Summary
Presentamos un método para evaluar la expresión de microARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa.
Abstract
Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que constan de 21-25 bases. No se traducen en proteínas, sino que trabajan para impedir el funcionamiento de sus ARN mensajeros objetivo (ARNm) desestabilizándolos e interrumpiendo su traducción. Aunque se han investigado los perfiles de expresión de miARN en varios órganos y tejidos de ratón, no ha habido métodos estándar para purificar y cuantificar miARN de riñón y suero de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
El método utiliza la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), y el protocolo requiere seis pasos: (1) preparación de ratones con resistencia de ratón acelerada por senescencia 1 (SAMR1) y ratones propensos a ratones con propenso a la senescencia acelerada (SAMP1); (2) extraer muestras de suero de estos ratones; (3) extraer una muestra de riñón de cada ratón; (4) extraer ARN total (incluido miARN) de muestras de riñón y suero de cada ratón; (5) la síntesis de ADN complementario (ADNc) con transcripción inversa del miARN; (6) realizar una qRT-PCR utilizando el ADNc obtenido.
Este protocolo se utilizó para confirmar que, en comparación con los controles, la expresión de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p cambió significativamente en el riñón y el suero de un modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo también aclaró la relación entre el riñón y el suero del modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Introduction
Se sabe que la expresión de varios ARNm que desempeñan un papel importante tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer) está regulada por miARN, que son ARN cortos y no codificantes que causan la degradación e inhiben la transcripción del ARNm1. Por lo tanto, es posible que ciertos miRNAs puedan servir como nuevos candidatos a biomarcadores y/o dianas terapéuticas para diversas enfermedades 2,3,4,5. Se han realizado investigaciones sobre perfiles de expresión de miARN en una variedad de órganos y tejidos de ratón (incluidos el cerebro6, el corazón7, el pulmón8, el hígado9 y el riñón10). Sin embargo, no existen métodos estándar o establecidos para extraer y evaluar miRNAs en los riñones o suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Por lo tanto, establecimos un protocolo que se puede utilizar para purificar y detectar de manera confiable la expresión de miRNA en el suero y el riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad. Hay seis pasos principales en el protocolo: (1) preparación de ratones machos SAMR1 de 50 semanas de edad y ratones machos SAMP1; (2) extracción de muestras de sangre de la vena cava inferior de ambas cepas de ratones, con el uso posterior de un tubo de spitz con heparina, seguido de centrifugación, para obtener una muestra de suero; (3) extracción de muestras de riñón de los ratones: se utiliza un homogeneizador de silicio para homogeneizar la muestra de riñón por separado, y luego la muestra se transfiere a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga11; (4) extracción de ARN total (que contiene miARN) de las muestras de suero con el uso de una columna de espín12 basada en membrana de sílice y extracción total de ARN que contiene miARN de las muestras renales con el uso de una columna de espín11 basada en membrana de sílice; (5) síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN total utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y oligo-dT cebador13,14; y (6) finalmente, determinación de la expresión de miRNA mediante qRT-PCR y un colorante intercalante13,14.
Este nuevo protocolo se basó en estudios que lograron extraer y evaluar miRNAs en varios tipos de tejido11,12,13. Se demostró que el sistema de trituración de biopolímeros del protocolo es capaz de purificar ARN total de alta calidad de los tejidos11. Se ha establecido la precisión y sensibilidad de aspectos de este protocolo utilizado para la evaluación de la expresión de miARN por qRT-PCR con un colorante intercalante13,14, por ejemplo, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT a partir del ARN total extraído. El nuevo protocolo tiene varias ventajas: simplicidad, ahorro de tiempo y reducción de errores técnicos. Por lo tanto, se puede utilizar para investigaciones que requieren una identificación precisa y sensible de los perfiles de miARN renal y sérico. Los estudios de muchas condiciones patológicas también pueden utilizar el nuevo protocolo.
Los perfiles de expresión de miARN en ratones SAMP1, que son un modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad, se pueden determinar como se muestra a continuación. En humanos, la insuficiencia renal dependiente de la edad se asocia con la progresión de la insuficiencia renal y se caracteriza tanto por un aumento en el área de fibrosis intersticial renal como por la progresión de la glomeruloesclerosis15,16. La insuficiencia renal dependiente de la edad también es una característica importante y frecuente de la enfermedad renal crónica y de la enfermedad renal terminal15,16.
Protocol
El protocolo experimental fue aprobado por el Comité de Ética Animal de la Universidad Médica de Jichi y realizado de acuerdo con la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio y sus directrices sobre el uso y cuidado de animales de experimentación. Este protocolo utiliza cuatro ratones machos SAMR1 de 50 semanas de edad y ratones machos SAMP1 (40-45 g).
1. Recogida de muestras de suero
- Prepare lo siguiente para cada ratón: agujas de 30 G con una jeringa de 1,0 ml, un tubo de centrifugación spitz de 1,0 ml con heparina, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, anestésico isoflurano, una lámina de corcho, etanol al 70%, dos hisopos de algodón humedecidos con solución salina tamponada con fosfato (PBS), una placa de Petri con PBS, pinzas y tijeras quirúrgicas.
- Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% y mantenerlo al 1,5%. Administrar un analgésico (Meloxicam 5 mg/kg) por vía subcutánea, luego inyectar 1,0 ml de etanol al 70% en su abdomen y colocarlo en posición supina sobre la lámina de corcho.
- Confirmar la profundidad de la anestesia por la desaparición del reflejo de retirada del pedal. Con las pinzas y tijeras quirúrgicas, incide la piel del abdomen. Corte los músculos y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
- Use las pinzas para levantar la membrana peritoneal y haga una incisión lateral en el borde superior de la membrana peritoneal con las tijeras quirúrgicas. Continúe la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas.
- Identifique la vena cava inferior utilizando los dos hisopos de algodón humedecidos con PBS. Inserte una de las agujas de 30 G con la jeringa de 1,0 ml en la vena cava inferior y, a continuación, tire de la jeringa. Saque la aguja de la vena cava inferior lentamente para evitar la hemólisis. Transfiera la sangre al tubo de spitz de 1.0 ml con heparina y luego mezcle invirtiendo el tubo varias veces.
NOTA: El ratón es sacrificado por luxación cervical. - Haga girar el tubo de Spitz a temperatura ambiente (RT), 3.000 × g durante 10 min.
- Aspire el sobrenadante lentamente, asegúrese de que no contenga sedimentos y luego transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml no utilizado.
- Conservar el tubo a -80 °C antes de usarlo.
NOTA: Si continúa con el paso 3 inmediatamente, no es necesario almacenar el tubo a -80 °C.
2. Recolección de muestras de riñón
- Prepare lo siguiente para cada ratón: criotubos de 2.0 ml, anestésico isoflurano, una lámina de corcho, etanol al 70%, una placa de Petri con PBS, pinzas y tijeras quirúrgicas.
- Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% y mantenerlo al 1,5%. Administrar un analgésico (Meloxicam 5 mg/kg) por vía subcutánea, luego inyectar 1,0 ml de etanol al 70% en su abdomen y colocarlo en posición supina sobre la lámina de corcho.
- Confirmar la profundidad de la anestesia por la desaparición del reflejo de retirada del pedal. Use las pinzas y las tijeras quirúrgicas para hacer una incisión en la piel abdominal. Corte los músculos y la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas.
- Use las pinzas para levantar la membrana peritoneal y haga una incisión lateral en el borde superior de la membrana peritoneal con las tijeras quirúrgicas. Continúe la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas.
- Identificar el riñón izquierdo. Reflujo con PBS para eliminar la sangre de los vasos hasta que el riñón se vuelva de un color blanco amarillento. Extirpe todo el riñón primero usando tijeras quirúrgicas para cortar la arteria y la vena renal izquierda. Coloque el riñón en una placa de Petri y lávelo cuidadosamente con PBS.
NOTA: El ratón es sacrificado por luxación cervical. - Use las pinzas y las tijeras quirúrgicas para cortar el riñón en muestras de 10 mg (10 mg es un tamaño de muestra adecuado para el siguiente paso). Coloque cada muestra del riñón en su propio criotubo de 2.0 ml. Cierre la tapa del tubo.
- Para el almacenamiento a largo plazo, transfiera cada criotubo a nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C.
3. Extracción total de ARN de una muestra de suero
- Prepare primero los siguientes elementos: un mezclador de vórtice, reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, 80% de etanol, 100% de etanol, 100% de cloroformo, columnas de centrifugado de biopolímeros (en tubos de recolección de 2.0 ml 11), columnas de centrifugado ancladas a la membrana (en tubos de recolección de 2.0 ml11), tampón de lavado # 1 (es decir, tampón de lavado que contiene guanidina y100% de etanol en una proporción de 1: 2), tampón de lavado # 2 (es decir, tampón de lavado que contiene guanidina y etanol al 100% en una proporción de 1:4), agua libre de RNasa, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y tubos de microcentrífuga de 2,0 ml.
- Primero, tome una muestra de suero de 200 μL en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml y luego agregue 1,000 μL del reactivo de lisis a base de fenol / guanidina. Vortex la mezcla durante 5 s.
- Incubar la muestra en RT durante 5 min.
- Agregue 200 μL de cloroformo a la muestra de suero en el tubo y cierre la tapa del tubo herméticamente. Invierta el tubo 15 veces para mezclar el cloroformo y la muestra de suero.
- Cada muestra se incuba en RT durante 3 min. A continuación, girar la muestra a 4 °C durante 15 min a 12.000 x g.
- Transfiera los 300 μL de sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sin alterar el pellet. Agregue 450 μL de etanol al 100% y voltee el tubo durante 5 s.
NOTA: En todos los pasos siguientes, coloque la columna de espín anclada a la membrana para la separación de ARN y ADN en un tubo de recolección de 2.0 ml para centrifugarlo. - Luego, retire 700 μL de la muestra, cárguela en una columna de centrifugado anclada a la membrana y cierre la tapa. Gire la columna a RT durante 15 s a 8.000 × g y deje el sobrenadante en la columna. Deseche el pellet que queda en el tubo de recolección.
- Agregue 700 μL de tampón de lavado #1 que forma parte del kit de suero/plasma (consulte la Tabla de materiales) a la columna de centrifugado anclada a la membrana para limpiar la muestra a fondo. Cierre la tapa de la columna y gire la columna a RT durante 15 s a 8.000 × g, y deje el sobrenadante en la columna. Deseche el pellet que queda en el tubo de recolección.
- Para la eliminación de sales traza, tome 500 μL de tampón de lavado # 2 y cárguelo en una columna de centrifugado anclada a la membrana. Después de cerrar la tapa de la columna, gire la columna a RT durante 15 s a 8.000 × g y deje el sobrenadante en la columna. Deseche el pellet en el tubo de recolección.
- Para la eliminación de sales traza, tome 500 μL de etanol al 80% y cárguelo en una columna de centrifugado anclada a la membrana. Después de cerrar la tapa de la columna, gire la columna a RT durante 15 s a 8.000 × g y deje el sobrenadante en la columna. Deseche el pellet en el tubo de recolección.
- Gire de nuevo la columna de centrifugado anclada a la membrana a RT durante 5 minutos a 15.000 × g.
- Después de transferir la columna de espín anclada a la membrana a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml, agregue 14 μL de agua libre de RNasa a la columna para disolver el ARN total. Después de cerrar la tapa de la columna, espere 5 minutos con el tubo a la izquierda en RT. Gire la columna nuevamente durante 1 minuto a 15,000 × g en RT.
- Conservar los tubos con muestras a -80 °C antes de usarlos.
4. Extracción de ARN total de una muestra de riñón
- Prepare primero los siguientes elementos: un homogeneizador de silicio, hielo, un mezclador de vórtice, etanol al 100%, cloroformo al 100%, columnas de centrifugado de biopolímeros (en tubos de recolección de 2.0 ml 11), columnas de centrifugado ancladas a la membrana (en tubos de recolección de 2.0 ml11), reactivo de lisis a base de fenol/guanidina, tampón de lavado #1 (el mismo tampón que el paso 3.1.), tampón de lavado #2 (el mismo tampón que el paso 3.1.), Agua libre de RNasa, tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y tubos de microcentrífuga de 2.0 ml.
- Coloque una muestra de riñón de 10 mg en el homogeneizador de silicio y agregue 700 μL del reactivo de lisis a base de fenol/guanidina.
- Configure el homogeneizador. Presione y gire suavemente el mortero del homogeneizador contra la muestra de riñón para homogeneizar la muestra. Continúe presionando y girando el mortero hasta que la muestra de riñón esté completamente homogeneizada en el reactivo de lisis a base de fenol/guanidina.
- Para una mayor homogeneización, tome el lisado homogeneizado (en un tubo de recolección de 2.0 ml) y transfiéralo a una columna de centrifugado de biopolímero.
- Centrifugar el lisado homogeneizado a RT durante 3 min a 14.000 × g y luego transferir todo el pellet precipitado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml no utilizado para invertir el pellet precipitado
- Mezclar el pellet con 140 μL de cloroformo en el tubo; Luego, cierre bien la tapa del tubo. Invierta el tubo 15x para mezclar el lisado y el cloroformo.
NOTA: El cloroformo se puede utilizar de forma segura sin una campana. - Incubar la muestra en RT durante 2-3 min. Centrifugar la muestra a 4 °C durante 15 min a 12.000 × g.
- Transfiera el sobrenadante (que generalmente es ~ 300 μL) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, sin alterar el precipitado. Agregue 1.5 veces su volumen (que generalmente es ~ 450 μL) de etanol al 100%. Vortex la mezcla durante 5 s.
NOTA: En todos los pasos siguientes, coloque la columna de espín anclada a la membrana para separar el ARN y el ADN en un tubo de recolección de 2.0 ml para centrifugarlo. - Cargue 700 μL de muestra en una de las columnas de centrifugado ancladas a la membrana. Cierre la tapa y centrifugar la columna a 15.000 × g durante 15 s. Deseche el lisado precipitado que queda en el tubo de recolección.
- Agregue 700 μL de tampón de lavado #1 a la columna de centrifugado para lavarla a fondo. Cierre la tapa y centrifugar la columna a 15.000 × g durante 15 s. Deseche el lisado precipitado que queda en el tubo de recolección.
- Para la eliminación de trazas de sal, cargue 500 μL de tampón de lavado #2 en la columna de centrifugado anclada a la membrana. Después de cerrar la tapa de la columna, centrifugar la columna a 15.000 × g durante 15 s. Deseche el lisado precipitado en el tubo de recolección.
- Repita el paso 4.11.
- Centrifugar de nuevo la columna de centrifugado anclada a la membrana durante 1 min a 15.000 × g. Deseche el lisado precipitado en el tubo de recolección.
- Tome la columna de centrifugado anclada a la membrana y transfiérala a un nuevo tubo de recolección de 1,5 ml. Agregue 30 μL de agua libre de RNasa a la columna para disolver el ARN total. Después de cerrar la tapa de la columna, espere 5 minutos con el tubo en RT y luego centrifugar la columna durante 1 minuto a 15,000 × g.
- Transfiera el volumen total de la muestra que contiene ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga. Coloque el tubo sobre hielo y mida la concentración total de ARN mediante espectrofotometría. Asegúrese de que la concentración total de ARN sea ~ 300-1,500 ng / μL.
- Conservar los tubos que contengan muestras a -80 °C antes de su uso.
5. Síntesis de ADNc con la transcripción inversa del ARN total en suero
NOTA: La información mínima para la publicación de las guías cuantitativas de experimentos de PCR en tiempo real (MIQE) recomienda el uso de mejores prácticas experimentales para obtener resultados fiables e inequívocos17. En este protocolo, el ADNc se sintetiza a partir del ARN total purificado en un procedimiento de dos pasos utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT.
- Prepare primero lo siguiente: un mezclador de vórtice, un termociclador, tubos de tira de ocho pocillos, la tapa de cada tubo de ocho tiras, agua destilada, hielo, el kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)13,14 en estado fundido y tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Arranque el termociclador.
- Preparar la solución de mezcla maestra; para obtener un total de 8,0 μL de mezcla maestra por tubo de tira de ocho pocillos, agregue 2,0 μL de mezcla de transcriptasa inversa (incluida en el kit) y 2,0 μL de mezcla de ácidos nucleicos 10x a 4,0 μL de tampón de transcripción inversa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Coloque 8.0 μL de la solución de mezcla maestra en cada tubo de una tira de ocho pocillos.
- Coloque una alícuota de 12 μL de ARN total en cada tubo del tubo de tira de ocho pocillos y cierre la tapa del tubo. Centrifugar el tubo durante 15 s a RT y 2.000 × g.
- Colocar el tubo en el termociclador e incubar durante 60 min a 37 °C. Incubar la muestra durante 5 minutos adicionales a 95 °C min para sintetizar el ADNc.
- Después de la incubación, transfiera el ADNc a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Diluir el ADNc diez veces (1:10) con agua destilada. Vórtice y centrifuga el tubo durante 5 s a RT y 2.000 × g.
- Almacene el ADNc diluido temporalmente en hielo. Conservar las muestras diluidas a -80 °C antes de su uso.
6. Síntesis de ADNc con la transcripción inversa del ARN total en riñón
NOTA: Las directrices MIQE fomentan mejores prácticas experimentales para garantizar resultados confiables e inequívocos17. Este protocolo utiliza transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo dT para sintetizar ADNc a partir de 1,0 μg de ARN total purificado en un procedimiento de dos pasos.
- Primero, prepare lo siguiente: un mezclador de vórtice, un termociclador, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, tubos de tira de ocho pocillos, la tapa de cada tubo de ocho tiras, agua destilada, hielo y un kit de transcriptasa inversa (consulte la Tabla de materiales)13,14 en estado fundido.
- Arranque el termociclador.
- Preparar la solución de mezcla maestra; para obtener un total de 8,0 μL de solución de mezcla maestra por tubo, agregue 2,0 μL de la mezcla de transcriptasa inversa que se incluye en el kit y 2,0 μL de mezcla de ácido nucleico 10x a 4,0 μL del tampón de transcripción inversa.
- Agregue 8.0 μL de la solución de mezcla maestra a cada tubo de una tira de ocho pocillos.
- Ajuste la densidad total de ARN de la siguiente manera. Para la separación de 1,0 μg de ARN total de una muestra de riñón con 12 μL de agua libre de RNasa, tomar una cantidad adecuada de ARN total y transferirla a agua destilada utilizando la concentración medida como se describe anteriormente (en el Paso 4.15.).
NOTA: En presencia de contaminación por ADN, el ADN contaminado es coamplificado por qRT-PCR. - Realice el mismo proceso que el descrito anteriormente en los pasos 5.5.-5.8.
7. La qRT-PCR de miRNA
NOTA: Se utiliza un método intercalador para la qRT-PCR de los miRNAs. Los cebadores se utilizan para el ARN: U6 nuclear pequeño 2 (RNU6-2), miRNA-223-3p, miRNA-423-5p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p.
- Prepare lo siguiente: un mezclador de vórtice, un sistema de PCR en tiempo real, una placa de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR, una película adhesiva para la placa de reacción de 96 pocillos, un aplicador de película adhesiva, un rotor centrífugo de 96 pocillos, cebadores específicos de miARN, un kit de PCR a base de colorante verde que contenga 2x mezcla maestra de PCR y 10x imprimación universal (consulte la Tabla de materiales)13,14, y un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Vortex lo siguiente después de mezclarlos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml: 6,25 μL de agua destilada, 1,25 μL de cebador de miARN de 5 μM disueltos en agua libre de nucleasas, 12,5 μL de mezcla maestra de PCR 2x y 2,5 μL de cebador universal 10x.
- Preparar y derretir el ADNc sintetizado como se describe en el Paso 5 (suero) o el Paso 6 (riñón). Vórtice y centrifuga el ADNc durante 5 s.
- Tomar alícuotas de 22,5 μL del reactivo (como se describe en el paso 7.2 anterior) y colocarlas por separado en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
- Añadir una alícuota de 2,5 μL de ADNc a cada pocillo de la placa.
- Para fijar la película adhesiva a la placa, utilice el aplicador de película adhesiva. Centrifugar la placa durante 30 s a 1.000 x g en el rotor de centrífuga de 96 pocillos. Estabilizar la reacción en el fondo de cada pocillo.
8. Uso del sistema y software de PCR en tiempo real para ejecutar el programa de ciclismo de PCR
- Comience el sistema de PCR en tiempo real. Coloque la placa creada como se describe en el Paso 7.6. en el sistema de PCR en tiempo real. Modificar la configuración; proporcione un nombre para el experimento y, a continuación, seleccione 96 pocillos (0,2 ml ) como tipo de experimento del sistema, TC comparativa (ΔΔCT) como método de cuantificación, estándar como modo de ejecución del sistema y reactivos verdes SYBR como reactivos para detectar la secuencia objetivo.
- Proporcione nombres para la muestra y los miARN objetivo, y nombre la muestra y el miARN objetivo en cada pocillo. Asigne muestras duplicadas para obtener datos adecuados para confirmar los resultados, y elija una muestra de referencia y el control endógeno. Para que el tinte se utilice como referencia pasiva, seleccione ninguno. Para eliminar la contaminación cruzada de reactivos, configure una transcriptasa inversa negativa y un control sin plantilla para la expresión de miARN.
- A continuación, asegúrese de que el volumen de reacción se establece en 20 μL y las condiciones de ciclo de PCR se establecen de la siguiente manera: 95 °C durante 15 min, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 15 s, recocido a 55 °C durante 30 s y, por último, extensión a 70 °C durante 30 s.
- Haga clic en analizar en el programa de software del sistema para analizar los datos de qRT-PCR una vez completado el proceso. Confirme que la línea de umbral seleccionada automáticamente por el programa es apropiada para cada pozo.
- Verifique el valor del ciclo umbral (TC) del control endógeno y los miRNAs diana analizados en cada muestra. Determine los valores de CT mediante la intersección de la curva de amplificación y la línea umbral.
NOTA: En el presente estudio, RNU6-2 y miRNA-423-5p se utilizaron como controles endógenos para los niveles de expresión de miRNA diana, y el método ΔΔCT se utilizó para determinar los niveles de expresión relativos de cada miRNAdiana 18.
Representative Results
Para el modelo de ratón con insuficiencia renal dependiente de la edad, utilizamos ratones machos SAMP1 de 50 semanas de edad que pesaban 40-45 g. Se recolectaron aproximadamente 0,8 ml de sangre por ratón y se transfirieron a un tubo de spitz de 1,0 ml con heparina, invertido y centrifugado. Cada riñón se enjuagó con PBS, se diseccionó y se almacenó en nitrógeno líquido para su posterior análisis. Los ratones SAMR1 de cincuenta semanas de edad sirvieron como controles. Basándonos en los datos de miRNA qRT-PCR obtenidos utilizando este modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad, observamos que el nivel renal de miRNA-7219-5p aumentó significativamente y el nivel renal de miRNA-7218-5p disminuyó considerablemente en los ratones SAMP1 en comparación con los controles (Figura 1). Los niveles séricos de miRNA-7219-5p y miRNA-7218-5p aumentaron considerablemente en los ratones SAMP1 en comparación con los controles (Figura 2). Los niveles de expresión de miRNA-223-3p no cambiaron en ninguna de las cepas ni entre el riñón y el suero (Figura 1 y Figura 2).
Figura 1: MicroRNAs expresados diferencialmente en los riñones de ratones SAMP1. Análisis qRT-PCR de la expresión de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p en ratones SAMR1 (control, n = 4) y ratones SAMP1 (n = 4). Los datos son medios ± error estándar (barras de error); Se utilizaron pruebas t para analizar las diferencias entre los grupos; p < 0,05 fue considerado significativo (*p < 0,05), n.s.: no significativo. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso al ratón acelerado por senescencia; SAMR1 = resistencia del ratón acelerada por senescencia 1; qRT-PCR = reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: MiRNAs expresados diferencialmente en el suero de ratones SAMP1. Análisis qRT-PCR de la expresión de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p en ratones SAMR1 (control, n = 4) y ratones SAMP1 (n = 4). Los datos son medias ± SE (barras de error); Se utilizaron pruebas t para investigar diferencias significativas entre los grupos. *P < 0,05 por la prueba T. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso al ratón acelerado por senescencia; SAMR1 = resistencia del ratón acelerada por senescencia 1; qRT-PCR = reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los niveles de expresión de los miRNAs diana se determinaron con éxito mediante el protocolo descrito anteriormente utilizando qRT-PCR. La evaluación de los miRNAs extraídos es un paso importante para obtener datos significativos de qRT-PCR. Para confirmar la calidad adecuada de los miRNAs antes de realizar la qRT-PCR, se debe utilizar espectrofotometría para determinar la relación de absorbancia a 260 nm a 280 nm. Puede producirse contaminación por ADN y/o dímeros de cebador en cada pocillo de la placa de reacción si la qRT-PCR no proporciona una sola amplificación por PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión, o si proporciona una curva de fusión monomodal.
Los niveles de expresión de MiRNA se pueden evaluar mediante varios métodos distintos de qRT-PCR, incluyendo northern blotting, un microarray y ensayos de protección de ribonucleasa. Sin embargo, el método qRT-PCR es un procedimiento sensible, preciso, simple y reproducible que requiere un volumen de muestra menor que los requeridos para los ensayos de Northern Blot y protección contra ribonucleasa19. Dado que los microarrays pueden medir la expresión de decenas de miles de miRNAs simultáneamente, pueden usarse para identificar marcadores de miRNA candidatos. Los datos de microarrays también muestran una alta correlación general con los datos obtenidos por qRT-PCR20. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre la metodología óptima para comparar los datos de microarrays obtenidos en diferentes estudios21.
La evaluación de los miRNAs séricos tiene las siguientes características. En primer lugar, es fácil recolectar suero, y como los miARN séricos son estables contra la congelación y descongelación, la temperatura y el ácido, los miARN pueden ser buenos biomarcadores. En segundo lugar, existe una alta homología de miARN entre especies, y los resultados de los experimentos con animales se extrapolan fácilmente a los humanos. En tercer lugar, los miRNAs séricos han mostrado potencial para su uso como fármacos terapéuticos3. Varios estudios también han demostrado que el nivel de expresión de miRNA en órganos se correlaciona con miRNA en suero22,23,24. En el presente estudio, miRNA-223-3p, cuyos niveles renales no mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, tampoco mostraron diferencias significativas entre cepas en el suero. En contraste, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p, cuyos niveles renales mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, mostraron diferencias considerables entre cepas en el suero.
Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. En primer lugar, su utilidad no se ha verificado en otros órganos como el hígado y el pulmón, y en segundo lugar, no se ha probado en otros animales de laboratorio como ratas, perros y cerdos. Varios grupos de investigación han utilizado este protocolo para la purificación y detección de miRNAs mediante qRT-PCR y han informado de que este protocolo permitió la purificación de ARN de alta calidad a partir de tejidos y suero 13,14,22,23,24. Se ha demostrado que este método tiene una alta precisión y sensibilidad para detectar la expresión de miRNAs 13,14,22,23,24. Los resultados del presente estudio demuestran que este protocolo puede detectar con éxito la expresión de miARN en el suero y el riñón de ratones. Por lo tanto, el protocolo se puede utilizar para determinar los perfiles de expresión de miARN sérico y renal en ratones con una variedad de patologías. Debido a la simplicidad del protocolo, se puede procesar simultáneamente un gran número de muestras. Los análisis de la expresión de muchos miRNAs en diversas condiciones patológicas del riñón pueden, por lo tanto, utilizar el protocolo descrito en este documento.
Hay ciertos aspectos del protocolo a tener en cuenta. Para evitar la degradación de los miARN purificados que ocurriría a temperatura ambiente, los miARN deben mantenerse en hielo. Las muestras de riñón deben homogeneizarse hasta que se disuelvan completamente en el reactivo de lisis. El riñón de ratón contiene una cantidad sustancial de tejido conectivo que es insoluble en el reactivo de lisis y, por lo tanto, se requiere una trituradora de columna para una mayor homogeneización. Además, el miARN de control endógeno apropiado (con expresión estable entre las muestras) debe validarse a lo largo de la configuración de un experimento qRT-PCR. Esto se debe a que la interferencia de diversas sustancias durante la realización de este protocolo puede alterar los niveles de expresión de los miRNAs de control endógenos, posiblemente comprometiendo los resultados. En conclusión, este artículo describe un protocolo qRT-PCR para la detección, purificación y evaluación de la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL spitz with heparin | Greiner-bio-one | 450534 | |
| Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4) | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2) | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00003871 | 5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3' |
| miRNA-423-5p primer | Qiagen | MS00012005 | 5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3' |
| miRNA-7218-5p primer | Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG -3' |
| miRNA-7219-5p primer | Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA GA-3' |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miRNeasy Serum/Plasma kit | Qiagen | 217184 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube |
| miScript II RT kit (reverse transcription buffer) | Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent) | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not disclosed due to confidentiality |
| SAMP1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| SAMR1 male mice | Nippon SLC Corporation | Not assigned | |
| Takara biomasher standard | Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer |
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