Scientific	14-513-51	Oder vergleichbarer Artikel von einem anderen Hersteller.
Pin-Replikator	VP Scientific	VP 407AH
Semi-Mikro-Einwegküvetten	VWR	97000-590	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Schüttler	JEIO Tech	IST-3075	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.
Spektralphotometer	Biowave	80-3000-45	Oder jedes Spektophotometer, das die Extinktion bei 600 nm messen kann.
Quadratische Platten	VWR	102091-156	Kreisförmige Platten können ebenfalls verwendet werden, sind jedoch schwieriger, wenn ein Pin-Replikator verwendet wird.
Rührplatte	Fisher Scientific	11-520-16S	Oder vergleichbarer Artikel von einem anderen Hersteller.
Hefestickstoffbasis	USBiological Life Sciences	Y2025	Oder vergleichbarer Artikel eines anderen Herstellers.