Die optogenetische Kontrolle des mikrobiellen Stoffwechsels bietet eine flexible dynamische Kontrolle über Fermentationsprozesse. Das Protokoll zeigt hier, wie man blaulichtregulierte Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion auf verschiedenen volumetrischen Skalen aufbaut.
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Methodenartikel
Lichtgesteuerte Fermentationen für die mikrobielle Chemikalien- und Proteinproduktion
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikrobielle Zellfabriken bieten eine nachhaltige Alternative zur Herstellung von Chemikalien und rekombinanten Proteinen aus nachwachsenden Rohstoffen. Die Überlastung eines Mikroorganismus mit genetischen Veränderungen kann jedoch die Fitness und Produktivität des Wirts verringern. Dieses Problem kann durch dynamische Kontrolle überwunden werden: induzierbare Expression von Enzymen und Signalwegen, typischerweise unter Verwendung von chemischen oder nährstoffbasierten Zusätzen, um das Zellwachstum und die Zellproduktion auszugleichen. Die Optogenetik bietet eine nicht-invasive, hochgradig abstimmbare und reversible Methode zur dynamischen Regulierung der Genexpression. Hier beschreiben wir, wie man lichtgesteuerte Fermentationen von technisch hergestellten Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae zur Herstellung von Chemikalien oder rekombinanten Proteinen aufbaut. Wir diskutieren, wie Licht zu ausgewählten Zeiten und Dosierungen angewendet werden kann, um mikrobielles Wachstum und Produktion für eine verbesserte Fermentationskontrolle und Produktivität zu entkoppeln, sowie die wichtigsten Optimierungsüberlegungen für beste Ergebnisse. Darüber hinaus beschreiben wir, wie Lichtsteuerungen für Bioreaktorexperimente im Labormaßstab implementiert werden können. Diese Protokolle erleichtern die Einführung optogenetischer Kontrollen in technisch hergestellten Mikroorganismen zur Verbesserung der Fermentationsleistung.
Einleitung
Die Optogenetik, die Steuerung biologischer Prozesse mit lichtempfindlichen Proteinen, bietet eine neue Strategie zur dynamischen Steuerung mikrobieller Fermentationen für die chemische und Proteinproduktion1,2. Die Belastung durch technische Stoffwechselwege und die Toxizität einiger Zwischenprodukte und Produkte beeinträchtigen häufig das Zellwachstum3. Solche Belastungen können zu einer schlechten Biomasseakkumulation und einer verminderten Produktivität führen3. Dieser Herausforderung kann begegnet werden, indem die Fermentationen zeitlich in eine Wachstums- ....
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Protokoll
1. Lichtgesteuerte chemische Produktion mit dem S. cerevisiae OptoINVRT7 Schaltkreis
- Dehnungsbau
- Erhalten Sie einen Stamm mit his3-Auxotrophie, da dieser Marker für die meisten vorhandenen OptoINVRT-Plasmide5 erforderlich ist. Wenn Sie eine optogenetische Regulation eines Gens anstreben, das in S. cerevisiae beheimatet ist, konstruieren Sie einen Stamm, bei dem jede endogene Kopie des Gens gelöscht wird.
- Linearisieren Sie das Plasmid, das die OptoINVRT7-Schaltung enthält, wie z. B. EZ-L4395, und integrieren Sie es mit Standard-Lithiumacetat-Transformationsmethoden in den....
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Ergebnisse
Die optogenetische Regulation des mikrobiellen Stoffwechsels wurde erfolgreich zur Herstellung einer Vielzahl von Produkten implementiert, darunter Biokraftstoffe, Massenchemikalien, Proteine und Naturstoffe5,6,7,12,13. Die meisten dieser Prozesse sind so konzipiert, dass das Zellwachstum im Licht stattfindet (wenn eine niedrige Zelldichte minimale Herausforde.......
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Diskussion
Dynamische Kontrolle wird seit langem angewendet, um die Ausbeute für metabolisches Engineering und rekombinante Proteinproduktion zu verbessern4. Verschiebungen in der enzymatischen Expression werden am häufigsten mit chemischen Induktoren wie IPTG21, Galactose22 und Tetracyclin23 durchgeführt, aber auch unter Verwendung von Prozessbedingungen wie Temperatur und pH-Wert vermittelt. Die optogenetische Kontrolle der Genexpressi.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben mehrere Patente für die in diesem Artikel beschriebenen optogenetischen Schaltkreise und Verfahren angemeldet.
Danksagungen
Diese Forschung wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research Award Number DE-SC0019363, dem NSF CAREER Award CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts und dem Camille Dreyfus Teacher-Scholar Award unterstützt.
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Materialien
BP97235
strong>Light-kontrollierte Proteinproduktion mit
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| lichtgesteuerte chemische Produktion mit S. cerevisiae | |||
| 24-Well-Kulturplatte | USA Scientific | CC7672-7524 | |
| Agar-Pulver | Thermo Fisher Scientific | 303991049 | |
| Aluminiumfolie | Reynolds | B004NG90YO | |
| BioSpektrometer mit μ Küvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Blau LED Panel | HQRP | 884667106091218 | |
| EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid | N/A | N/A | Siehe Referenz 1 |
| Glukose | Thermo Fisher Scientific | 501879892 (G8270-5KG) | |
| Mikrozentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | USA Scientific | 1615-5510 | |
| Orbitalschüttler | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Petrischale | Celltreat | 229656 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560L | |
| Quantenmeter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| Replica-Beschichtungsgerät | Thomas Scientific | F37848-0000 | |
| Replica-Beschichtungspads | Sunrise Science Products | 3005-012 | |
| SC-His-Pulver | Sunrise Science Products | 1303-030 | |
| SC Komplettes Pulver | Sunrise Science Products | 1459-100 | |
| Sterile Siegelfolie | Excel Scientific | STR-SEAL-PLT | |
| YPD-Agarplatten | VWR | 100217-054 | |
| Zeocin | Thermo Fisher Scientific | R25005< | |
| E. coli | |||
| 6X SDS Sample Buffer | Cepham Life Sciences | 10502 | |
| 12 % Acrylamid Proteingele | Thermo Fisher | Scientific NP0341BOX | |
| 24-Well-Kulturplatte | USA Scientific | CC7672-7524 | |
| Aluminiumfolie | Reynolds | B004NG90YO | |
| BioSpektrometer mit μ Küvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Blau LED-Panel | HQRP | 884667106091218 | |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 | Thermo Fisher Scientific | 20279 | |
| Elektrophoresezelle | Bio-Rad | 1658004 | |
| Elektrophorese-Netzteil | Bio-Rad | 1645050 | |
| LB Bouillon (Miller) | Fisher Scientific | ||
| Mikrozentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | USA Scientific | 1615-5510 | |
| NaCl | Thomas Scientific | SX0425-1 | |
| OptoLAC Plasmide | N/A | N/A | Siehe Referenz 2 |
| Orbitalschüttler | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Petrischale | Celltreat | 229656 | |
| Quantum meter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| SOC Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5382000015 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP1521 | |
| Dreiphasige Fermentation mit S. cerevisiae | |||
| Gleiche Materialien wie das Protokoll "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" sowie die folgenden: | |||
| EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid | N/A | N/A | Siehe Referenz 10 |
| Chemische Herstellung in einem lichtgesteuerten Bioreaktor | |||
| Aluminiumfolie | Reynolds | B004NG90YO | |
| Antifoam | Sigma-Aldrich | A8311 | |
| Bioreaktor mit Kontrollstation | Eppendorf | B120110001 | |
| BioSpektrometer mit μ Küvette | Eppendorf | 6135000923 | |
| Bleach | VWR Scientific | 89501-620 (CS) | |
| Blaue LED-Platte | HQRP | 884667106091218 | |
| BPT Schlauch | Fisher Scientific | 14-170-15 | |
| Glukose | Thermo Fisher Scientific | 501879892 (G8270-5KG) | |
| Salzsäure (HCl) | Fisher Scientific | 7647-01-0 | |
| M9 Minimale Salze | Thermo Fisher Scientific | A1374401 | |
| Mikrozentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002403 | |
| Mikrozentrifugenröhrchen | USA Scientific | 1615-5510 | |
| NH4OH Lösung | Sigma-Aldrich | I0503-1VL | |
| Orbitalschüttler | Yamato Scientific America | SOU-300 | |
| Quantenmeter | Apogee Instruments | MQ-510 | |
| SC Komplettes Pulver | Sunrise Science Products | 1459-100 |
Referenzen
- Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
- Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengi....
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Nachdrucke und Genehmigungen
