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Zebrafish लार्वा में रीढ़ की हड्डी के उत्थान का अध्ययन करने के लिए नियंत्रित अर्ध-स्वचालित लेजर-प्रेरित चोटें

Published: November 22, 2021 doi: 10.3791/63259
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

ERRATUM NOTICE

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल लार्वा हैंडलिंग के लिए एक स्वचालित माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म के साथ संयुक्त लेजर घाव प्रणाली का उपयोग करके ज़ेब्राफ़िश लार्वा में ऊतक-विशिष्ट और अत्यधिक पुनरुत्पादक चोटों को प्रेरित करने की एक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

ज़ेब्राफ़िश लार्वा में निषेचन के कुछ दिनों बाद ही उच्च पुनर्योजी क्षमता के साथ एक पूरी तरह से कार्यात्मक केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) होता है। यह इस पशु मॉडल को रीढ़ की हड्डी की चोट और पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी बनाता है। इस तरह के घावों को प्रेरित करने के लिए मानक प्रोटोकॉल ट्रंक के पृष्ठीय भाग को मैन्युअल रूप से ट्रांसेक्ट करना है। हालांकि, इस तकनीक को व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और अतिरिक्त ऊतकों को नुकसान पहुंचाता है। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए लेजर-प्रेरित घावों के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, जिससे कई जानवरों पर और विभिन्न सत्रों के बीच रीढ़ की हड्डी के उच्च पुनरुत्पादन और पूर्णता की अनुमति मिलती है, यहां तक कि एक अप्रशिक्षित ऑपरेटर के लिए भी। इसके अलावा, ऊतक क्षति मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी तक ही सीमित है, विभिन्न ऊतकों को घायल करने से भ्रमित प्रभाव को कम करती है, उदाहरण के लिए, त्वचा, मांसपेशियों और सीएनएस। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी के हेमी-घाव संभव हैं। लेजर चोट के बाद ऊतक अखंडता का बेहतर संरक्षण अतिरिक्त विश्लेषण के लिए आवश्यक आगे विच्छेदन की सुविधा प्रदान करता है, जैसे कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी। इसलिए, यह विधि चोट की सीमा का सटीक नियंत्रण प्रदान करती है जो मैन्युअल रूप से अप्राप्य है। यह भविष्य में इस शक्तिशाली मॉडल में नए प्रयोगात्मक प्रतिमानों की अनुमति देता है।

Introduction

स्तनधारियों के विपरीत, ज़ेबराफ़िश (डैनियो रेरियो) चोट के बाद अपने केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की मरम्मत कर सकते हैं1। रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के लिए एक मॉडल के रूप में ज़ेब्राफ़िश लार्वा का उपयोग अपेक्षाकृत हाल ही में है। यह मरम्मत के अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मूल्यवान साबित हुआ है2। यह हेरफेर की आसानी, लघु प्रयोगात्मक चक्र (हर हफ्ते नए लार्वा), ऊतकों की ऑप्टिकल पारदर्शिता, और लार्वा के छोटे आकार के कारण होता है, जो विवो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में आदर्श रूप से उपयुक्त होता है।

रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन के मामले में, लार्वा का उपयोग करने के दो अतिरिक्त फायदे वसूली की गति हैं, वयस्कों के लिए कुछ हफ्तों की तुलना में कुछ दिन, और मैनुअल तकनीकों का उपयोग करके चोटों को प्रेरित करने में आसानी। यह कई अध्ययनों में सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है3,4,5, हाल ही में जांच 6,7 सहित। कुल मिलाकर, यह सार्थक डेटा उत्पादन में वृद्धि, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की उच्च अनुकूलन क्षमता और प्रयोगात्मक लागत में कमी की ओर जाता है। निषेचन के बाद 5 दिनों से कम उम्र के लार्वा का उपयोग भी पशु अनुसंधान में 3R सिद्धांतों का पालन करते हुए जानवरों के उपयोग को कम करता है।

ज़ेब्राफ़िश लार्वा में रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद, कई जैविक प्रक्रियाएं होती हैं, जिनमें भड़काऊ प्रतिक्रिया, सेल प्रसार, न्यूरोजेनेसिस, जीवित या नव उत्पन्न कोशिकाओं का प्रवास, कार्यात्मक अक्षतंतुओं का सुधार, और तंत्रिका प्रक्रियाओं सर्किट और रीढ़ के ऊतकों की एक वैश्विक रीमॉडलिंग 6,7,9,10 शामिल हैं . सफलतापूर्वक व्यवस्थित होने के लिए, इन प्रक्रियाओं में सेल प्रकारों, बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स घटकों और जैव रासायनिक संकेतों 11,12 की एक श्रृंखला के बीच एक बारीक विनियमित बातचीत शामिल है। रीढ़ की हड्डी जैसे जटिल ऊतक के इस महत्वपूर्ण पुनर्गठन के विवरण को उजागर करने के लिए सटीक और नियंत्रित प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों के उपयोग और विकास की आवश्यकता होती है।

ज़ेब्राफ़िश में रीढ़ की हड्डी के उत्थान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाने वाला प्राथमिक प्रयोगात्मक प्रतिमान लकीर, छुरा घोंपने, या क्रायोइंजरी 3,13 द्वारा ऊतक क्षति को प्रेरित करने के लिए सर्जिकल साधनों का उपयोग करना है। इन दृष्टिकोणों में माइक्रोसर्जरी कौशल में विशिष्ट प्रशिक्षण की आवश्यकता का नुकसान है, जो किसी भी नए ऑपरेटर के लिए समय लेने वाला है और अल्पकालिक परियोजनाओं में उनके उपयोग को रोक सकता है। इसके अलावा, वे आमतौर पर आसपास के ऊतकों को नुकसान पहुंचाते हैं, जो पुनर्जनन को प्रभावित कर सकते हैं।

एक अन्य दृष्टिकोण रासायनिक रूप से कोशिका क्षति को प्रेरित करना है14 या आनुवंशिक जोड़तोड़ 15 द्वारा। उत्तरार्द्ध अत्यधिक लक्षित क्षति के लिए अनुमति देता है। हालांकि, इस तरह की तकनीक के लिए किसी भी प्रयोग को करने से पहले नई ट्रांसजेनिक मछली उत्पन्न करने के लिए लंबे समय तक प्रारंभिक कार्य की आवश्यकता होती है, हर बार एक अद्वितीय सेल प्रकार को लक्षित करने पर नवीनीकृत किया जाता है।

इस प्रकार, पुनर्जनन में विभिन्न प्रकार के अध्ययनों के लिए उपयुक्त लक्षित लेकिन बहुमुखी घावों की अनुमति देने वाली एक विधि की आवश्यकता है। एक समाधान ब्याज 16,17,18,19,20 के ऊतक में स्थानीयकृत क्षति को प्रेरित करने के लिए एक लेजर का उपयोग करना है। दरअसल, लेजर-प्रेरित ऊतक क्षति का उपयोग कई फायदों के साथ रीढ़ की हड्डी के घावों को उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस तरह के लेजर हेरफेर मॉड्यूल से सुसज्जित माइक्रोस्कोप एक अनुकूलित आकार के क्षेत्र को निर्दिष्ट करने की अनुमति देते हैं जहां सेल एब्लेशन होगा, अस्थायी नियंत्रण के अतिरिक्त लाभ के साथ। घाव के आकार और स्थिति को इस प्रकार किसी भी प्रश्न को संबोधित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

अधिकांश लेजर घाव प्रणालियों की लापता विशेषता लार्वा की एक श्रृंखला के लिए अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य तरीके से चोटों को प्रेरित करने की संभावना है। यहां एक मूल प्रोटोकॉल को एक यूवी लेजर का उपयोग करके वर्णित किया गया है ताकि जेब्राफ़िश लार्वा में अर्ध-स्वचालित सटीक और नियंत्रित घावों को प्रेरित किया जा सके, जो स्वचालित लार्वा हैंडलिंग 21 के लिए डिज़ाइन किए गए माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफ़ॉर्म पर आधारित है। इसके अलावा, यहां प्रस्तुत प्रणाली में, लार्वा को एक ग्लास केशिका में डाला जाता है, जो अपने रोस्ट्रोकडल अक्ष के चारों ओर जानवर के मुक्त रोटेशन की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता यह चुन सकता है कि लेजर को प्रस्तुत करने के लिए लार्वा के किस पक्ष को लेजर को प्रस्तुत करना है, जबकि प्रतिदीप्ति इमेजिंग को लेजर बीम को ठीक से लक्षित करने और घाव के बाद क्षति का आकलन करने की अनुमति देता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग एक अर्ध-स्वचालित ज़ेब्राफ़िश लार्वा इमेजिंग सिस्टम के साथ किया जाता है जो यूवी लेजर से लैस कताई डिस्क के साथ संयुक्त होता है (इसके बाद VAST सिस्टम के रूप में नामित)। हालांकि, प्रोटोकॉल के मुख्य बिंदु और तकनीक के अधिकांश दावे सेल एब्लेशन में सक्षम लेजर से लैस किसी भी प्रणाली के लिए मान्य हैं, जिसमें दो-फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप, यूवी लेजर (एफआरएपी मॉड्यूल) के साथ प्रदान किए गए कताई-डिस्क माइक्रोस्कोप, या फोटो हेरफेर के लिए लेजर मॉड्यूल के साथ वीडियो-माइक्रोस्कोप शामिल हैं। VAST प्रणाली और पारंपरिक नमूना हैंडलिंग के बीच मुख्य अंतरों में से एक यह होगा कि उत्तरार्द्ध के लिए, ग्लास कवरलिप्स / ग्लास-बॉटम पेट्री व्यंजनों पर कम-पिघलने-बिंदु एगारोज़ में बढ़ते लार्वा की आवश्यकता होगी, जो उन्हें 96-अच्छी तरह से प्लेट में लोड करने के स्थान पर होगा।

इस विधि द्वारा प्रदान किए गए लाभ पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान सेलुलर और आणविक तंत्र पर अभिनव अनुसंधान के लिए अवसर खोलते हैं। इसके अलावा, उच्च डेटा गुणवत्ता एक बहुआयामी संदर्भ में मात्रात्मक जांच के लिए अनुमति देती है।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन यूके होम ऑफिस से अनुमोदन के साथ और इसके नियमों के अनुसार, परियोजना लाइसेंस PP8160052 के तहत किए गए थे। इस परियोजना को एडिनबर्ग विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए, जेब्राफ़िश लार्वा या तो लिंग के 5-दिन के पुराने तक निम्नलिखित उपलब्ध ट्रांसजेनिक लाइनों में से उपयोग किया गया था: Tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg (Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s), और Tg(mnx1:gfp) (ट्रांसजेनिक ज़ेब्रेफ़िश लाइनों की पीढ़ी के बारे में पूरक फ़ाइल 1 देखें)। स्वचालित ज़ेब्राफ़िश लार्वा हैंडलिंग प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके प्रोटोकॉल की एक योजनाबद्ध आकृति 1 में दिखाया गया है। इस कार्य में उपयोग किए जाने वाले सभी कस्टम सॉफ़्टवेयर, स्क्रिप्ट और विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ पर उपलब्ध हैं।

1. नमूना तैयारी

  1. निषेचन के बाद 5 घंटे में, सही विकास ता्मक चरण 21 के लिए भ्रूण को सॉर्ट करें। मृत अंडे और खराब विकसित और अतिविकसित भ्रूण को छोड़ दें।
  2. 3 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) पर, 90 मिमी पेट्री डिश में मछली की सुविधा के पानी के 50 मिलीलीटर में 0.4% एमिनोबेंजोइक-एसिड-एथिल मिथाइल-एस्टर के 2 मिलीलीटर को जोड़कर लार्वा को एनेस्थेटिकाइज़ करें। त्वचा रंजकता को रोकने के लिए फेनिलथियोरिया (पीटीयू) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ उठाए गए जानवरों का उपयोग करें यदि यह एक मुद्दा है, जो इस प्रोटोकॉल में वर्णित 3 डीपीएफ लार्वा पर रीढ़ की हड्डी की चोटों के लिए मामला नहीं है।
    नोट: यह अपेक्षाकृत उच्च संवेदनाहारी एकाग्रता लेजर प्रभाव के बाद लार्वा के आंदोलनों को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है।
  3. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अभिव्यक्ति (पूरक फ़ाइल 1) के लिए भ्रूण स्क्रीन।
    नोट: रीढ़ की हड्डी (या ब्याज की अन्य संरचना) के लिए एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अक्सर चोट की दक्षता का आकलन करने के लिए आवश्यक होता है। Tg (Xla.Tubb:DsRed) का उपयोग रीढ़ की हड्डी की पहचान करने में मदद करता है।
  4. चयनित लार्वा को VAST प्रणाली में उपयोग के लिए एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित करें ( सामग्री की तालिका देखें) प्रति कुएं में मछली की सुविधा के पानी के 300 μL के साथ। सीधे 90 मिमी पेट्री डिश से संवेदनाहारी युक्त माध्यम का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि प्रति अच्छी तरह से केवल एक लार्वा है। घाव वाले लार्वा को इकट्ठा करने के लिए एक अतिरिक्त खाली 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
    नोट: यदि किसी अन्य लेजर घाव प्रणाली का उपयोग कर रहे हैं, तो लार्वा को एक उपयुक्त अवलोकन कक्ष में 1% कम-पिघलने बिंदु (एलएमपी) एगारोज़ जेल में माउंट करें।

2. माइक्रोस्कोप तैयारी

  1. एब्लेशन के लिए लेजर सहित सभी सिस्टम घटकों (VAST, माइक्रोस्कोप, लेजर, पीसी) पर स्विच करें।
  2. एक बार जब हार्डवेयर पूरी तरह से प्रारंभ हो जाता है, तो माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर, ImageJ / Fiji, एक पायथन एकीकृत विकास वातावरण (IDE), और स्वचालित ज़ेब्राफ़िश इमेजिंग (VAST सिस्टम) सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें यदि इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग कर रहे हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए VAST सॉफ़्टवेयर सेट करें.
    1. जब VAST सॉफ़्टवेयर लॉन्च होता है, तो पहली विंडो पर प्लेट चुनें और डन बटन (चित्रा 2A) पर क्लिक करें। एक और छोटी खिड़की यह पूछने के लिए पॉप अप करेगी कि केशिका खाली और साफ है या नहीं। केशिका की छवि को देखकर सत्यापित करें कि क्या अंदर कोई हवा के बुलबुले हैं। यदि नहीं, तो हाँ पर क्लिक करें। यदि कोई बुलबुले हैं, तो नहीं पर क्लिक करें और चरण 2.3.2-2.3.3 (चित्रा 2B) का पालन करें।
    2. बड़े कण (LP) नमूना विंडो पर, हवा के बुलबुले (चित्रा 2C) को हटाने के लिए प्राइम पर क्लिक करें।
    3. मुख्य सॉफ़्टवेयर विंडो पर जाएं (केशिका छवि के साथ) और छवि पर राइट-क्लिक करें। पॉप-अप मेनू (चित्रा 2B) पर रिकॉर्ड खाली केशिका छवि का चयन करें।
    4. LP Sampler विंडो में, फ़ाइल मेनू पर जाएँ और स्क्रिप्ट खोलें विकल्प का चयन करें। निष्पादित किए जाने वाले प्रयोग के अनुरूप स्क्रिप्ट वाली फ़ाइल चुनें.
    5. मुख्य VAST सॉफ़्टवेयर विंडो में, फ़ाइल पर जाएँ और ओपन एक्सपेरिमेंट चुनें. नियोजित प्रयोग के अनुरूप प्रयोग फ़ाइल चुनें.
      नोट:: सुनिश्चित करें कि बक्से स्वत: अनलोड और अपशिष्ट करने के लिए बल्क आउटपुट चेक नहीं हैं।
  4. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर सेट करें।
    1. हार्डवेयर को प्रारंभ करने के लिए माइक्रोस्कोप इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह सिस्टम के आधार पर कुछ मिनट लग सकते हैं।
    2. अधिग्रहण सेटिंग्स पर जाएं और लार्वा में व्यक्त फ्लोरोफोर की इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप स्थापित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए 10x एनए 0.5 पानी-डुबकी उद्देश्य का उपयोग करें कि फोकल वॉल्यूम रीढ़ की हड्डी या लक्षित ऊतक की पूरी गहराई को घायल करने के लिए ऑप्टिकल अक्ष के साथ पर्याप्त लम्बी है।
  5. लेजर घावों के लिए ImageJ / फिजी सेट करें।
    1. फ़ाइल मेनू पर जाएँ, स्क्रिप्ट विंडो खोलने के लिए नया/स्क्रिप्ट चुनें.
    2. नई विंडो में, फ़ाइल मेनू पर जाएँ और लेजर घाव स्क्रिप्ट (Manual_MP_Operation.ijm) लोड करने के लिए खोलें चुनें।
  6. Python IDE सेट करें।
    1. Python IDE लॉन्च करें।
    2. फ़ाइल मेनू पर जाएँ और लेजर (Watch_for_ROIs_py3.py) को प्रबंधित करने के लिए स्क्रिप्ट को लोड करने के लिए फ़ाइल खोलें चुनें।
    3. चलाएँ मेनू पर जाएँ और स्क्रिप्ट को चलाने के लिए डीबगिंग के बिना चलाएँ चुनें। यह सुनिश्चित करने के लिए जाँचें कि टर्मिनल पैनल में संदेशों का एक अनुक्रम कुछ शोर के साथ दिखाई देता है, जबकि लेजर attenuator initializes (चित्रा 2D)।

3. विशाल प्रणाली पर लेजर घावों का प्रदर्शन

  1. VAST सॉफ़्टवेयर (चित्रा 2B) की मुख्य विंडो पर तीर बटन पर क्लिक करके मंच को स्थानांतरित करके माइक्रोस्कोप उद्देश्य के सापेक्ष केशिका को केंद्र में रखें।
  2. आईपीस के माध्यम से देखकर और माइक्रोस्कोप के संचारित प्रकाश का उपयोग करके केशिका के शीर्ष पर ध्यान केंद्रित करें।
    सावधानी: केशिका बहुत नाजुक है और उद्देश्य से छूने पर टूट सकती है। माइक्रोस्कोप घुंडी को धीरे-धीरे ले जाएं जब अंदर और बाहर ध्यान केंद्रित करें।
  3. विशाल प्रणाली के एलपी नमूना के प्लेट धारक पर 96-अच्छी तरह से प्लेटों जगह. बाएं धारक पर लार्वा युक्त प्लेट और दाईं ओर संग्रह के लिए प्लेट रखें। सुनिश्चित करें कि प्लेटें सही ढंग से उन्मुख हैं: ए 1 अच्छी तरह से धारक के सामने-बाएं कोने में होना चाहिए।
  4. VAST सॉफ़्टवेयर में, LP Sampler विंडो पर, प्लेट टेम्पलेट बटन पर क्लिक करें और लार्वा युक्त सभी कुओं का चयन करें। विंडो को सत्यापित करने और बंद करने के लिए ठीक बटन पर क्लिक करें (चित्रा 2 सी)।
  5. LP Sampler विंडो में, एक लार्वा लोड करना शुरू करने के लिए प्लेट चलाएँ बटन पर क्लिक करें।
    नोट: कुछ समय के बाद, लार्वा स्थिति में केशिका में दिखाई देना चाहिए (प्रयोग परिभाषा फ़ाइल में पूर्वनिर्धारित), रीढ़ की हड्डी को घायल करने की अनुमति देता है। VAST ट्रे प्रकाश माइक्रोस्कोप उद्देश्य का सामना कर पार्श्व पक्ष के साथ लार्वा सेट करने के लिए कुछ rotations के बाद बंद हो जाएगा।
  6. माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर जाएं और लार्वा की छवि बनाने के लिए लाइव बटन पर क्लिक करें।
  7. माइक्रोस्कोप फोकस घुंडी को तब तक घुमाएं जब तक कि रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर दिखाई न दे।
    नोट: पहले प्रेषित प्रकाश का उपयोग करके ध्यान केंद्रित करना आसान हो सकता है, और फिर प्रतिदीप्ति के साथ परिष्कृत हो सकता है।
  8. प्रतिदीप्ति में एक स्नैपशॉट ले लो और एक समर्पित फ़ोल्डर के लिए छवि को बचाने के लिए।
  9. ImageJ में छवि खोलें और यदि आवश्यक हो तो इसके विपरीत समायोजित करें ( ImageJ में छवि / समायोजित / चमक / कंट्रास्ट ... मेनू का उपयोग करके)।
  10. रुचि के क्षेत्र (ROI) लाइन उपकरण पर क्लिक करें और रीढ़ की हड्डी (चित्रा 3A) पर केंद्रित एक छोटी रेखा (20 μm) खींचें।
  11. माइक्रोस्कोप को 100% परावर्तक दर्पण स्थिति में स्विच करें।
  12. ImageJ स्क्रिप्ट लोड करें और रन बटन पर क्लिक करें। निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: पुनरावृत्ति - 2; नमूना - 1; चौड़ाई - 40-माइक्रोन; क्षीणन - 89 (पूर्ण लेजर शक्ति) (चित्रा 3 सी)।
  13. जब लेजर शॉट अनुक्रम समाप्त हो जाता है, तो इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर स्विच करें और यदि आवश्यक हो तो फ़ोकस को समायोजित करें।
    नोट: फोकस में एक बदलाव अक्सर लेजर एक्सपोजर के दौरान पूंछ विस्थापन के कारण मनाया जाता है।
  14. एक नया स्नैपशॉट लें और इसे सहेजें।
  15. इमेजजे में इस नई छवि को खोलें और एक नई रेखा खींचें जो रीढ़ की हड्डी से बड़ी होनी चाहिए (~ 80 μm), नोटोकॉर्ड के ऊपरी हिस्से में रीढ़ की हड्डी के वेंट्रल पक्ष के नीचे शुरू होती है और रीढ़ की हड्डी और त्वचा के बीच की जगह में समाप्त होने के लिए पृष्ठीय पक्ष की ओर जाती है (चित्रा 3 बी)।
  16. माइक्रोस्कोप को 100% परावर्तक दर्पण स्थिति में स्विच करें।
  17. ImageJ स्क्रिप्ट विंडो पर जाएं और रन बटन पर क्लिक करें। निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: पुनरावृत्ति - 2; नमूना - 1; चौड़ाई - 40 माइक्रोन; क्षीणन - 89 (पूर्ण लेजर शक्ति).
  18. (लंबे समय तक) लेजर शॉट अनुक्रम समाप्त होने के बाद, प्रतिदीप्ति इमेजिंग और ध्यान केंद्रित करके ट्रांसेक्शन गुणवत्ता को सत्यापित करें। सुनिश्चित करें कि घाव स्थल में कोई सेल या अक्षतंतु बरकरार नहीं रहते हैं, जो अंधेरे के रूप में या बेहोश और सजातीय फ्लोरोसेंट क्षेत्र के रूप में दिखाई देना चाहिए (चित्रा 3 डी, नीचे पैनल)।
  19. मुख्य VAST सॉफ़्टवेयर विंडो पर जाकर और कलेक्ट बटन पर क्लिक करके खाली 96-अच्छी तरह से प्लेट (मूल अच्छी तरह से के रूप में एक ही अच्छी तरह से समन्वय के साथ) में घाव वाले लार्वा को इकट्ठा करें ।
  20. विंडो के नीचे बाईं ओर चेक बॉक्स ट्रे लाइट पर क्लिक करके VAST सिस्टम लाइट पर वापस स्विच करें।
  21. प्रत्येक नए लार्वा को घायल करने के लिए चरण 3.3-3.17 को दोहराएं।

4. पोस्ट घाव हैंडलिंग और अतिरिक्त प्रयोगों

  1. जितनी जल्दी हो सके 96-अच्छी तरह से प्लेट से लार्वा निकालें और उन्हें लार्वा के लिए ताजा मछली सुविधा पानी के साथ एक साफ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें ताकि घाव के बाद ठीक हो सके। पेट्री डिश को 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: नुकसान अक्सर घाव के बाद पहले घंटे में प्रचार करने के लिए जारी रहता है। घाव की वास्तविक सीमा इस प्रकार लगभग 1 घंटे की देरी के बाद प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

5. समस्या निवारण

  1. यदि हवा के बुलबुले VAST सिस्टम की ट्यूबों और केशिका में मौजूद हैं, तो उन्हें हटाने के लिए LP Sampler विंडो पर प्राइम बटन पर क्लिक करें।
  2. असफल घावों पर विचार करें (जैसा कि अपेक्षित अवशिष्ट और समरूप पृष्ठभूमि के अलावा घाव स्थल में शेष प्रतिदीप्ति से मूल्यांकन किया गया है), जो नीचे उल्लिखित कई कारणों से हो सकता है।
    1. कम लेजर शक्ति: जब ऐसा होता है, तो उच्च मूल्य के साथ प्रयास करें।
      नोट: विशाल प्रणाली एक डाई लेजर के साथ सुसज्जित है. इसका तात्पर्य यह है कि लेजर प्रकाश पीढ़ी के लिए उपयोग किए जाने वाले डाई समाधान की एकाग्रता समय के साथ बदल सकती है, जिससे लेजर शक्ति में कमी आ सकती है। एक ताजा समाधान के साथ बदलने से आमतौर पर समस्या का समाधान होता है22।
    2. खराब अंशांकन: जब ऐसा होता है, तो चरण 5.2.2.1-5.2.2.4 के अनुसार लेजर सिस्टम के अंशांकन और शक्ति को सत्यापित करें। यदि सही ढंग से कैलिब्रेट नहीं किया गया है, तो लेजर को वांछित स्थान पर निर्देशित नहीं किया जाएगा, इस प्रकार आसन्न ऊतकों में असफल घावों या अवांछित क्षति के लिए अग्रणी होगा।
      1. केशिका कक्ष के शीर्ष पर एक दर्पण स्लाइड रखें। लेपित पक्ष पर ध्यान केंद्रित करें (इसे उद्देश्य का सामना करना चाहिए)। अधिक आसानी से फ़ोकस करने के लिए स्लाइड में पिछले डिफ़ॉल्ट का उपयोग करें.
      2. अंशांकन स्क्रिप्ट का उपयोग करके लेजर एब्लेशन का एक पैटर्न लागू करें।
      3. पैटर्न की गुणवत्ता का आकलन करें। धब्बे या रेखाएं तेज दिखाई देनी चाहिए और धुंधली नहीं होनी चाहिए।
      4. यह मूल्यांकन करने के लिए बढ़ती शक्ति के साथ एक रैंप का उपयोग करें कि क्या पिछले सत्रों की तुलना में लेजर शक्ति बदल गई है।
    3. घावों के दौरान लार्वा आंदोलन: लार्वा संज्ञाहरण के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करते हैं; इस प्रकार, लेजर घाव प्रक्रिया के दौरान पूंछ के आंदोलनों को ट्रिगर कर सकता है, इस प्रकार एक सफल ट्रांससेक्शन को रोक सकता है। जब ऐसा होता है, तो इसे पूरा करने के लिए लेजर घाव चरणों का एक अतिरिक्त पुनरावृत्ति लें, जबकि अभी भी आसपास के ऊतकों को नुकसान से बचा जा सकता है।
    4. बुरा फोकस: जब ऐसा होता है, तो सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए केंद्रीय नहर के बीच पर ध्यान केंद्रित करें।
    5. ROI ड्राइंग, स्थिति, और आकार: ROI की स्थिति और आकार सफल transections के लिए महत्वपूर्ण हैं। आरओआई रीढ़ की हड्डी से बड़ा होना चाहिए और रीढ़ की हड्डी के केंद्र पर केंद्रित होना चाहिए। इसे हल करने के लिए, रीढ़ की हड्डी के वेंट्रल पक्ष से आरओआई को आकर्षित करना शुरू करें और सफल ट्रांससेक्शन प्राप्त करने के लिए पृष्ठीय पक्ष की ओर जाएं। यह एब्लेशन प्रक्रिया के दौरान लेजर शॉट्स के अनुक्रम द्वारा ट्रिगर पूंछ आंदोलनों के कारण होने की संभावना है।

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Representative Results

रीढ़ की हड्डी के रूपांतरण का सत्यापन
यह आकलन करने के लिए संरचनात्मक और कार्यात्मक जांच की गई थी कि क्या प्रोटोकॉल एक पूर्ण रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन की अनुमति देता है।

सबसे पहले, यह सत्यापित करने के लिए कि घाव स्थल पर प्रतिदीप्ति में नुकसान न्यूरोनल ऊतक क्षति के कारण था और लेजर रोशनी से प्रतिदीप्ति फोटोब्लीचिंग नहीं थी, एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्युनोस्टेनिंग ( सामग्री की तालिका और पूरक फ़ाइल 1 देखें) किया गया था। घाव के पुच्छल और रोस्ट्रल पक्षों के बीच अक्षतंतुओं का एक पूर्ण व्यवधान देखा गया था, जो रीढ़ की हड्डी के पूर्ण ट्रांसेक्शन की पुष्टि करता है (चित्रा 4 बी)। एक सफल रीढ़ की हड्डी के ट्रांसेक्शन को घाव स्थल पर किसी भी शेष न्यूरोनल प्रक्षेपण को नहीं छोड़ना चाहिए (एक असफल घाव के उदाहरण के लिए चित्रा 4 सी देखें)। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, रीढ़ की हड्डी के लेजर घावों की सफलता दर 75% (16 जानवरों में चार अधूरे ट्रांसेक्शन) होने का अनुमान लगाया गया था।

लेजर घाव के बाद कार्यक्षमता के नुकसान की जांच कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करके की गई थी। बरकरार मछली पर, सहज समन्वित न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि पूरे रीढ़ की हड्डी के साथ प्रतिदीप्ति चोटियों को उत्पन्न करती है। एक सफल अभिकर्मक घाव के दोनों किनारों के बीच इस गतिविधि के प्रसार को बाधित करेगा। रीढ़ की हड्डी transection की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए, लेजर घावों tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) लार्वा पर 3 dpf पर प्रदर्शन किया गया था। एक नई बहु-अच्छी तरह से प्लेट में संग्रह के बाद, लार्वा को हल्के से एनेस्थेटिक किया गया था। उन्हें कम-पिघलने-बिंदु agarose में एक ग्लास कवरस्लिप पर रखा गया था ताकि 3 ज पोस्ट-चोट से एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर प्रतिदीप्ति समय-चूक रिकॉर्डिंग की जा सके। घाव स्थल के पुच्छल पक्ष पर गतिविधि का नुकसान देखा गया था। दरअसल, प्रतिदीप्ति के परिमाणीकरण से पता चलता है कि मछली की सहज गतिविधि के कारण स्पाइक्स केवल चोट के बाद रोस्ट्रल पक्ष पर मौजूद थे, लेकिन बरकरार मछली में समतुल्य रोस्ट्रल और पुच्छल स्थितियों में एक समन्वित तरीके से हुए (चित्रा 4 डी, ई)। चोट के बाद पुच्छल पक्ष पर कम अवशिष्ट संकेत संवेदी न्यूरॉन्स की गतिविधि के कारण होने की संभावना थी (शायद रोहोन-दाढ़ी संवेदी न्यूरॉन्स रीढ़ की हड्डी के पुच्छल पक्ष पर 23) रोस्ट्रल पक्ष पर मांसपेशियों के संकुचन से प्रेरित पूंछ आंदोलन की प्रतिक्रिया में।

लेजर घावों द्वारा प्रेरित पुनर्जनन प्रक्रियाएं
चोट (एचपीआई) के बाद 24 घंटे के बाद, घाव बंद होने लगा, जिससे 48 घंटे के बाद रीढ़ की हड्डी की प्रारंभिक संरचना की आंशिक बहाली हुई (चित्रा 5 डी)। कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग करते हुए, 48 hpi के बाद एक आंशिक कार्यात्मक पुन: कनेक्शन की पुष्टि की गई थी (चित्रा 5E, F)। पुच्छल क्षेत्र और रोस्ट्रल क्षेत्र (चित्रा 5 जी) में स्पाइक्स के आयाम के बीच अनुपात (लेखकों द्वारा कनेक्टिविटी बहाली सूचकांक नामित) की गणना ने रीढ़ की हड्डी के उत्थान के दौरान अपेक्षित 3, 24 और 48 एचपीआई के बीच वृद्धि दिखाई।

लेजर घाव एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को ट्रिगर करते हैं
मैक्रोफेज (mpeg1: GFP + कोशिकाओं) भर्ती tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP) लार्वा लेजर घावों (चित्रा 5H, I) का उपयोग करके लेजर घावों के बाद देखा गया था। यह ज़ेब्राफ़िश लार्वा 6,24 में रीढ़ की हड्डी के सफल उत्थान के लिए मैक्रोफेज की आवश्यक भूमिका का प्रदर्शन करने वाले मैनुअल घावों का उपयोग करके लेखकों द्वारा पिछले अध्ययनों के अनुरूप है। यह अवलोकन इंगित करता है कि लेजर चोट के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया जा सकता है और पुष्टि करता है कि ऊतक क्षति हुई है।

लेजर घावों और मैनुअल घावों रीढ़ की हड्डी में वृद्धि हुई न्यूरोजेनेसिस ट्रिगर
पिछले अध्ययनों ने न्यूरोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए मैनुअल घावों का उपयोग किया है जो रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद होता है6,15। लेजर घाव इस घटना का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण हो सकता है। पहले से प्रकाशित एक प्रयोग ने एक मैनुअल रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद न्यूरोजेनेसिस में वृद्धि देखी, जो कि अनलेशन्ड नियंत्रण ों की तुलना में 15 थी। यहां टीजी (mnx1: gfp) मछली का उपयोग मोटर न्यूरॉन्स के रूप में किया जाता था और फ्लोरोसेंटली लेबल किया गया था। एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी स्टेनिंग का उपयोग लार्वा में जीएफपी की दृश्यता में सुधार करने के लिए किया गया था। यह EdU staining25 के साथ संयुक्त किया गया था (अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें), जो नए उत्पन्न न्यूरॉन्स लेबल करता है। ईडीयू को 3 डीपीएफ पर चोट के तुरंत बाद जोड़ा गया था, जिसका अर्थ है कि ईडीयू के साथ लेबल की गई किसी भी कोशिका को चोट के बाद उत्पन्न किया गया था। इसलिए, कोशिकाएं जो कोलोकलाइज्ड स्टेनिंग प्रदर्शित करती हैं, वे नए मोटर न्यूरॉन्स का प्रतिनिधित्व करती हैं जो रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद पैदा होती हैं। चोट साइट के दोनों ओर कोलोकलाइज्ड कोशिकाओं की संख्या, या बिना किसी नियंत्रण में चोट साइट के स्थान और आकार के अनुरूप क्षेत्र में (दो 50 μm खिड़कियों में कैप्चर किया गया) की गणना की गई थी, और कोलोकलाइज्ड कोशिकाओं की औसत संख्या में अंतर का विश्लेषण एक-तरफ़ा एनोवा 26 का उपयोग करके किया गया था।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग न्यूरोजेनेसिस पर प्रत्येक घाव विधि के प्रभावों की तुलना करने के लिए मैन्युअल रूप से और लेजर घाव वाले लार्वा पर किया गया था (चित्रा 6)। मैनुअल और लेजर घावों के बीच लेबल कोशिकाओं की संख्या में कोई अंतर नहीं देखा गया था। Unlesioned मछली दोनों घाव की स्थिति में घाव वाली मछली की तुलना में कम डबल लेबल वाली कोशिकाओं को प्रदर्शित करती है (चित्रा 6 डी)। यह पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है जो मैन्युअल रूप से घायल मछली में न्यूरोजेनेसिस में वृद्धि को दर्शाता है, जो कि अनलिज़न्ड फिश 15 की तुलना में है।

ये परिणाम कैल्शियम इमेजिंग और एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन धुंधला परिणामों का समर्थन करते हैं, क्योंकि लेजर चोट एक मैनुअल घाव के तुलनीय एक पुनर्जनन प्रतिक्रिया प्राप्त करती है। यह इंगित करता है कि लेजर घाव केवल कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति को ब्लीच नहीं कर रहा है, बल्कि एक चोट के परिणामस्वरूप होता है जो एक ही सेलुलर प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करता है जो एक मैनुअल घाव करता है।

लेजर घावों के परिणामस्वरूप मैन्युअल घावों की तुलना में कम त्वचा और मांसपेशियों की क्षति होती है
मैनुअल घावों के परिणामस्वरूप अक्सर बड़ी मात्रा में मांसपेशियों और त्वचा की क्षति होती है। इसके विपरीत, लेजर घावों को रीढ़ की हड्डी को अधिक विशेष रूप से लक्षित किया जा सकता है, जिससे अन्य ऊतकों को नुकसान कम हो जाता है। इसे स्पष्ट करने के लिए, टीजी (बीटा-एक्टिन: यूट्रोफिन-एमसीएच) लार्वा का उपयोग मैनुअल और लेजर घावों को करने के लिए किया गया था। यह लाइन फ्लोरोसेंटली एक एफ-एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन को लेबल करती है, जिससे रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं और मांसपेशियों के तंतुओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति मिलती है। लार्वा तब लाइव घुड़सवार और इमेज किए गए थे (चित्रा 7 ए, बी)। चित्रा 7A रीढ़ की हड्डी को नुकसान दिखाता है। लेजर और मैनुअल घाव दोनों स्थितियों में चोट स्थल में यूट्रोफिन की कमी से पता चलता है कि दोनों घाव विधियों ने रीढ़ की हड्डी में कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाया है। चित्रा 7B मांसपेशियों की क्षति को दर्शाता है। वहाँ एक स्पष्ट शेवरॉन की तरह संरचना myotomes unlesioned स्थिति में है, और एक्टिन फाइबर के बंडल दिखाई दे रहे हैं. मैन्युअल घाव की स्थिति में मायोटोम आकार में एक दृश्यमान व्यवधान है, और कम एक्टिन फाइबर मौजूद हैं। यह महत्वपूर्ण मांसपेशियों की क्षति को दर्शाता है। हालांकि, लेजर घाव की स्थिति में, मायोटोम की शेवरॉन संरचना को बनाए रखा जाता है। मांसपेशियों के तंतुओं को कुछ नुकसान होता है, लेकिन यह मैनुअल घाव की स्थिति में चार के भीतर की तुलना में एक या दो मायोटोम के भीतर निहित है। इसके अलावा, मैन्युअल घाव की स्थिति की तुलना में लेजर घाव की स्थिति में मामूली त्वचा क्षति होती है, जैसा कि चित्रा 7 सी में स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर ली गई छवियों में दिखाया गया है।

कुल मिलाकर, ये परिणाम दर्शाते हैं कि पुनरुत्पादक, अर्ध-स्वचालित लेजर घावों में ज़ेबराफ़िश में तंत्रिका पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण होने की क्षमता है।

Figure 1
चित्रा 1: अर्ध-स्वचालित लेजर-चोट वर्कफ़्लो की योजनाबद्ध. तीन दिन बाद निषेचन (डीपीएफ), लार्वा को 96-अच्छी तरह से प्लेट में लोड किया जाता है और स्वचालित लार्वा हैंडलिंग प्लेटफॉर्म पर रखा जाता है। फिर, प्रत्येक लार्वा को इमेजिंग और लेजर घाव के लिए एक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर 10x एनए 0.5 लेंस के नीचे रखे गए एक केशिका में लोड किया जाता है। घावों के बाद, लार्वा को संग्रह और आगे के प्रयोगों के लिए एक नई 96-अच्छी तरह से प्लेट में उतारा जाता है। शीर्ष पर, tg (Xla.Tubb: DsRed) 3 dpf लार्वा से पहले और लेजर घाव के बाद (स्केल बार = 50 μm) की संचरित और प्रतिदीप्ति छवियां। लार्वा उन्मुख rostral छोड़ दिया और पृष्ठीय ऊपर (सभी आंकड़ों के लिए) कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: अर्ध-स्वचालित ज़ेबराफ़िश लार्वा इमेजिंग सिस्टम और लेजर नियंत्रण प्रणाली के लिए सॉफ़्टवेयर स्टार्ट-अप। (A) स्टार्ट-अप पर VAST सॉफ़्टवेयर। (बी) VAST सॉफ़्टवेयर की मुख्य विंडो खाली केशिका दिखाती है। (सी) एक खाली प्लेट टेम्पलेट के साथ एलपी नमूना विंडो। (D) Watch_for_ROIs_py3.py स्क्रिप्ट चल रहा है के साथ python IDE का दृश्य। नारंगी आयत लेजर attenuator के प्रारंभ के दौरान प्रदर्शित संदेशों के साथ टर्मिनल टैब को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Tg (Xla.Tubb:DsRed) 3 dpf लार्वा पर लेजर घाव अनुक्रम का उदाहरण. (A) ImageJ टूलबार से लाइन ROI उपकरण का चयन करने के बाद 20 μm लाइन का उपयोग करके लेजर घाव का पहला चरण। (बी) रीढ़ की हड्डी के पूर्ण ट्रांसेक्शन के लिए 80 μm लाइन के साथ दूसरा कदम। (C) ImageJ से लेजर को नियंत्रित करने के लिए उपयोग की जाने वाली स्क्रिप्ट का दृश्य। (d) लेजर घावों के दौरान छवियों का अनुक्रम। शीर्ष: घाव से पहले; मध्य: पहले चरण के तुरंत बाद; नीचे: दूसरे चरण के तुरंत बाद (स्केल बार = 50 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र4: एसिटाइलेटेड ट्यूबुलिन इम्युनोस्टेनिंग (ए-सी) और कैल्शियम इमेजिंग (डी, ई) से संकेत मिलता है कि लेजर घाव पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों की निरंतरता को बाधित करता है। (ए) बरकरार रीढ़ की हड्डी। (बी) रीढ़ की हड्डी का पूर्ण रूपांतरण पृष्ठीय-वेंट्रल और औसत दर्जे का पार्श्व अक्षों दोनों के साथ रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का पूर्ण व्यवधान दिखाता है। (c) अपूर्ण अभिकर्मक। (स्केल बार = 50 μm). (D) एक tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) 3 dpf लार्वा पर transacted रीढ़ की हड्डी. आयतों में घाव के रोस्ट्रल (नीले) और पुच्छल (नारंगी) पक्षों में प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले आरओआई को दिखाया गया है। (ई) रोस्ट्रल और पुच्छल विश्लेषण आरओआई में समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन का ग्राफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र5: लेजर चोट एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करती है और सफल शारीरिक और कार्यात्मक वसूली की ओर ले जाती है। (A-D) (A-D) (A) से पहले (A) और लेजर घाव के बाद अलग-अलग समय पर tg (Xla.Tubb:DsRed) 3dpf लार्वा की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण प्रतिदीप्ति छवियां: 3 h (B) के बाद, 24 h (C) के बाद, और 48 h (D) के बाद। (ई-जी) समारोह बहाली का आकलन करने के लिए कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग। (ई) विश्लेषण आरओआई के साथ घाव वाले टीजी (एक्सएलए.टब: जीसीएएमपी 6 एस) लार्वा। (च) रोस्ट्रल और पुच्छल विश्लेषण आरओआई में समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन का ग्राफ। (छ) 3, 24, 48 ज पोस्ट-घाव (एन = 3) पर पुच्छल और रोस्ट्रल स्पाइक आयामों (कनेक्टिविटी बहाली सूचकांक) के बीच के अनुपात का परिमाणीकरण। (H-I) घाव के बाद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का लक्षण वर्णन. (एच) unlesioned (बाएं) और घाव (दाएं) tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) 3 dfp लार्वा की प्रतिदीप्ति छवियां 6 hpi पर मैक्रोफेज (mpeg1 + सेल, हरे) के संचय को दर्शाती हैं। (I) घायल और अक्षुण्ण लार्वा (N = 3) (स्केल बार = 50 μm) में 6 h पोस्ट-घाव पर मैक्रोफेज की संख्या का परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: मोटर न्यूरॉन्स की घाव-प्रेरित पीढ़ी लेजर और मैनुअल घाव के बीच तुलनीय है। (ए-सी) टीजी (mnx1: gfp) के ApoTome माइक्रोस्कोप से छवियां 5 डीपीएफ लार्वा EdU धुंधला के साथ, लेजर घाव (ए), मैनुअल घाव (बी), और अनलेशन (सी) स्थितियों में। एरोहेड्स दोनों मार्करों के लिए डबल-लेबल किए गए कोशिकाओं को दर्शाते हैं। स्केल बार = 100 μm. (A'-C') सफेद बक्से द्वारा निरूपित डबल-लेबल वाली कोशिकाओं का उच्च आवर्धन। (d) प्रत्येक लार्वा में सहस्थानीयकृत कोशिकाओं की संख्या के लिए सेल की गणना का परिमाणीकरण। चोट स्थल के दोनों ओर 50 μm खिड़कियों को रखा गया था, और सभी Z-स्टैक छवियों में colocalized कोशिकाओं की गणना की गई थी। एक तरफ़ा एनोवा Tukey के posthoc test27 के साथ किया गया था। लेजर और मैनुअल घावों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है (पी = 0.909)। लेजर घाव (2.4 गुना परिवर्तन, पी = 0.011) और मैनुअल घाव (2.3 गुना परिवर्तन, पी = 0.018) की तुलना में अनलिज़न किए गए नियंत्रणों में काफी कम mnx1: gfp + / EdU + कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: लेजर घाव मैनुअल घाव की तुलना में कम मांसपेशियों और त्वचा की क्षति को प्रेरित करता है। (A-B) TG (बीटा-एक्टिन: utrophin-mCherry) 3 dpf लार्वा unlesioned, मैनुअल घाव और लेजर घाव की स्थिति में एकल Z-स्टैक छवियों, 20x आवर्धन पर confocal माइक्रोस्कोप पर लिया. सफेद तीर चोट स्थल को दर्शाते हैं। स्केल बार = 50 μm. (A) Z-स्टैक को दर्शाता है जहां रीढ़ की हड्डी और notochord दिखाई देते हैं। एससी रीढ़ की हड्डी को लेबल करता है, और नेकां नोटोकॉर्ड को लेबल करता है। (बी) जेड-स्टैक को दर्शाता है जहां मांसपेशियों के फाइबर दिखाई देते हैं। (सी) छवियों को 3 डीपीएफ लार्वा के स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर अनलेशन, मैनुअल घाव और लेजर घाव की स्थिति में लिया गया था। लार्वा को टंगस्टन वायर पिन (लेजर घाव छवि में दिखाई देने वाले) का उपयोग करके एक मंच पर पिन किया गया था। ब्लैक बॉक्स घाव स्थल को दर्शाता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक फ़ाइल 1: प्रोटोकॉल का प्रयोगात्मक विवरण। ट्रांसजेनिक ज़ेबराफ़िश लाइनों की पीढ़ी, मैनुअल रीढ़ की हड्डी की चोटों, एसिटाइलेटेड-ट्यूबुलिन इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्री, एचबी 9 / ईडीयू स्टेनिंग, इमेजिंग, और छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण का वर्णन किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

ज़ेब्राफ़िश में पुनर्जनन के दौरान खेलने की प्रक्रियाओं की गहरी समझ की तत्काल आवश्यकता है। यह पशु मॉडल बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए कई लाभ प्रदान करता है, विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी की चोटों के लिए 1। अधिकांश अध्ययनों में मैनुअल घाव शामिल हैं जिन्हें एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित ऑपरेटर की आवश्यकता होती है और बहु-ऊतक क्षति को प्रेरित करता है। यहां एक लेजर घाव प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जिससे घाव की विशेषताओं पर नियंत्रण और आसपास के ऊतकों को कम नुकसान होता है। इसके अलावा, यह तकनीक अपेक्षाकृत अप्रशिक्षित प्रयोगकर्ताओं द्वारा सफलतापूर्वक उपयोग करने के लिए काफी आसान है।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम लेजर के अंशांकन और आरओआई की परिभाषा हैं। व्यवहार में, अंशांकन बहुत स्थिर है (यहां तक कि महीनों के लिए भी), और एक बार आरओआई का सही आकार और स्थिति निर्धारित होने के बाद, इस तकनीक का उपयोग सीधा है। यद्यपि प्रोटोकॉल ने वर्णन किया है कि विशिष्ट उपकरणों पर घावों को कैसे किया जाए, लेजर घावों के अधिकांश लाभ विभिन्न प्रणालियों के लिए उपलब्ध हैं, जैसे कि कताई-डिस्क माइक्रोस्कोप।

इस प्रोटोकॉल की मुख्य सीमाएं रीढ़ की हड्डी के प्रतिदीप्ति रिपोर्टर का उपयोग करने की आवश्यकता और घावों को करने के लिए आवश्यक समय (~ 5 मिनट / मछली) हैं। उत्तरार्द्ध को कम जानवरों की आवश्यकता वाले उच्च पुनरुत्पादन द्वारा मुआवजा दिया जाता है। हालांकि, मैनुअल घाव अभी भी दवा परीक्षण जैसे अनुप्रयोगों के लिए व्यवहार्य हैं, जहां कई घाववाले जानवरों की आवश्यकता होती है। जैसा कि यहां दिखाया गया है, घाव-प्रेरित न्यूरोजेनेसिस की सीमा लेजर और मैनुअल घावों के बीच तुलनीय है।

हालांकि, लेजर चोट में भारी संभावित अनुप्रयोग हैं, उनमें से कुछ अद्वितीय लाभों की पेशकश से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, एक घूर्णन केशिका एक नियंत्रित तरीके से पदों की एक बड़ी विविधता में घावों का प्रदर्शन करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, इसका उपयोग मॉथनर कोशिकाओं में एकल न्यूरॉन एक्सोटॉमी को प्रेरित करने के लिए किया जा सकता है (डेटा नहीं दिखाया गया है), जैसा कि भट्ट एट अल.15 के काम में भी प्रदर्शित किया गया है। यह मैनुअल घावों का उपयोग करके संभव नहीं होगा।

परिणाम यह भी दर्शाते हैं कि क्षति मुख्य रूप से रीढ़ की हड्डी को निहित है, आसपास के ऊतकों को कम से कम नुकसान के साथ। इसका मतलब यह हो सकता है कि लेजर घाव के बाद देखी जाने वाली सेलुलर प्रतिक्रियाओं को अन्य क्षतिग्रस्त ऊतकों से सिग्नलिंग के बजाय विशेष रूप से रीढ़ की हड्डी के लिए जिम्मेदार ठहराया जाने की अधिक संभावना है। इसका मतलब यह भी हो सकता है कि लेजर घाव वाले लार्वा प्रयोगों के लिए आगे की तैयारियों का सामना करने में अधिक सक्षम हैं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए विच्छेदन में संदंश 28,29,30 का उपयोग करके ट्रंक त्वचा को हटाना शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप पहले से ही नाजुक चोट साइट पर उच्च यांत्रिक दबाव डाला जाएगा और किसी भी चेताक्षीय कनेक्शन को फिर से तोड़ने का जोखिम होगा। लेजर-घाव वाले लार्वा में देखी गई त्वचा और मांसपेशियों के ऊतकों की अखंडता घाव साइट को आगे की क्षति से बचा सकती है और परिणामस्वरूप प्राप्त पुनर्जनन के स्तर का अधिक सटीक प्रतिनिधित्व हो सकता है।

इसके अलावा, लेजर चोट के बाद क्षति का बेहतर स्थानीयकरण विभिन्न पुनर्जनन प्रक्रियाओं के बीच युग्मन के विस्तार को सीमित करता है, जो मैनुअल घावों का उपयोग करते समय अधिक सूक्ष्म प्रक्रियाओं को मुखौटा कर सकता है। यहां वर्णित लार्वा ज़ेब्राफ़िश में प्रयोगात्मक चोट के लिए दृष्टिकोण मात्रात्मक जीव विज्ञान, जैविक भौतिकी और कम्प्यूटेशनल जीव विज्ञान के संदर्भ में नई जांच की एक श्रृंखला खोल सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को BBSRC (BB/S0001778/1) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआर राजकुमारी रॉयल TENOVUS स्कॉटलैंड चिकित्सा अनुसंधान छात्रवृत्ति कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है। हम डेविड ग्रीनाल्ड (सीआरएच, एडिनबर्ग विश्वविद्यालय) और कैटी रीड (सीडीबीएस, एडिनबर्ग विश्वविद्यालय) को ट्रांसजेनिक मछली के उपहार के लिए धन्यवाद देते हैं (पूरक फ़ाइल देखें)। हम डैनियल सूंग (सीआरएच, एडिनबर्ग विश्वविद्यालय) को 3i कताई-डिस्क कॉन्फोकल तक पहुंच के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Software
Microscope software Zen Blue 2.0 Carl Zeiss
ImageJ/FIJI Open-Source
Visual Studio Code Microsoft
Microscope and accessories
ApoTome microscope Carl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens Carl Zeiss
dual AxioCam 506 m CCD cameras Carl Zeiss
Laser scanning confocal microscope LSM880 Carl Zeiss
Spinning-disk module CSU-X1 Yokogawa
Upright microscopeAxio Examiner D1 Carl Zeiss
UV laser Micropoint
VAST BioImager Union Biometrica
Labware
90 mm Petri dish Thermo-Fisher 101R20
96-well plate Corning 3841
Chemicals
Click-It EdU Imaging Kit Invitrogen C10637
aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222) Sigma-Aldrich A5040
phenylthiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629
Antibodies
Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488 Jackson 703-545-155
Donkey anti-mouse Cy3 Jackson 715-165-150
Mouse anti-GFP Abcam AB13970
Mouse anti-tubulin acetylated antibody Sigma T6793
Transgenic zebrafish lines
Tg(beta-actin:utrophin-mCherry) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh
Tg(mnx1:gfp) N/A First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed) N/A First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP) N/A Established by Katy Reid, University of Edinburgh
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) N/A Established by David Greenhald, University of Edinburgh

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References

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260 (2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

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चिकित्सा अंक 177

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Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 04/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

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Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Zebrafish लार्वा में रीढ़ की हड्डी के उत्थान का अध्ययन करने के लिए नियंत्रित अर्ध-स्वचालित लेजर-प्रेरित चोटें
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El-Daher, F., Early, J. J.,… More

El-Daher, F., Early, J. J., Richmond, C. E., Jamieson, R., Becker, T., Becker, C. G. Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (177), e63259, doi:10.3791/63259 (2021).

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