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Methodenartikel

Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro

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DOI:

10.3791/63247

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10. Dezember 2021

 ,  , 
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.

Zusammenfassung

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg reguliert die intrazelluläre Aktinfilamentorganisation und die polarisierte Migration von Vorläuferzellen während der Embryogenese. Dieser Prozess erfordert komplexe und koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen. Da diese Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Linien auftreten können, kann die In-vivo-Bewertung zellspezifischer Defekte eine Herausforderung darstellen. Die vorliegende Studie beschreibt eine hochreproduzierbare Methode zur Bewertung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. Dieses Protokoll wurde mit der Fähigkeit entwickelt, (1) funktionelle und molekulare Bewertungen der nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung zwischen zwei beliebigen Zelltypen von Interesse durchzuführen; (2) die Rolle von signalsendenden versus signalempfangenden Molekülen im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg analysieren; und (3) phänotypische Rettungsexperimente mit molekularen oder pharmakologischen Standardansätzen durchführen.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung in Myoblasten zu bewerten. Das Vorhandensein von NCCs ist mit einer erhöhten Anzahl von Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien in Myoblasten und einer verbesserten Myoblastenmigration in einem Wundheilungstest verbunden. Die Wnt5a-ROR2-Achse wurde als entscheidender nichtkanonischer Wnt-Signalweg zwischen NCC- und Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds (SHF) identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies ein sehr gut handhabbares Protokoll ist, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalmechanismen in vitro zu untersuchen.

Einleitung

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der die zelluläre Filamentorganisation und die gerichtete Migration reguliert. Dieser Signalweg wurde an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der embryonalen Gewebemorphogenese 1,2,3, der lymphatischen und vaskulären Angiogenese4,5,6,7 und des Krebswachstums und der Metastasierung 8,9,10 . Auf zellulärer Ebene wird die nichtkanonische Wnt-Signalisierung durch koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durchgeführt. Diese Wechselwirkungen treten häufig zwischen Zellen verschiedener Linien oder Typen auf und umfassen ein vielfältiges molekulares Netzwerk, das bis zu 19 Liganden und mehrere Rezeptoren, Co-Rezeptoren und nachgeschaltete Signaltransduktionseffektoren umfasst11. Frühere Studien haben gezeigt, dass Liganden-Rezeptor-Kombinationen kontext- und gewebeabhängig variieren können 12,13 und dass dieselben Quellliganden, die die nichtkanonische Wnt-Signalisierung in signalempfangenden Zellen antreiben, von mehreren signalsendenden Zelltypen produziert werden können 14,15 . Angesichts der zellulären und molekularen Komplexität, die mit der nichtkanonischen Wnt-Signalgebung verbunden ist, war die Fähigkeit, individuelle und klinisch relevante Mechanismen in vivo zu untersuchen, begrenzt.

Es wurden Versuche unternommen, die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung mit Zellkulturtechniken in vitro zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Wundheilungsassays, die in zellulären Monoschichten durchgeführt wurden, verwendet, um die zelluläre gerichtete Migration funktionell zu beurteilen 4,16,17,18,19. Immunfärbungstechniken wurden verwendet, um räumliche Analysen der Oberflächenproteinexpression durchzuführen, um nicht-kanonische Wnt-induzierte Veränderungen in der zellulären Morphologie 7,10, Architektur und asymmetrischen Polarisation18,19,20 zu bewerten. Obwohl diese Ansätze wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von Wnt-bezogenen Phänotypen in Signalempfangszellen geliefert haben, schränkt das Fehlen von signalsendenden Komponenten in diesen Protokollen ihre Fähigkeit ein, parakrine Signalmechanismen, die in vivo beobachtet wurden, genau zu modellieren. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an der Entwicklung von In-vitro-Systemen, die eine robuste und reproduzierbare Bewertung parakriner Signalwechselwirkungen zwischen signalsendenden und empfangenden Zellen des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere zwischen Zellen verschiedener Zelltypen, ermöglichen.

Zu diesem Zweck war das primäre Ziel dieser Studie, ein Protokoll zur Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu erstellen. Wir entwickelten ein berührungsloses Kokultursystem, das signalsendende und signalempfangende Komponenten dieser Interaktionen rekapituliert und die Verwendung molekularer, genetischer oder pharmakologischer Standardansätze ermöglicht, um spezifische Ligandenrezeptormechanismen im nichtkanonischen Wnt-Signalweg unabhängig voneinander zu untersuchen. Mechanismen der NCC-vermittelten Wnt-Signalübertragung wurden in Myoblasten mit etablierten murinen Zelllinien untersucht. Als Beweis des Prinzips wurde dieses Modell verwendet, um Ergebnisse früherer In-vivo-Studien an Mäusen zu bestätigen, die die Wnt5a-ROR2-Achse als relevanten nicht-kanonischen Wnt-Signalweg zwischen NCCs21 und SHF-Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen 3,22,23 implizieren.

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Protokoll

1. Präexperimentelle Expansion und Passaging von Zellen

  1. C2C12-Zellkultur:
    1. Bereiten Sie 500 ml C2C12-Kulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin kombinieren.
    2. Eine Durchstechflasche mit C2C12-Zellen im 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Während die C2C12-Zellen auftauen, fügen Sie 5 ml C2C12-Medium zu einem 15-ml-konischen Röhrchen hinzu. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen sofort mit einer P1000-Pipette in das 15-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: C2C12-Zellen sind murine Myoblastenzellen, die zuvor als primäre Zelllinie zur Modellierung von Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen verwendet und validiert wurden.
    3. Mischen Sie C2C12-Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette in das konische Röhrchen. Dann wird das gesamte Volumen der aufgetauten Zellen in C2C12-Medium (6 ml) in einen 75 cm2-Kolben gegeben.
    4. 6 ml frisches C2C12-Medium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Drehen Sie den Kolben vorsichtig so, dass die Zelle und die Medienlösung den gesamten Boden des Kolbens bedecken. Der Kolben wird in einen Zellkulturinkubator (37 °C, 5%CO2) gegeben, damit die Zellen anhaften können.
    5. Lassen Sie die Zellen im Inkubator expandieren, bis sie ~ 60% Konfluenz erreichen.
      HINWEIS: Dies kann bestimmt werden, indem die Zellen regelmäßig aus dem Inkubator entnommen und ihr Zusammenfluss schnell unter einem Mikroskop überprüft werden. Achten Sie darauf, die Zeit zu minimieren, in der Zellen aus dem Inkubator entfernt werden.
  2. Passieren von C2C12-Zellen:
    1. Erwärmen Sie das C2C12-Medium, 500 ml 1x PBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad. Nachdem die Reagenzien erwärmt wurden, werden alle Reagenzien in die Zellkulturhaube überführt.
    2. Bringen Sie den Kolben mit den C2C12-Zellen in die Zellkulturhaube. Spülen Sie den Kolben mit den C2C12-Zellen zweimal vorsichtig mit warmem 1x PBS ab.
      1. Neigen Sie den Kolben in einem Winkel von 45° und saugen Sie das C2C12-Medium mit einer Glaspipette ab, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Unter Beibehaltung eines 45°-Winkels geben Sie vorsichtig 10 ml warmes 1x PBS mit einer serologischen Pipette in die Ecke des Kolbens. Legen Sie den Kolben flach auf die Oberfläche und bewegen Sie den Kolben vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass der 1x PBS über die gesamte Monoschicht der Zellen gewaschen wird.
        HINWEIS: Achten Sie darauf, die C2C12-Monoschicht beim Ansaugen des Mediums nicht zu stören.
    3. Entfernen Sie das 1x PBS nach dem zweiten Waschgang. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben geben, den Kolben wie oben beschrieben vorsichtig bewegen, damit sich die Trypsin-EDTA-Lösung über so viel Monoschicht wie möglich verteilen kann, und den Kolben für 2 min in den Inkubator stellen.
    4. Nach 2-minütiger Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig darauf klopfen, um die verbleibenden Zellen zu lösen.
    5. 9 ml C2C12-Medium mit einer serologischen Pipette in den Kolben geben, um das Trypsin abzuschrecken. Spülen Sie die Zellen mit der serologischen Pipette vorsichtig mit dem Medium ab und sammeln Sie die 10 ml trypsinisierte Zellsuspension. 10 mL der Zellsuspension in ein frisches 15 ml konisches Röhrchen geben und bei 100 × g für 5 min zentrifugieren.
    6. Bringen Sie das konische Rohr zur Zellkulturhaube zurück und entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Achten Sie beim Absaugen des Überstands darauf, das Zellpellet am Boden des konischen Röhrchens nicht zu stören. Lassen Sie dazu ~0,2 ml des Überstands in der konischen Röhre. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml frischem C2C12-Medium.
    7. Für zusätzliches Passaging wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. 11 ml C2C12-Medium mit einer serologischen Pipette in den Kolben geben und den Kolben in den Inkubator geben.
  3. STO-Zellkultur:
    1. Bereiten Sie das STO-Kulturmedium vor, indem Sie 500 ml DMEM mit 7% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 nM L-Glutamin herstellen.
    2. Bereiten Sie 0,1% Gelatine vor, indem Sie 0,5 g Gelatinepulver in eine Flasche mit 500 ml gewebetauglichem oder autoklaviertem Wasser geben. 7 ml 0,1%ige Gelatinelösung in einen 75 cm2-Kolben geben. Der Kolben wird so gedreht, dass die Gelatinelösung den gesamten Boden des Kolbens bedeckt. Lassen Sie den Kolben 30 min bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube inkubieren.
    3. Nach 30-minütiger Inkubation entfernen Sie die überschüssige Gelatine mit einer Pipette, die an die Vakuumabsaugung angeschlossen ist. Lassen Sie die Kolben vor Gebrauch weitere 30 Minuten im Inkubator stehen.
    4. Eine Durchstechflasche mit STO-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Mit einer P1000-Pipette werden die aufgetauten Zellen sofort in ein 15-ml-konisches Röhrchen überführt, das 5 ml frisch zubereitetes STO-Kulturmedium enthält.
      HINWEIS: STO-Zellen sind murine embryonale Fibroblasten, die routinemäßig als Feederzellen in Zellkulturprotokollen verwendet werden.
    5. Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette in der konischen Röhre. Das gesamte Volumen (6 ml) der Zellen wird in einen mit Gelatine beschichteten 75 cm2-Kolben gegeben. Drehen Sie den Kolben, um sicherzustellen, dass die Zellsuspension gut am Boden des Kolbens verteilt ist.
    6. 6 ml frisches STO-Medium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Drehen Sie den Kolben wie oben beschrieben, um sicherzustellen, dass die Zellen und das Medium gut am Boden des Kolbens verteilt sind. Der Kolben wird in den 37 °C-Inkubator gestellt, damit die Zellen anhaften können. Lassen Sie die Zellen im Inkubator vermehren, bis sie ~ 60-70% Konfluenz erreichen.
  4. Übergeben von STO-Zellen:
    1. Warmes STO-Zellmedium, 1xPBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
    2. Der Kolben mit den STO-Zellen wird wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben zweimal mit warmem 1x PBS vorsichtig abgespült.
    3. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA mit einer P1000-Pipette in den Kolben geben. Der Kolben wird für 5 min in den 37 °C-Inkubator gestellt.
    4. Nach 5 Minuten Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen. Klopfen Sie vorsichtig auf den Kolben, um alle anhaftenden Zellen zu lösen.
    5. 9 ml STO-Medium in den Kolben geben, um das Trypsin abzuschrecken, und die 10 ml trypsinisierte Zellsuspension wie oben beschrieben auffangen. 10 mL der Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen geben und bei 100 × g für 5 min zentrifugieren.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml STO-Medium wie oben beschrieben. Für zusätzliches Passaging wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. Fügen Sie 11 ml STO-Medium hinzu, drehen Sie den Kolben, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und des Mediums entlang des Kolbenbodens zu gewährleisten, und legen Sie den Kolben in den Inkubator.
  5. Inaktive STO-Zellkultur und O9-1-Zell-Basalmediumpräparation:
    1. Bereiten Sie das Basalkulturmedium O9-1 der Zelle vor, indem Sie 500 ml DMEM mit 15% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin, 2 nM L-Glutamin, mindestens 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 1 nM Natriumpyruvat und 55 μM Beta-Mercaptoethanol mischen.
    2. Bereiten Sie Mitomycin-C-Lösung in 1x PBS in einer Konzentration von 0,5 mg / ml vor, indem Sie 4 ml 1x PBS direkt in eine Durchstechflasche mit Mitomycin C geben. Pipetten Sie die Lösung mehrmals mit einer P1000-Pipette. Um das Mitomycin C in 1x PBS weiter aufzulösen, stellen Sie die Durchstechflasche für 45 min bis 1 h auf einen Vortex-Mixer oder Tischwippen.
    3. Inaktivieren Sie die STO-Zellen, indem Sie die STO-Platten mit einer Endkonzentration von 0,01 mg/ml Mitomycin C behandeln, die dem Standard-STO-Medium zugesetzt werden. Legen Sie die STO-Platten für 2 Stunden in den Inkubator und achten Sie darauf, den Kolben mit Mitomycin C vor Licht zu schützen, indem die Zeit außerhalb des Inkubators minimiert wird. Nach der Behandlung mit Mitomycin die Zellen zweimal in 1x PBS waschen, wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben.
      HINWEIS: Mitomycin C hemmt die Proliferation von STO-Zellen, so dass sie verwendet werden können, um konditioniertes Medium über mehrere Tage zu erzeugen, ohne im Kolben überkonfluent zu werden.
    4. Nach dem Entfernen des 1x PBS 12 mL O9-1 Basalkulturmedium in die inaktivierten STO-Zellkulturen geben und 24 h inkubieren. Sammeln Sie das konditionierte, inaktivierte Basalkulturmedium STO + O9-1 und legen Sie es in 50 ml konische Röhrchen, die in Folie eingewickelt sind, um es vor Licht zu schützen.
    5. Geben Sie 12 ml frisches O9-1-Basalkulturmedium wie oben beschrieben zu den inaktivierten STO-Zellkulturen. Wiederholen Sie diesen Schritt, indem Sie alle 24 h frisches O9-1-Basalkulturmedium zu denselben Flanken geben, die die inaktivierten STO-Zellen enthalten.
      HINWEIS: Nach der Behandlung mit Mitomycin C können sich die inaktivierten STO-Zellen nicht vermehren; Daher können die Kolben mit den inaktivierten STO-Zellen wiederverwendet werden, um konditioniertes Medium zu erzeugen.
    6. Lagern Sie die folienumwickelten 50 mL konischen Röhrchen mit konditioniertem, inaktiviertem STO + O9-1 Basalkulturmedium bei 4 °C, bis insgesamt 500 mL des Mediums gesammelt wurden.
  6. O9-1 Zellkultur:
    1. Bereiten Sie das O9-1-Zellwachstumskulturmedium unter Verwendung von 500 ml konditioniertem STO + O9-1-Basalmedium vor und fügen Sie 103 Einheiten Leukämie-Hemmfaktor (LIF) und 25 ng / ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (Basis-FGF) hinzu.
    2. 0,1%ige mit Gelatine überzogene Kolben werden wie in den Schritten 1.3.2-1.3.3 beschrieben hergestellt.
    3. Eine Durchstechflasche mit O9-1-Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Die aufgetauten Zellen werden sofort in ein 15 ml konisches Röhrchen überführt, das 5 ml frisch zubereitetes O9-1-Wachstumsmedium enthält.
      HINWEIS: Die O9-1-Zelllinie ist die einzige stabile, multipotente Neuralleistenzelllinie, die aus der Maus erzeugt wurde. Diese Zelllinie wird häufig in Neuralleisten-In-vitro-Experimenten verwendet.
    4. Mischen Sie die Zellen vorsichtig mit einer serologischen Pipette. Die gesamten 6 ml Zellen in einen mit Gelatine beschichteten 75 cm2-Kolben geben.
    5. 6 ml O9-1-Wachstumsmedium in den Kolben geben, um ein Gesamtvolumen von 12 ml zu erhalten. Der Kolben wird in den 37 °C-Inkubator gestellt, damit die Zellen anhaften können. Lassen Sie die Zellen im Inkubator vermehren, bis sie ~ 60-70% Konfluenz erreichen.
  7. Passieren von O9-1-Zellen:
    1. Warmes O9-1-Wachstumsmedium, 1x PBS und 0,25% Trypsin-EDTA in einem 37 °C warmen Wasserbad.
    2. Spülen Sie die Platte mit O9-1-Zellen vorsichtig zweimal mit warmem 1x PBS aus, wie in Schritt 1.2.2.1 beschrieben.
    3. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in den Kolben geben und 5 min in den 37 °C Inkubator stellen.
    4. Nach 5 Minuten Inkubation den Kolben aus dem Inkubator nehmen und vorsichtig auf den Kolben klopfen, um alle anhaftenden Zellen zu lösen.
    5. 9 ml O9-1-Wachstumsmedium in den Kolben geben, um das Trypsin zu löschen. Sammeln Sie 10 ml der trypsinisierten Zellsuspension und geben Sie 10 ml dieser Zellsuspension in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 100 × g für 5 min.
    6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml O9-1-Wachstumsmedium. Für zusätzlichen Durchgang wird 1 ml der resuspendierten Zellen in einen 75 cm2-Kolben gegeben. 11 ml O9-1-Wachstumsmedium zugeben und den Kolben mit den Zellen in 12 ml Medium in den 37 °C-Inkubator geben.

2. Plattierung von Zellen in einem Kokultursystem

  1. Beschichtung von C2C12-Zellkammern:
    1. Nach der Trypsinisierung (wie in Schritt 1.2 beschrieben) wird das C2C12-Zellpellet in 10 ml C2C12-Medium resuspendiert. Die Zellen werden im Verhältnis 1:20 in C2C12-Medium verdünnt, indem Sie 0,5 ml der resuspendierten C2C12-Zellen entfernen und in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen mit 9,5 ml frischem C2C12-Medium geben. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette.
    2. Fügen Sie 1 ml der 1:20-verdünnten C2C12-Zellen mit einer P1000-Pipette in jede Vertiefung einer neuen 4-Kammer-Vertiefung hinzu und legen Sie die 4-Kammer-Vertiefung in den Inkubator.
  2. Beschichtung von O9-1 Zelleinsätzen:
    1. Nach der Trypsinisierung resuspendieren Sie das O9-1-Zellpellet in 10 ml O9-1-Wachstumsmedium. Die Zellen werden im Verhältnis 1:20 in O9-1-Wachstumsmedium verdünnt, indem Sie 0,5 ml der resuspendierten C2C12-Zellen entfernen und in ein neues 15-ml-konisches Röhrchen geben, das 9,5 ml frisches O9-1-Wachstumsmedium enthält. Mischen Sie die Suspension vorsichtig mit einer serologischen Pipette.
    2. Platzieren Sie einen einzelnen durchlässigen Einsatz (siehe Materialtabelle) in jeder Vertiefung eines neuen 4-Kammer-Brunnens, der mit 1 ml O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist.
      HINWEIS: Diese 4-Kammer-Vertiefung sollte sich von der mit den C2C12-Zellen aus Schritt 2.1.3 unterscheiden.
    3. Fügen Sie 300 μL der verdünnten O9-1-Zellsuspension mit einer P1000-Pipette zu jedem Einsatz hinzu. Stellen Sie sicher, dass der Boden jedes Einsatzes in die Vertiefung eingetaucht ist, die mit 1,3 ml O9-1-Wachstumsmedium gefüllt ist. Stellen Sie den Brunnen in den 37 °C heißen Inkubator.
  3. (Optional). Führen Sie einen siRNA-Knockdown in den O9-1-Zellen oder C2C12-Zellen durch.
    1. Führen Sie einen Gen-Knockdown durch siRNA 18-24 h nach der Beschichtung von O9-1-Zellinserts oder C2C12-Zellkammertöpfen durch.
      1. Verdünnen Sie die siRNA und das Transfektionsreagenz in reduziertem Serummedium (siehe Materialtabelle) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und den gewünschten Konzentrationen für das Experiment. Mischen Sie vorsichtig die verdünnte siRNA und das Transfektionsreagenz (1:1) und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 7 min.
        HINWEIS: In diesem Protokoll wurden 50 nM-Konzentrationen verwendet, da diese siRNA-Konzentration bestimmt wurde, um zu einem ausreichenden Knockdown der Zielgenexpression zu führen.
      2. Fügen Sie die siRNA-Lipidkomplexe entweder zu den O9-1-Zelleinsätzen oder den C2C12-Zellkammertöpfen hinzu, wie durch das experimentelle Design bestimmt, und inkubieren Sie die Zellen mit den siRNA-Lipidkomplexen für ~36-48 h.

3. Durchführung von Wundtests und quantitative Bewertung der Myoblastenmigration

  1. Wundtest:
    1. Lassen Sie die O9-1-Zelleinsätze und C2C12-Zellkammermulden im Inkubator haften und sich vermehren, bis beide Zellen ~ 70-80% Konfluenz aufweisen, bevor Sie mit diesem Teil des Protokolls fortfahren. Wenn Zellen zu >90% konfluierend wachsen, fahren Sie nicht mit dem Kratztest fort, da sich die Zellen lediglich vom Bohrloch lösen.
    2. 1x PBS und C2C12 medium erwärmen, indem Sie sie in ein 37 °C warmes Wasserbad geben.
    3. Überstehendes Medium aus der C2C12-Kammer gut entfernen und die Zellen einmal mit 1x PBS waschen. Entfernen Sie das 1x PBS und kratzen Sie die Zellen sofort mit einer sterilen P10-Pipettenspitze.
      1. Führen Sie die sterile P10-Pipettenspitze fest in eine Richtung, um die gesamte Länge oder Breite der Zellmonoschicht zu überspannen (z. B. von rechts nach links, von oben nach unten). Achten Sie darauf, jede Vertiefung, die Zellen enthält, nur einmal zu zerkratzen.
        HINWEIS: Um die Kratzergebnisse zu optimieren, kratzen Sie Vertiefungen verschiedener experimenteller Bedingungen auf einem ähnlichen Konfluenzniveau. Stellen Sie dazu sicher, dass jede 4-Kammer-Vertiefung Zellen für jede erforderliche experimentelle Bedingung hat (z. B. Bohrloch # 1 Negativkontrolle, Bohrloch # 2 Positivkontrolle). Verwenden Sie außerdem für jeden Kratzer eine neue sterile P10-Pipette und üben Sie jedes Mal eine ähnliche Kraft auf die Pipette aus. Versuchen Sie nicht, mehr als einen Kratzer in jedem Vertiefung zu erzeugen.
      2. Nach dem Kratzen schnell 1 ml 1x PBS mit einer P1000-Pipettenspitze wieder in die Vertiefung geben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Bohrloch, das zerkratzt wird.
        HINWEIS: Angesichts der Variabilität, die mit jedem Kratzer verbunden ist, wird empfohlen, mehrere Vertiefungen (n = 3) für die Wundbildung in jedem experimentellen Zustand zu verwenden. Arbeiten Sie schnell, da es wichtig ist, die Dauer zu minimieren, für die die Zellen während dieser Schritte ohne 1x PBS sind. Nach dem Entfernen von 1x PBS aus jedem Well sollte man nicht mehr als 5 s benötigen, um in jedem Well eine Wunde zu erzeugen.
    4. Nachdem Sie eine Wunde erzeugt und 1x PBS wieder in jede Vertiefung gegeben haben, bilden Sie den Kratzer mit einem hellfeldinversen Mikroskop ab und verwenden Sie dieses Bild als Basisgröße der Wunde (Zeit 0). So nehmen Sie Bilder auf:
      1. Schalten Sie den Computer und das Mikroskop ein (siehe Materialtabelle), indem Sie den Netzschalter drücken. Platzieren Sie den Kammerschieber auf der Bühne und drehen Sie das Objektivrad auf 5-fache Vergrößerung.
      2. Öffnen Sie die Imaging-Software (siehe Materialtabelle), indem Sie auf das Softwaresymbol auf dem Computer-Desktop doppelklicken. Klicken Sie auf dem Startbildschirm der Software auf die Registerkarte Kamera . Klicken Sie auf die Schaltfläche Live , um die Zellen auf der Registerkarte AxioCam IC zu visualisieren.
      3. Stellen Sie sicher, dass der Lichtfilter ganz herausgezogen ist, damit Licht auf die Kamera und den Computerbildschirm gelangen kann. Bewegen und/oder drehen Sie den Kammerschieber manuell, um den Wundbereich in der Mitte des Livebildes auf der AxioCam IC-Lasche zu positionieren.
      4. Um Bilder aufzunehmen, klicken Sie auf Ausrichten , um eine neue Registerkarte neben der Registerkarte AxioCam IC zu öffnen, die das Bild enthält.
      5. Um dieses Standbild zu speichern, klicken Sie oben links auf der Software-Startseite auf Datei, | speichern unter, | geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Speichern Sie die Figur im Carl Zeiss-Bildformat (*.czi) (Standardeinstellung) und wählen Sie Desktop in der linken Leiste, um die Datei als CZI-Datei auf dem Desktop zu speichern, die nur im Softwareprogramm Zen lite 2012 geöffnet werden kann.
      6. Um das Bild als .tiff zu speichern, klicken Sie auf Datei | Speichern unter, | geben Sie den Dateinamen in das Feld Dateiname ein. Speichern Sie die Abbildung als getaggte Bilddatei (*.tiff), indem Sie auf die Schaltfläche Dateityp klicken und *.tiff aus dem Dropdown-Menü auswählen.
        HINWEIS: Das .tiff Format kann in jeder Bildbearbeitungssoftware geöffnet werden.
      7. Positionieren Sie den Kammerschieber manuell, um 2-3 weitere Bilder an anderen Stellen der Wunde in derselben Vertiefung aufzunehmen.
        HINWEIS: Insgesamt ergibt dies 3-4 nicht überlappende, stark vergrößerte Bilder der Wunde in jedem Brunnen.
    5. Entfernen Sie das 1x PBS aus jeder Vertiefung und fügen Sie 1 ml C2C12-Medium hinzu.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht zu aggressiv zu pipettieren, wenn Sie nach der Wundbildung Lösungen aus der Kammer entfernen oder hinzufügen, da sich dies dazu führen kann, dass sich Zellen von der Kammermulde lösen. Neigen Sie außerdem die Kammer gut, so dass das Absaugen und Wiedereinführen von Lösungen an den Ecken jeder Vertiefung erfolgen kann, um die Zerstörung der Zellmonoschicht zu minimieren.
    6. Setzen Sie das Kokultursystem zusammen, indem Sie die Einsätze mit den O9-1-Zellen manuell in jede Vertiefung der Kammermulde legen. Drücken Sie die Einsätze vorsichtig in die Vertiefung, so dass der Boden des Inserts knapp über den darunter liegenden C2C12-Zellen sitzt. Geben Sie die Vertiefungskonstrukte in den Inkubator zurück.
      HINWEIS: Lassen Sie nicht zu, dass die Unterseite des Einsatzes die darunter liegenden C2C12-Zellen physisch berührt und mechanisch stört.
    7. Lassen Sie die Zellen insgesamt 9-12 h wandern. Um die optimale Migrationszeit zu bestimmen, überprüfen Sie die Zellen 6 h nach der Wundbildung, danach alle 2-3 Stunden. Beenden Sie das Experiment, wenn die Zellen unter Kontroll- oder Positivkontrollbedingungen beginnen, die Wunde vollständig zu bedecken.
      HINWEIS: Aufgrund der berührungslosen Natur des Konstrukts muss der darüber liegende Einsatz nicht aus den Vertiefungen entfernt werden, wenn der Verlauf der Intervallmigration überprüft wird. Die Migrationsvariabilität wird in Abhängigkeit von Faktoren wie den in diesem Assay verwendeten Zelltypen, der Zelldichte zum Zeitpunkt der Wundbildung, der Breite der erzeugten Wunde und den experimentellen Bedingungen manipulierter Zellen (z. B. Gen-Knockdown, rekombinante Proteinaddition) beobachtet. Die Konzentrationen dieser Reagenzien sollten experimentell unter Anleitung der Herstellerempfehlungen bestimmt werden.

4. Immunfluoreszenzfärbung und Bildgebung wandernder Myoblasten

  1. Beendigung des Migrationstests und Dekonstruktion des Bohrlocheinfügesystems:
    1. Entfernen Sie die O9-1-Zelleinsätze nach einer Migrationsperiode von 9-12 h (oder einer alternativen Zeit, die durch experimentelle Bedingungen bestimmt wird). Saugen Sie das C2C12-Medium vorsichtig mit einer P1000-Pipette ab. Fügen Sie 0,5 ml 1x PBS in die Kammermulden hinzu und machen Sie endgültige Bilder der Zellen nach der Migration.
    2. Saugen Sie vorsichtig alle 0,5 ml 1x PBS gemischt mit Medium ab und entfernen Sie die Kunststoffkammern aus den Kammertöpfen unter Verwendung der Kit-Anweisungen, wobei der darunter liegende Objektträger die C2C12-Zellen enthält.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, die C2C12-Zellen, die am Objektträger haften, nicht zu stören, wenn Sie die Kammermulden entfernen.
  2. Durchführung der Immunfärbung:
    1. Legen Sie den Objektträger sofort in einen Objektträgerhalter mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie ihn 10 Minuten bei Raumtemperatur. Gießen Sie die 4% PFA aus und geben Sie 0,1% Triton X-100-enthaltende 1x PBS (1x PBST) in den Objektträgerhalter, um den Objektträger 15 Minuten bei Raumtemperatur zu waschen. Gießen Sie das 1x PBST aus und geben Sie 1x PBS in den Diahalter, um das Dia 10 min bei Raumtemperatur zu waschen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal für insgesamt zwei 1x PBS-Wäschen.
    2. Entfernen Sie das Dia aus dem Diahalter. Zeichnen Sie die äußeren Kanten des Objektträgers mit einem hydrophoben Stift nach, um eine hydrophobe Grenze um den Objektträger zu erstellen, um zu verhindern, dass Lösungen vom Objektträger verschüttet werden. Achten Sie darauf, die adhärenten Zellen nicht zu stören.
    3. Geben Sie 1% Rinderserumalbumin (BSA) blockierende Lösung (verdünnt in 1x PBS) zum Objektträger (~ 0,5 ml pro Objektträger). Stellen Sie sicher, dass die Lösung innerhalb der in Schritt 4.2.4 erstellten hydrophoben Grenze enthalten ist. Inkubieren Sie den Objektträger für 1 h bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Objektträgerkammer.
      HINWEIS: Obwohl eine BSA-Blockierung für die Phalloidin-Immunfärbung nicht erforderlich ist, ermöglicht dieser Schritt im Protokoll die Kopplung mit der Fluoreszenz-Antikörperfärbung.
    4. Nach dem Blockieren für 1 h gießen Sie die blockierende Lösung aus dem Objektträger, geben Phalloidin-Antikörper (verdünnt auf 1:200 in 1% BSA-Blockierungslösung durch Zugabe von 5 μL des Antikörpers zu 995 μL BSA-Lösung) zum Objektträger und inkubieren bei 4 °C über Nacht. Stellen Sie erneut sicher, dass die Lösung innerhalb der in Schritt 4.2.4 erstellten hydrophoben Grenze enthalten ist. Da der Phalloidin-Antikörper mit Alexa Fluor-488-Farbstoff konjugiert ist, minimieren Sie die Lichtexposition des Antikörperreagenzes vor und nach dem Hinzufügen zum Objektträger.
    5. Am nächsten Tag legen Sie das Dia in einen Diahalter, der vor Lichteinwirkung geschützt ist (z. B. wickeln Sie den Diahalter in Folie ein oder verwenden Sie einen undurchsichtigen Diahalter). Waschen Sie die Zellen im Objektträgerhalter mit 1x PBS für 10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt drei 10-minütige Wäschen.
    6. Fügen Sie ein 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-haltiges Montagemedium hinzu und montieren Sie die Objektträger mit Glasdeckgläsern. Stellen Sie die Zellen, die migriert sind, mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop ab.

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Ergebnisse

Auswirkungen von NCCs auf die Migrationsfähigkeit von murinen Myoblasten
Dieser Assay wurde zuerst angewendet, um den Einfluss von NCCs auf die Migrationskapazität von Myoblasten zu bewerten. Abbildung 1 zeigt das schematische Modell des Assays. Um diese Wirkung zu testen, wurden Kratztests mit Myoblasten durchgeführt, die isoliert (ohne NCC-Einsätze) im Vergleich zu denen in Gegenwart von Einsätzen gezüchtet wurden. Als Positivkontrolle wurden 500 ng/mL rekombinantes Wnt...

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Diskussion

Der nichtkanonische Wnt/Planarzellpolaritäts-Signalweg (PCP) ist ein kritisch wichtiger zellulärer Signalweg, der an multiplen Entwicklungsprozessen 24,25 und Krankheitsprozessen 24,26 beteiligt ist. Während der embryonalen Entwicklung beinhaltet die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung ein ausgedehntes Netzwerk molekularer Signale von signalsendenden Zellen, die letztendlich Veränderungen in de...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass die Forschung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Auszeichnungen F30HL154324 an O.T. und K08HL121191 und R03HL154301 an S.R.K. unterstützt. Die Autoren möchten anerkennen, dass das Schema in Abbildung 1 in diesem Manuskript mit biorender.com erstellt wurde.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2-MercaptoethanolSigma AldrichM-7522
Antifade-Eindeckmedium mit DAPIVector LaboratoriesH-1200-10Gelagert bei 4 ° C
RinderserumalbuminSanta Cruz Biotechnologysc-2323Gelagert bei 4 &°; C
C2C12 murine Myoblasten-ZelllinieATCCCRL-1772
Zellkulturflaschen, 75 cm2ThermoFisher Scientific156499
Chamber Slide System, 4 WellsThermoFisher Scientific154526
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM), hoher Glukosegehalt (4,5 g/L), L-Glutamin (2 mM)Corning10-017-CVGelagert bei 4 ° C
Falcon konische Zentrifugenröhrchen, 15 mLFisher Scientific14-959-53A
Falcon permeable Halterung für 24-Well-Platten mit 0,4 &; Mikro; M transparente PET-MembranCorning353095
fötales RinderserumFisher ScientificW3381EGelagert in 50 mL Aliquoten bei -20 &de; C
Gelatinelösung, 0,1%ATCCPCS-999-027Gelagert bei 4 &°; C
Graduierte und sterile Pipettenspitzen, 10 & Mikro; LUSA Scientific1111-3810
Leukämie-Hemmfaktor (LIF), 106 Einheit/mlMillipore SigmaESG1106
L-Glutamin 200 mM (100x)Gibco25030-081
Lipofectamin RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
MEM nicht-essentielle Aminosäuren (MEM NEAA) 100xGibco11140-050
Minimum essential medium (MEM)Corning10-022-CV
Mitomycin CRoche10107409001
Antihaft-Deckgläser aus Autoglas, 24 x 55 mmSpringside ScientificHRTCG2455
O9-1 Neuralleisten-ZelllinieMillipore SigmaSCC049
Opti-MEM I, 1xGibco31985-070
Paraformaldehyd Lösung in PBS, 4%Santa Cruz Biotechnologiesc-281692Gelagert bei 4 &°; C
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin und 10.000 μ g/mL Streptomycin)Fisher ScientificW3470HGelagert in 10 mL Aliquoten bei -20 ° C
Phalloidin-iFluor 488Abcamab176753Gelagert bei -20 &de; C, ohne Licht aufbewahren
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS), 1x, ohne Calcium und Magnesium, pH 7,4Corning21-040-CVGelagert bei 4 &de; C
Rekombinanter humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch (rhFGF-basisch)R& D Systems233-FB-025
Rekombinantes Mensch/Maus-Wnt5a-ProteinF& T & D Systems645-WN-010
Natriumpyruvat, 100 mMGibco11360-070
Quadratische Petrischale mit GitterThomas Scientific1219C98
STO murine Fibroblasten-FeederzellenATCCCRL-1503
Triton X-100 LösungSigma AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTA, 0,25%Fisher ScientificW3513CGelagert bei 4 Grad; C
Zeiss Apotome.2 FluoreszenzmikroskopCarl Zeiss AG
Zeiss invertiertes Lichtmikroskop Axio Vert.A1Zeiss AG
Zen lite 2012 Mikroskopie-SoftwareCarl Zeiss AGBildgebungssoftware
Carl

Referenzen

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