Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

שליטה אופטוגנטית בחילוף החומרים המיקרוביאלי מציעה שליטה דינמית גמישה על תהליכי תסיסה. הפרוטוקול כאן מראה כיצד להגדיר תסיסה מווסתת אור כחול לייצור כימי וחלבון בקנה מידה נפחי שונה.

Abstract

מפעלי תאים מיקרוביאליים מציעים חלופה בת קיימא לייצור כימיקלים וחלבונים רקומביננטיים ממזון מתחדש. עם זאת, עומס יתר על מיקרואורגניזם עם שינויים גנטיים יכול להפחית את הכושר והפרודוקטיביות של המארח. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות שליטה דינמית: ביטוי בלתי ניתן לערעור של אנזימים ומסלולים, בדרך כלל באמצעות תוספים כימיים או מבוססי חומרים מזינים, כדי לאזן את הצמיחה והייצור של התאים. אופטוגנטיקה מציעה שיטה לא פולשנית, מאוד טונה והפכה של ויסות דינמי של ביטוי גנים. כאן, אנו מתארים כיצד להגדיר תסיסה מבוקרת אור של קולי Escherichia מהונדס ו Saccharomyces cerevisiae לייצור כימיקלים או חלבונים רקומביננטיים. אנו דנים כיצד ליישם אור בזמנים ובמינונים נבחרים כדי לנתק את הצמיחה והייצור של מיקרוביאלית לשליטה משופרת בתסיסה ופרודוקטיביות, כמו גם את שיקולי האופטימיזציה העיקריים לקבלת התוצאות הטובות ביותר. בנוסף, אנו מתארים כיצד ליישם בקרות אור לניסויים ביו-ריאקטור בקנה מידה מעבדה. פרוטוקולים אלה מקלים על אימוץ בקרות אופטוגנטיות במיקרואורגניזמים מהונדסים לביצועי תסיסה משופרים.

Introduction

אופטוגנטיקה, השליטה בתהליכים ביולוגיים עם חלבונים מגיבים לאור, מציעה אסטרטגיה חדשה לשליטה דינמית בתסיסות מיקרוביות לייצור כימי וחלבון 1,2. הנטל של מסלולים מטבוליים מהונדסים ואת הרעילות של כמה מתווכים ומוצרים לעתים קרובות פוגע צמיחת התא3. לחצים כאלה יכולים להוביל הצטברות ביומסה לקויה ופרודוקטיביות מופחתת3. אתגר זה ניתן לטפל על ידי חלוקה זמנית תסיסה לשלב צמיחה וייצור, אשר מקדישים משאבים מטבוליים הצטברות ביומסה או סינתזת מוצר בהתאמה4. לאחרונה הראינו כי המעבר מצמיחה לייצור בתסיסה דו-שלבית זו יכול להיות מושרה עם שינויים בתנאי תאורה5,6,7. הטונה הגבוהה, הפיכות והאורתוגונליות של תשומות אור8 מציעות יתרונות ייחודיים לתסיסות מבוקרות אור שקשה או בלתי אפשרי לשכפל עם ממריצים כימיים המשמשים לשליטה דינמית בתסיסות דו-פאזיות קונבנציונליות4,9,10,111.

חלבון EL222 מגיב אור כחול נגזר ליטורליס אריתרובקטריה שימש לפיתוח מספר מעגלים אופטוגנטיים להנדסה מטבולית ב Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 מכיל תחום חיישן מתח אור-חמצן (LOV) שעובר שינוי קונפורמציה עם הפעלת אור כחול (465 ננומטר), המאפשר לו להיקשר לרצף הדנ"א ההכרה שלו (C120)13. היתוך EL222 לתחום ההפעלה הנגיפי VP16 (VP16-EL222) מביא לגורם שעתוק מגיב לאור כחול שיכול להפעיל באופן הפיך ביטוי גנים ב- S. cerevisiae7 ובאורגניזמים אחרים14 מהמקדם הסינתטי PC120. מספר מעגלים המבוססים על EL222 פותחו ושימשו לייצור כימי ב- S. cerevisiae, כגון מערכת OptoEXP הבסיסית המופעלת באמצעות אור7, שבה גן העניין בא לידי ביטוי ישירות מ- PC120 (איור 1A). עם זאת, החששות מפני חדירת אור בצפיפות התאים הגבוהה שבדרך כלל נתקלים בהם בשלב הייצור של התסיסות, הניעה אותנו לפתח מעגלים הפוכים המושרים בחושך, כגון מעגלי OptoINVRT ו- OptoQ-INVRT (איור 1B)5,7,13. מערכות אלה לרתום את הגלקטוז (GAL) או חומצה קווינית (Q) regulons מ S. cerevisiae ו N. crassa, בהתאמה, שליטה על הדיכויים המקבילים שלהם (GAL80 ו QS) עם VP16-EL222, כדי להדחיק ביטוי גנים באור ולגרום לו חזק בחושך. שילוב מעגלי OptoEXP ו-OptoINVRT מביא לשליטה דו-כיוונית בביטוי הגנים, ומאפשר תסיסה דו-שלבית שבה שלב הצמיחה מושרה באור כחול, ושלב הייצור עם חושך (איור 2A)5,7.

שימוש באור במקום בחושך כדי לגרום לביטוי גנים במהלך שלב הייצור ירחיב מאוד את היכולות של בקרות אופטוגנטיות, אך גם ידרוש התגברות על מגבלות חדירת האור של צפיפות התאים הגבוהה שבדרך כלל נתקלת בה בשלב זה של תסיסה. לשם כך, פיתחנו מעגלים, המכונים OptoAMP ו- OptoQ-AMP, המגבירים את תגובת התמלול לגירוי אור כחול. מעגלים אלה משתמשים במוטנטים פראיים או רגישים יתר על המידה של VP16-EL222 כדי לשלוט בייצור של מפעילי התמלול Gal4p או QF2 של regulons GAL או Q, בהתאמה, השגת רגישות משופרת וביטוי גנים חזק יותר עם אור 12,13 (איור 1C). מעגלי OptoAMP יכולים להשיג אינדוקציה מלאה והומוגנית של אור ב-5 L bioreactors בצפיפות אופטית (נמדדת ב-600 ננומטר; OD600) ערכים של לפחות 40 עם רק ~0.35% של תאורה (5% מינון אור רק ~ 7% של פני השטח בתפזורת). זה מדגים רמה גבוהה יותר של רגישות לעומת OptoEXP, אשר דורש קרוב 100% תאורה12. היכולת לגרום ביעילות לביטוי גנים עם אור בצפיפות תאים גבוהה פותחת הזדמנויות חדשות לשליטה דינמית בתסיסות. זה כולל תסיסה תפעולית ביותר משני שלבים זמניים, כגון תסיסה תלת-פאזית, שבה שלבי צמיחה, אינדוקציה וייצור נקבעים עם לוחות זמנים ייחודיים של אור כדי לייעל את הייצור הכימי (איור 2B)12.

Figure 1
איור 1: מעגלים אופטוגנטיים לשליטה דינמית ב-S. cerevisiae. מעגלי OptoEXP, OptoINVRT ו-OptoAMP מבוססים על מערכת VP16-EL222 הרגישה לאור. (א) במעגל OptoEXP, חשיפה לאור כחול גורמת לשינוי קונפורמציה ודימום של VP16-EL222, החושף תחום מחייב DNA ומאפשר שעתוק מ- PC120. הנתון שונה מז'או ואח' 7. (ב) מעגלי OptoINVRT רותמים את התגמולונים GAL (המוצגים) או Q כדי לגרום לביטוי בחושך. במעגלים מבוססי GAL, VP16-EL222 ו- GAL4 באים לידי ביטוי באופן מכונן, בעוד PC120 מניע ביטוי של מדכא GAL80 (במעגלים מבוססי Q, GAL4 ו- GAL80 מוחלפים על ידי QF2 ו- QS, בהתאמה, ומקדם סינתטי המכיל QUAS משמש במקום מקדם GAL). לאור זאת, Gal80p מונע הפעלה של הגן של עניין מ PGAL1. בחושך, GAL80 אינו בא לידי ביטוי ומושפל במהירות על ידי היתוך אותו לתחום degron מכונן (תחום חום קטן), המאפשר הפעלה של PGAL1 על ידי Gal4p. הנתון שונה מז'או ואח' 5. (ג) מעגלי OptoAMP משתמשים גם ב-VP16-EL222 כדי לשלוט ברגולונים GAL (מוצגים) או Q. במעגלים אלה, מדכא GAL80 (או QS) מבוטא באופן מכונן ומותך לדגרון רגיש לצילום (תחום כחול קטן) המבטיח דיכוי הדוק בחושך. PC120 וביטוי בקרת מוטציה VP16-EL222 רגיש של GAL4 (או QF2) עם אור, אשר מפעיל בעוצמה PGAL1 (או מקדם המכיל QUAS) באור. מעגלים שמקורם ב-GAL יכולים להשתמש בצורות מהונדסות של PGAL1, כגון PGAL1-M או PGAL1-S, אשר הגבירו את הפעילות, כמו גם מקדמים מסוג בר הנשלטים על ידי ה-GAL regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7). האיור שונה מ- Zhao et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: תסיסה דו-שלבית ותלת-פאזית לאורך זמן. (A) תסיסה דו-פאזית המופעלת עם מעגלים הפוכים מורכבת משלב צמיחה מונחה אור ושלב ייצור כהה. בשלב הצמיחה, ביומסה מצטברת כאשר מסלול הייצור נשאר מודחק. עם ההגעה OD600 הרצוי, תאים מועברים אל החושך כדי להתאים מטבולית לפני להיות resuspended במדיה טרייה עבור שלב הייצור. (ב) בתהליך תלת-שלבי, שלבי הצמיחה, הדגירה והייצור מוגדרים על ידי לוחות זמנים ייחודיים של אור, שעשויים להיות מורכבים מתקופה של צמיחה חשוכה, דגירה פועמת ושלב ייצור מואר לחלוטין. דמות שנוצרה עם ביורנדר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מעגלים אופטוגנטיים פותחו גם לשליטה דינמית בייצור כימי וחלבון ב- E. coli. מעגלי OptoLAC שולטים במדכא LacI החיידקי באמצעות מעגל pDawn בעל תגובת האור, המבוסס על מערכת שני הרכיבים YF1/FixJ6 (איור 3). בדומה ל- OptoINVRT5, מעגלי OptoLAC נועדו להדחיק ביטוי גנים באור ולגרום לו בחושך. רמות הביטוי באמצעות מעגלי OptoLAC יכולות להתאים או לחרוג מאלה שהושגו עם אינדוקציה סטנדרטית של איזופרופיל β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), ובכך לשמור על כוח האינדוקציה הכימית תוך מתן טונה והפכה משופרות6. לכן, מעגלי OptoLAC מאפשרים שליטה אופטוגנטית יעילה להנדסה מטבולית ב- E. coli.

Figure 3
איור 3: מעגלי OptoLAC לשליטה דינמית ב-E. coli. מעגלי OptoLAC מתאימים את מערכת ה-pDawn ואת אופרון הלק כדי להשיג הפעלה בחושך ודיכוי באור. בחושך, YF1 זרחן FixJ, אשר לאחר מכן מפעיל את מקדם PFixK2 להביע את מדכא cI . מדכא ה - cI מונע ביטוי של מדחיק lacI ממקדם ה- PR , המאפשר שעתוק של גן העניין ממקדם המכיל לאקו. לעומת זאת, אור כחול מפחית את פעילות קינאז נטו YF1, היפוך זרחן FixJ ובכך ביטוי cI , אשר מפחית את הביטוי של lacI ומונע ביטוי מהמקדם המכיל לאקו. הנתון שונה מ Lalwani et al.6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

אנו מתארים כאן את הפרוטוקולים הבסיסיים לתסיסות מבוקרות אור של S. cerevisiae ו - E. coli לייצור כימי או חלבון. עבור שמרים וחיידקים כאחד, אנו מתמקדים תחילה בתסיסות עם שלב צמיחה מונחה אור ושלב ייצור המושרה בחושך המופעל על ידי מעגלי OptoINVRT ו- OptoLAC. לאחר מכן, אנו מתארים פרוטוקול לתסיסה תלת-פאזית (צמיחה, אינדוקציה, ייצור) מבוקרת אור המופעלת על ידי מעגלי OptoAMP. יתר על כן, אנו מתארים כיצד להרחיב תסיסה מבוקרת אופטוגנטית ממיקרו-לוחות ל-bioreactors בקנה מידה של מעבדה. עם פרוטוקול זה, אנו שואפים לספק מדריך מלא וקל לשחזור לביצוע תסיסה מבוקרת אור לייצור כימי או חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ייצור כימי מבוקר אור באמצעות מעגל S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. זן בנייה
    1. להשיג זן עם auxotrophy שלו, כמו סמן זה נחוץ עבור רוב הקיים OptoINVRT plasmids5. אם מחפשים רגולציה אופטוגנטית של גן שמקורו S. cerevisiae, לבנות זן שבו כל עותק אנדוגני של הגן נמחק.
    2. הפוך את הפלסמיד המכיל את מעגל OptoINVRT7 לליניארי, כגון EZ-L4395, ושלב אותו ב-his3-locus של הזן האוקסוטרופי באמצעות שיטות טרנספורמציה סטנדרטיות של ליתיום-אצטט15. אם אתם משתמשים בפלזמיד EZ-L439, המכיל את הרכיבים להדחקת PGAL1 באור ולהפעלתו בחושך, יש ליישר את ההדורים באתר ההגבלה PmeI.
    3. בעקבות הטרנספורמציה, צנטריפוגה התאים ב 150 x g במשך 1 דקה בעדינות resuspend ב 200 μL של טרי היסטידין נושר סינתטי מלא בינוני (SC-His) מדיום.
    4. צלחת את כל נפח התא על לוחות אגר SC-שלו ודגר ב 30 °C (50 °F) במשך 2-3 ימים עד המושבות מופיעות.
    5. הכן תאים מוסמכים מזן זה באמצעות פרוטוקולי טרנספורמציה סטנדרטיים של ליתיום אצטט, ושנה אותם באמצעות פלסמיד המכיל את הגנים כדי להיות נשלטים באופן אופטוגנטי במורד הזרם של מקדם PGAL1-M או PGAL1-S5.
      הערה: שימוש בפלסמיד המשתלב באתרי δ (YARCdelta5) ובוחר עם Zeocin מאפשר שילוב יציב של מולטיסקופיה7,16,17,18.
    6. לאחר טרנספורמציה, צנטריפוגה התרבות ב 150 x גרם במשך 1 דקה בעדינות resuspend ב 200 μL של מדיום SC-נשירה טרי.
      הערה: מקדם PGAL1-M הוא גרסה סינתטית של מקדם PGAL1 עם אתרי דיכוי Mig1p נמחקו, בעוד PGAL1-S היא גרסה מהונדסת של PGAL1-M, אשר יש אתרי איגוד מפעיל Gal4p נוספים. ניתן להשתמש במקדם PGAL1 הרגיל כדי לשלוט בביטוי; עם זאת, עוצמת הביטוי תהיה נמוכה יותר מאשר היזמים המהונדסים האלה.
    7. צלחת את כל נפח התא על תמצית שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) צלחת אגר אם משתלב באתרי δ, או צלחת נשירה SC אם להפוך עם plasmid המכיל סמן בחירה. דגירה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות תחת אור כחול קבוע כדי לשמור על הגן הנשלט על ידי האופטוגנטית מודחק.
      הערה: עבור זנים מסוימים, מושבות עשויות לגדול מהר יותר כאשר דגירה בפולסים אור כחול (למשל, 1 s על / 79 s כבוי, 5 s על / 75 s כבוי, 10 s על / 70 s כבוי, וכו ') ולא בתאורה מתמדת, אשר יש לקבוע באופן ניסיוני עבור כל זן, במידת הצורך.
    8. השתמש בכל מקור אור 465 ננומטר ומניחים לוח LED ~ 40 ס"מ מעל הצלחת, כך עוצמת האור היא ~ 80-110 μmol / m2 / s. מדוד את העוצמה באמצעות מד קוונטי (ראה טבלת חומרים).
    9. אם אתם משתלבים באתרי δ, צרו העתק של הלוח על לוחות YPD המכילים מגוון ריכוזי זאוצין בין 400 מיקרוגרם/מ"ל ל-1,200 מיקרוגרם/מ"ל כדי לבחור עבור מגוון מספרי העתק שילוב5,7,12,16,16,17,18. לדגור על לוחות העתק ב 30 °C (50 °F) תחת אור כחול קבוע או פעמו במשך 2-3 ימים עד המושבות מופיעות.
  2. סינון ראשוני למושבות הטובות ביותר
    1. בחר שמונה מושבות מכל צלחת ולהשתמש בהם כדי לחסן 1 מ"ל של SC-המדיום שלו בתוספת 2% גלוקוז בארות בודדות של צלחת 24-well. לגדול בלוחות 24-well מתחת לתאים בן לילה (16-20 שעות) ב 30 °C (30 °F עם 200 סל"ד (קוטר מסלולית 19 מ"מ) רועד תחת תאורת אור כחול מתמדת.
    2. למחרת בבוקר, לדלל כל תרבית ב 1 מ"ל של SC-שלו טרי בינוני עם 2% גלוקוז כדי OD600 ערכים הנעים בין 0.01-0.3 ולגדול בלוחות 24-well תחת אור קבוע או פעמו ב 30 °C עם 200 °C עם 200 סל"ד רועד עד שהם מגיעים צפיפות תאים בין 2 ו 9 ערכי OD600 (איור 4A). משך הזמן הדרוש לשלב צמיחה זה יהיה תלוי במתח.
    3. לדגור על הצלחות בחושך במשך 4 שעות ב 30 °C (30 °F) עם 200 סל"ד רועד על ידי כיבוי לוח האור ועוטף את הצלחות בנייר אלומיניום.
      הערה: שלב זה מאפשר לתאים לעבור באופן מטבולי לשלב הייצור לפני חידוש ההפקה במדיית הייצור.
    4. כדי להתחיל את שלב הייצור, צנטריפוגה תרביות בצלחת 24-well ב 234 x g במשך 5 דקות מחדש תאים resuspend תאים ב 1 מ"ל של מדיום SC-נשירה טרי עם 2% גלוקוז. לאטום את הצלחות כדי למנוע אידוי של המוצר הרצוי באמצעות סרט איטום מיקרופלסטי סטרילי.
    5. תסיסה את הלוחות האטומים בחושך במשך 48 שעות ב 30 °C (50 °F) עם רועד ב 200 סל"ד. ודא כי הלוחות עטופים בנייר אלומיניום כדי למנוע כל חשיפה לאור.
      הערה: עטיפת הלוחות בנייר כסף אינה מגבילה את זמינות החמצן או הגז בתסיסות; עם זאת, סרט האיטום הסטרילי מגביל את העברת הגז. חורים קטנים ניתן לתקוע בקלטת כדי להציג חמצן, במידת הצורך.
  3. קציר וניתוח
    1. כדי לקצור את התסיסות, צנטריפוגה את הצלחות במשך 5 דקות ב 234 x g ולהעביר 800 μL של supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    2. בהתאם לכימיקל העניין, נתח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC), ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה (GC-MS), או שיטה אנליטית אחרת באמצעות טכניקת הכנת הדגימה המתאימה ביותר למכשיר המשמש.

2. ייצור חלבון מבוקר אור באמצעות מערכת E. coli OptoLAC

  1. זן בנייה
    1. BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 עם פלסמיד המכיל את מעגל OptoLAC1B או OptoLAC2B6 ופלזמיד המבטא את החלבון המרקב של עניין ממקדם PT719.
    2. לאחר שינוי צורה, לשחזר את התאים עבור 1 h ב 1 מ"ל של מרק אופטימלי סופר עם דיכוי קטבוליט (SOC; 2% טריפטון, 0.5% תמצית שמרים, 10 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl2, 10 מ"מ MgSO4, 20 מ"מ גלוקוז) ב 37 °C (37 °F עם סיבוב או רעד.
      הערה: הפלסמיד המכיל את חלבון העניין חייב להיות תואם לפלסמיד OptoLAC (כלומר, סמן התנגדות שונה ומקורו של שכפול) ואסור לו להכיל עותק של lacI.
    3. צנטריפוגה התאים ב 4845 x g במשך 3 דקות ולרכז את הכדור ב 200 μL של מרק ליסוגניות (LB) מדיה. צלחת כל התאים המרוכזים על צלחת אגר LB עם אנטיביוטיקה מתאימה ולגדול ב 37 °C (50 °F) לילה תחת אור כחול מתמיד כדי לשמור על ביטוי חלבון מודחק.
  2. סינון ראשוני לאימות ביטוי
    1. קח שלוש מושבות בודדות ולהשתמש בהם כדי לחסן 1 מ"ל של מדיה LB עם אנטיביוטיקה מתאימה בארות בודדות של צלחת 24-well. הגדל במהלך הלילה (16-20 שעות) ב-37 °C עם 200 סל"ד רועד תחת תאורת אור כחול קבועה (איור 4A).
    2. למחרת, השתמש 1.5 μL של תרבות למדוד OD600 בספקטרופוטומטר עם מדידת מיקרו-וולום. לדלל תרבויות לתוך 1 מ"ל של LB טרי בצלחות 24-well כדי OD600 ערכים הנעים בין 0.01-0.1.
    3. לגדל את התרביות ב 37 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רועד תחת אור כחול במשך 2-3 שעות. החל מהשעה השנייה, קח מדידות OD600 כל 15 דקות כדי להבטיח כי התרבויות לא להגדיל את טווח OD600 של 0.1-1.5.
    4. ברגע שהתרבות נמצאות ב OD600 הרצוי, לכבות את לוח האור ולעטוף את הצלחת בנייר אלומיניום כדי ליזום את שלב הייצור. שמור את הצלחת בחושך במשך 8 שעות (37 °C ), 20 שעות (30 °C (30 °F) או 48 שעות (18 °C (18 °F), עם 200 סל"ד רועד.
    5. מדוד ורשום את הערך הסופי של OD600 של כל תרבות.
  3. קציר וניתוח
    1. העבר 800 μL של כל תרבות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 17,000 x גרם.
    2. Resuspend גלולה התא ב 200 μL של מאגר resuspension (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM).
      הערה: ניתן להתאים את הריכוז של NaCl בהתבסס על חלבון רקומביננטי המנותח.
    3. הוסף 50 μL של 6x נתרן דודציל סולפט (SDS) מאגר מדגם (טריס 375 מ"מ, pH 6.8, SDS 9%, גליצרול 50%, ברומופנול כחול 0.03%, DTT 9%). דגירה בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם רעידות ב-700 סל"ד בתרמומיקסר.
    4. טען ~ 3-20 μL של התרבות בג'ל 12% SDS-PAGE. באמצעות מדידת OD600 הסופית כמדריך, לטעון בערך את אותה כמות חלבון עבור כל מדגם (שווה ערך ל 10 μL של המדגם המתאים לערך OD600 הסופי של 1). השתמש באספקת חשמל כדי להפעיל אלקטרופורזה ב 100 V עד הג'ל נפתר במלואו.
    5. מכתימים את הג'ל בתמיסת G-250 כחולה מבריקה של Coomassie על ידי חימום של 30-40 שניות במיקרוגל, ולאחר מכן דגירה על סיבוב פלטפורמה למשך 15 דקות לפחות.
    6. יש לשטוף במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים ולהסיר על משטח סיבוב למשך 30 דקות לפחות (או לילה), תוך הוספת שני מגבוני ניקוי הקשורים לקשר כדי לסייע בספיגת הכתם. מרתיחים את הג'ל בכמות מספקת של מים במיקרוגל במשך 15 דקות כדי להאיץ את תהליך destaining.

3. תסיסה תלת-פאזית באמצעות מערכת S. cerevisiae OptoAMP

  1. זן בנייה
    1. להשיג זן עם סמן אוקסוטרופי his3 , כמו סמן זה נחוץ על מנת להשתמש ב Plasmids OptoAMP הקיים5. אם מחפשים רגולציה אופטוגנטית של גן שמקורו ב- S. cerevisiae, בנו זן שבו העותק האנדוגני של גן זה נמחק.
    2. ליניאריות פלסמיד המכיל את מעגל OptoAMP4, כגון EZ-L58012, ולשלב אותו בלוקוס his3 של הזן האוקסוטרופי באמצעות שיטות טרנספורמציה ליתיום-אצטט סטנדרטיות15. אם אתה משתמש ב-EZ-L580, הפוך את הפלסמיד לליניארי באתר ההגבלות PmeI.
    3. בעקבות הטרנספורמציה, צנטריפוגה התאים ב 150 x g במשך 1 דקה בעדינות resuspend ב 200 μL של טרי SC-שלו מדיום.
    4. צלחת את כל נפח התא על מדיה סלקטיבית (SC-His-אגר) ודגור ב 30 °C (50 °F) במשך 2-3 ימים עד המושבות מופיעות.
    5. הכן תאים מוסמכים מזן זה ולהפוך אותם עם פלסמיד המכיל את הגנים(ים) להיות נשלט אופטוגנטי במורד הזרם של PGAL1-S promoter12.
      הערה: שימוש בפלסמיד המשתלב באתרי δ ובוחר עם Zeocin מאפשר שילוב ובחירה יציבים של מולטי-העתקה.
    6. לאחר שינוי צורה, צנטריפוגה התרבות ב 150 x גרם במשך 1 דקה בעדינות resuspend ב 200 μL של מדיום SC-נשירה טרי.
      הערה: מקדם PGAL1-S הוא גרסה סינתטית של מקדם PGAL1 שבו אתרי הדיכוי Mig1p נמחקים ואתרי איגוד מפעילי Gal4p נוספים מתווספים. ניתן להשתמש במקדם PGAL1 הרגיל; עם זאת, עוצמת הביטוי תהיה נמוכה יותר מאשר מקדם מהונדס זה.
    7. צלחת את כל נפח התא על צלחת אגר נשירה YPD או SC-נשירה ודגור ב 30 °C (30 °C (16 °F במשך 16 שעות בחושך (עטוף בנייר אלומיניום). הדגירה בחושך שומרת על הגן הנשלט על ידי האופטוגנטית מודחק, מה שמאפשר לתאים לכוון את המשאבים המטבוליים שלהם לצמיחת תאים ולא לייצור כימי.
    8. אם אתם משתלבים באתרי δ, העתק לוחיות משוכפלות ללוחות YPD המכילים מגוון ריכוזי Zeocin כדי לבחור עבור מגוון מספרי העתקה של אינטגרציה. לדגור על הלוחות ב 30 °C ((עטוף בנייר אלומיניום) במשך 2-3 ימים עד המושבות מופיעות.
  2. סינון ראשוני למושבות הטובות ביותר
    1. בחר שמונה מושבות מכל צלחת ולהשתמש בהם כדי לחסן 1 מ"ל של SC-המדיום שלו עם 2% גלוקוז בארות בודדות של צלחת 24-well. לגדל את התאים בן לילה (16-20 שעות) בחושך ב 30 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רועד.
    2. למחרת בבוקר, לדלל כל תרבות ב 1 מ"ל של טרי SC-המדיום שלו עם 2% גלוקוז ל 0.1 OD600 ולגדול בחושך ב 30 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רועד עד שהם מגיעים OD600 של 3. עוטפים את הלוחות בנייר אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. משך הזמן הדרוש לשלב צמיחה זה יהיה תלוי במתח.
    3. כדי להתחיל את שלב האינדוקציה, לדגור על הלוחות תחת אור פעמו (לדוגמה, 5 s on/95 s כבוי) במשך 12 שעות ב 30 °C (30 °F) עם 200 סל"ד רועד. השתמשו בכל מקור אור של 465 ננומטר והניחו לוח LED מעל הצלחת כך שעוצמת האור היא כ-80-110 מיקרומול/מ"ר/ש' לקבלת תוצאות מיטביות (איור 4A).
      הערה: משך פעימת האור האופטימלי עבור דגירה זו ישתנה בהתאם לכימיקל המיוצר. מומלץ לסנן מגוון לוחות זמנים קלים מ-0.1% (למשל, 1 שניות ב-999 שניות כבויות) ל-100% (אור מלא).
    4. כדי להתחיל את שלב הייצור, צנטריפוגה תרביות ב 234 x גרם במשך 5 דקות resuspend טרי SC-המדיום שלו עם 2% גלוקוז. לאטום את הצלחות כדי למנוע אידוי של המוצר הרצוי באמצעות סרט איטום מיקרופלסטי סטרילי.
    5. תסיסה את הלוחות האטומים באור במשך 48 שעות ב 30 °C (50 °F) עם רעד ב 200 סל"ד. מטב את לוח הזמנים של האור במהלך שלב זה מכיוון שכימיקלים מסוימים נהנים משלב ייצור פועם ולא מאור מלא.
  3. קציר וניתוח
    1. לקצור את התסיסות על ידי צנטריפוגה הצלחות במשך 5 דקות ב 234 x גרם והעברת 800 μL של supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל.
    2. בהתאם לכימיקל העניין, נתח באמצעות HPLC, GC-MS או שיטה אנליטית אחרת באמצעות טכניקת הכנת הדגימה המתאימה ביותר למכשיר בו נעשה שימוש.

4. ייצור כימי (mevalonate) מ- E. coli בביוריאקטור מבוקר אור

  1. התקנה ראשונית של חיסון וביוריאקטור ביולוגי
    1. לחסן מושבה של זן E. coli מהונדס עם ייצור כימי מבוקר אור לתוך 5 מ"ל של מלחים מינימליים M9 (3.37 mM Na2HPO4, 2.2 מ"מ KH2PO4, 0.855 mM NaCl, 0.935 מ"מ NH4Cl) בתוספת 0.2% w / v חומצות casamino, 5% w / v גלוקוז, ותערובת מתכת קורט20 (0.0084 g / L EDTA, 0.0025 g/L CoCl2, 0.015 g/L MnCl2, 0.0015 g/L CuCl2, 0.003 g/L H3BO3, 0.0025 g/L Na2MoO4, 0.008 g/L ZnCl2, 0.06 גרם/L Fe (III) ציטראט, 0.0045 גרם/ליטר תיאמין, 1.3 גרם/ליטר MgSO4) בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    2. הגדל את התרבות בן לילה ב 30 °C (50 °F) עם 200 סל"ד רועד תחת תאורת אור כחול.
    3. הגדר את צלחת הראש של כלי השיט הביו-ריאקטור, וודא שהיציאות הבאות מותקנות: הכנס לבדיקה תרמית; בדיקת חמצן מומס (DO); ספאר גז - להתחבר למקור האוויר באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר; מדחף; מעבה גז - להתחבר למסנן 0.2 מיקרומטר; קו קירור (x2); קווי הזנה (x2) - אחד לתוספת מדיה, אחד לבקרת pH; קו דגימה - להבטיח שהוא מגיע לתחתית הכלי; יציאה ריקה; בדיקת pH - כייל את הגשוש עם סטנדרטים של pH = 4 ו- pH = 7 לפני ההתקנה, או autoclave עם שאר כלי השיט או לחטא עם 95% אתנול ולהכניס אספטית לפני ההתקנה.
    4. מלאו את הכלי ב-1 ליטר מים מסוננים, חברו את צלחת הראש והידקו, וודאו שטבעת ה-O מתאימה וחותמת בנוחות.
    5. לכסות את כל הפתחים לתוך הכור עם רדיד אלומיניום.
    6. הכן שלוש רצועות של צינורות: אחד להסרת המים, אחד להחדרת ההזנה, ואחד לשליטה ב- pH. מכסים את הקצוות בנייר אלומיניום ועוטפים את כל הצינורות בנייר אלומיניום.
      הערה: NH4OH, המשמש להתאמת pH, אינו זורם בצורה חלקה בצינורות סיליקון, מה שעלול להוביל לקצבי זרימה לא מדויקים ולבסיס יתר של התרבות. כדי להימנע מבעיה זו, השתמש בצינורות משאבה תואמים ביולוגית (BPT) עבור הזנת NH4OH.
    7. יש לאוטוקולב את הביו-ריאקטור ואת הצינורות, באמצעות מחזור נוזלי של 30 דקות.
    8. הסר את החומרים מן autoclave. לאחר קריר מספיק כדי להתמודד, לחבר את המדחף, pH ו DO בדיקות, מקור אוויר, מפרצון מעובה ושקע, וכניסת קירור ושקע לתחנת הבקרה.
    9. הכנס את הגשוש התרמי וכסה את כלי השיט במעיל חימום. אבטחו את הז'קט לכיוון החלק העליון של כלי השיט כדי למנוע חסימת התרבות מחשיפה לאור.
    10. חברו את אחד הצינורות הסטריליים לקו הדגימה ואמובטחו באמצעות משאבת הדגימה. מניחים את הקצה השני כך שהוא זורם לתוך מיכל ריק שיכול להחזיק לפחות 1 L. לנקז את המים בתוך כלי השיט.
    11. חבר צינור סטרילי נוסף לאחד מקווי ההזנה ומאובטח דרך אחת ממשאבות ההזנה. חבר את הקצה השני של הצינור לבקבוק של מדיה M9. להאכיל את התקשורת לתוך הכור.
    12. חבר צינור סטרילי נוסף לאחד מקווי ההזנה ומאובטח דרך אחת ממשאבות ההזנה. חבר את הקצה השני של הצינור לבקבוק המכיל 28%-30% NH4OH.
      זהירות: NH4OH הוא מאכל. עבדו במכסה המנוע של האדים תוך כדי העברה לבקבוק הזנה וודאו שבקבוק ההזנה ממוקם בבלימה משנית.
    13. הניחו שלושה לוחות אור במבנה משולש במרחק של כ-20 ס"מ מהכור, ודאו שעוצמות האור על פני החללית מגיעות לכ-80-110 מיקרומול/מ"ר/ש' מכל צד (איור 4B).
    14. למחרת, הפעל את מערכת הביו-ריאקטור וצ'ילר. הגדר את נקודת הסט של טמפרטורת הכור ל-37 °C (6 °F), את נקודת ה-pH ל-7.0 ואת התסיסה ל-200 סל"ד. ז'קט החימום אמור להידלק.
    15. כייל את הבדיקה DO על ידי המתנה ראשונה עד מדידות הטמפרטורה ו- DO להיות קבוע (זה יהיה 100% setpoint). לאחר מכן, לנתק את הבדיקה מהמערכת (זה יהיה 0% setpoint). חזור על הפעולה עד שמדידת DO מתייצבת ב- 100% כאשר הבדיקה מחוברת ולאחר מכן הגדר את נקודת ה- DO ל- 20%.
  2. ייצור כימי מבוקר אור
    1. לחסן את הביו-ריאקטור ל OD600 ראשוני של 0.001-0.1. הפעל את לוחות האור כדי ליזום צמיחה.
    2. לאחר 3 שעות, התחל לקחת דגימות מקו הדגימה כדי לקחת מדידות OD600 כדי למנוע גידול יתר של צפיפות התא האופטימלית של אינדוקציה (ρs). לאחר ρs האופטימלי הוא הגיע (הערך האופטימלי לייצור mevalonate הוא 0.17), לכבות את לוחות האור, לכסות את הכור בנייר אלומיניום, ולעטוף את ההתקנה בבד שחור כדי ליזום את שלב הייצור הכהה.
    3. הוסף 50 μL של antifoam, 8 שעות לאחר המעבר לחושך. פתחו את הנמל הריק ופיפטה את האנטי-foam ישירות לתוך הכור.
    4. השתמש ביציאת הדגימה כדי לקחת מדי פעם דוגמאות לניתוח HPLC או GC.
  3. פירוק וניתוח
    1. לאחר סיום הניסוי, כבה את המערכת. פתחו בזהירות את בדיקות ה-DO וה-pH ושטפו אותן במים וסבון. פתחו את צלחת הראש ושטפו אותה במים וסבון בעזרת מברשת.
    2. מעבירים את התרבות למיכל ריק ומוסיפים אקונומיקה לריכוז סופי של 10% v/v. מניחים ברדס אדים ונפטרים לאחר 30 דקות.
    3. לשטוף את כלי הכור עם מים וסבון באמצעות מברשת.
    4. הכן את הדגימות לניתוח בהתבסס על תוצר העניין. לייצור mevalonate, לערבב 560 μL של תרבות עם 140 μL של 0.5 M HCl ומערבולת במהירות גבוהה במשך 1 דקות. זה ממיר mevalonate לתוך (±)-mevalonolactone.
      זהירות: HCl הוא סכנה בריאותית. טפלו ב-PPE מתאים וודאו שצינורות מדגם מכוסים כראוי לפני המערבולת.
    5. צנטריפוגה ב 17,000 x g במשך 45 דקות ב 4 °C (4 °F). העבר 250 μL של supernatant לבקבוקון HPLC.
    6. עבור mevalonate, לנתח דגימות באמצעות עמודת חילופי יון חומצות אורגניות. לכמת את הייצור באמצעות גלאי אינדקס שבירה (RID), השוואת אזורי שיא לסטנדרט של (±)-mevalonolactone.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ויסות אופטוגנטי של חילוף החומרים המיקרוביאלי יושם בהצלחה כדי לייצר מגוון רחב של מוצרים, כולל דלקים ביולוגיים, כימיקלים בתפזורת, חלבונים, ומוצרים טבעיים5,6,7,12,13. רוב התהליכים הללו נועדו לצמיחת תאים שתתרחש באור (כאשר צפיפות תאים נמוכה מציבה אתגרים מינימליים עם חדירת אור), ולייצור להיגרם על ידי חושך ברגע שהתאים גדלים. כימיקלים שונים שהופקו משמרים באמצעות גישה זו, כולל חומצה לקטית, הקדמה פולימרית בעלת ערך ותוסף מזון, כמו גם איזובוטנול, דלק ביולוגי מהדור הבא. עבור שני הכימיקלים, אתגר נפוץ נובע מהדחף החזק של S. cerevisiae לעכל גלוקוז לקראת ייצור אתנול ולא תוצר של עניין וחוסר היכולת למחוק את מסלול התסיסה אתנול מבלי לגרום פגם גדילה חמור7. שילוב של מעגלי OptoEXP המופעלים באור ומעגלי OptoINVRT מודחקים באור שימשו להפעלה סלקטיבית עם אור הגן עבור פירובט דקרבוקסילאז (PDC1) הנדרש לתסיסת אתנול, ולזירוז המסלול למוצר הרצוי בחושך5 (איור 5A,B). באמצעות אסטרטגיה זו עם צפיפות תאים ממוטבת של אינדוקציה (ρs), ניתן להשיג טיטרים גבוהים של שני הכימיקלים הרצויים (איור 5C,D), המדגישים את הערך של שליטה דו-כיוונית המוצעת על ידי אופטוגנטיקה.

בעוד שרוב התהליכים האופטוגנטיים המבוססים על שמרים התמקדו בשלב צמיחה מונחה אור ובשלב הייצור המושרה בחושך, ההתפתחות האחרונה של מעגלי OptoAMP רגישים וחזקים במיוחד פתחה הזדמנויות לתסיסות מונחות אור גם כן12. תסיסה מונחית אור אלה דומות לתהליכים שתוארו בעבר; עם זאת, לוחות הזמנים של האור הפוכים כך שהייצור מתרחש באור. יתר על כן, מעגלים אלה מאפשרים יישום של תהליכים תלת פאזיים, אשר מוסיף יותר גמישות ובקרה לייצור לעומת הגישה הדו-שלבית הסטנדרטית. בהתחשב ברגישות ובעוצמה של מעגלים אלה, תהליכים תלת-פאזיים אלה ממוטבים בדרך כלל על ידי סינון לוחות זמנים שונים של אור בכל שלב. פולסים אור אופטימליים תלויים במתח ובמוצר העניין. מעגלים כאלה הוחלו בהצלחה על ייצור נרינגנין, מוצר טבעי עם יישומים טיפוליים, בנוסף לחומצה לקטית ואיזובוטנול12 (איור 6). הייצור המוגבר של כל שלושת הכימיקלים מדגים את הערך של רגולציה אופטוגנטית על פני מגוון של מורכבויות מסלול, כמו גם את הפוטנציאל החדש המוצע על ידי תסיסה תלת פאזית.

מעבר להדגמות אלה בשמרים, אופטוגנטיקה הוחלה גם כדי לשפר את הייצור של חלבונים וכימיקלים סוס העבודה החיידקי E. coli. תסיסה עם מארח זה עקבה אחר צמיחה מונחית אור ומסגרת ייצור המושרה בחושך באמצעות חבילת OptoLAC של מעגלים6. כאשר משתמשים בו כדי לייצר חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) או גורם שעתוק FdeR, ייצור מבוקר אור דומה או עדיף על הרמות שהושגו עם אינדוקציה סטנדרטית של IPTG, אך עם יכולת טונה קלה יותר לרמות ייצור בינוניות (איור 7A). בנוסף, מעגלי OptoLAC הוחלו כדי לייצר mevalonate, מבשר טרפנואיד חשוב, הן ברמת המיקרופלסטיק והן ברמת הביו-ריאקטור (איור 7B,C). תוצאות נבחרות אלה מספקות סקירה כללית של החוזק, הרב-תכליתיות והטונה של ויסות אופטוגנטי לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים.

Figure 4
איור 4: מערך ניסיוני עבור לוחות מאירים ומכשירים ביולוגיים. (A) לוחות של 24 בארות ניתן להאיר תוך כדי טלטול על ידי הצבת לוח תאורת LED כחול כ-40 ס"מ מעל השייקר. יש למדוד את עוצמת האור עם מד קוונטי כדי להבטיח שהוא בין ~ 80-110 מיקרומול / m2 / s. (B) כדי להאיר bioreactor, למקם שלושה לוחות אור במבנה משולש סביב bioreactor. כמו בלוחות 24-well, עוצמת האור צריכה להימדד ולהתאים כדי להגיע ~ 80-110 μmol / m2 / s מכל הצדדים. דמות שנוצרה עם ביורנדר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ייצור מודחק באור של כימיקלים מ-S. cerevisiae. כדי לשפר את הייצור של חומצה לקטית (A) או isobutanol (B), שילוב של מעגלים אור כהה-inducable שימשו כדי להפעיל באופן סלקטיבי מסלולים ספציפיים. בשני התרחישים, מסלול ייצור האתנול החיוני מושרה באור על ידי שליטה בביטוי PDC1 עם OptoEXP, בעוד מסלולי הייצור מופעלים בחושך באמצעות מעגל OptoINVRT. (C) ייצור חומצה לקטית נבדק במגוון ערכי ρs עם שני מעגלים מחבילת OptoINVRT. גרסת OptoINVRT7 קיבלה את הביצועים הטובים ביותר, עם ערך ρs אופטימלי של 7.0. (D) גרסת OptoINVRT7 גם מיקסמה את ייצור האיזובוטנול בהשוואה למעגל האחר, עם ρs אופטימלי של 8.75. **p < 0.01, ***p < 0.001. נתונים סטטיסטיים נגזרים באמצעות בדיקת t דו-צדדית. הנתונים מוצגים כערכים ממוצעים וקווי שגיאה מייצגים את סטיות התקן של ארבעה עותקים משוכפלים. הנתון שונה מז'או ואח' 5. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: ייצור מופעל באור של כימיקלים בתסיסות תלת-פאזיות של S. cerevisiae. תסיסה באמצעות מעגלי OptoAMP יכולה לפעול עם שלושה שלבים דינמיים: צמיחה (i), אינדוקציה (ii) וייצור (iii), כל אחד מוגדר על ידי מחזורי חובת אור שונים. (A) ביוסינתזה של חומצה לקטית מושרה באור כחול על ידי שליטה אופטוגנטית של ביטוי LDH . (B) ניתן למטב את ייצור החומצה הלקטית באמצעות לוח זמנים של אור פעמו (1 s on/79 s off) בשלב הצמיחה ותאורה מלאה בשלבי האינדוקציה והייצור. (ג) הייצור של איזובוטנול מושרה על ידי ביטוי ILV2 שליטה אופטוגנטית. (D) ייצור Isobutanol ממוטב באמצעות שלב גדילה פעמו (1 s on/79 s כבוי), שלב אינדוקציה מואר במלואו, ו pulsed (2 s on/118 s off) שלב הייצור. (ה) שליטה על המסלול הביו-סינתטי המורכב יותר עבור נרינגנין, המושרה על ידי ביטוי שליטה אופטוגנטית של הגנים TAL ו - PAL . (F) הביוסינתזה של Naringenin ממוטבת בצורה הטובה ביותר באמצעות צמיחה פועמת (1 s on/79 s off), אינדוקציה מוארת במלואה, ושלב ייצור כהה. *p < 0.05, **p < 0.01, n.s. = אין משמעות. נתונים סטטיסטיים נגזרים באמצעות בדיקת t דו-צדדית. הנתונים מוצגים כערכים ממוצעים וקווי שגיאה מייצגים את סטיות התקן של ארבעה עותקים משוכפלים עצמאיים. הנתון שונה מז'או ואח' 12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: ייצור אופטוגנטי של חלבונים וכימיקלים רקומביננטיים ב-E. coli. מערכת OptoLAC שימשה לייצור חלבונים וכימיקלים בטיטרים הדומים, או גבוהים יותר מאלה שאליהם הגיעו באמצעות אינדוקציה כימית עם IPTG. (A) ביטוי אופטוגנטי של FdeR הוא גם חזק וגם טונה באמצעות מגוון של מחזורי חובה אור, כפי שנפתר ומכמת עם כתם מערבי. (B) זן שתוכנן לייצור mevalonate עולה על טיטרים שהושגו באמצעות אינדוקציה IPTG בקנה מידה של 24 בארות בערך ρs האופטימלי. (ג) ייצור אופטוגנטי של mevalonate בביוריאקטור 2 L מדגים את המדרגיות של הייצור מעבר למיקרו-פלטות. *p < 0.05. **p < 0.01, ***p < 0.001. נתונים סטטיסטיים נגזרים באמצעות בדיקת t דו-צדדית. כל הנתונים מוצגים כערכים ממוצעים וקווי שגיאה מייצגים את סטיות התקן של דגימות עצמאיות ביולוגית. הנתונים עבור (A) ו- (C) מייצגים שלושה עותקים משוכפלים, ואילו עבור (B), מספר המשוכפלים משמאל לימין= 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4. הנתון שונה מ Lalwani et al.6. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שליטה דינמית כבר מזמן יושם כדי לשפר את התשואות עבור הנדסה מטבולית וייצור חלבון רקומביננטי4. שינויים בביטוי אנזימטי מיושמים בדרך כלל באמצעות ממריצים כימיים כגון IPTG21, galactose22 ו tetracycline23, אך גם תווכו באמצעות תנאי תהליך כגון טמפרטורה ו- pH. שליטה אופטוגנטית בביטוי גנים מבטלת את הצורך בשינויים בפרמטרים של תסיסה או בהרכב המדיה, מה שהופך אותה לחלופה ישימה בקלות לאסטרטגיות אינדוקציה מסורתיות. הקלות שבה ניתן להדליק או לכבות אור מציעה גם יכולות חדשות כמו כוונון מהיר והפיך של מינון הגנים. יתר על כן, בעוד פרוטוקולים אלה מתמקדים במערכות מגיבות לאור כחול, קיומם של כלים אופטוגנטיים ההופכים תגובות אור קיימות24 או מגיבים לאורכי גל אחרים של אור25,26,27,27,28,29 מציע פוטנציאל מרגש לשלוט באורתוגונית במסלולים מרובים לרמת שליטה חסרת תקדים. יתרונות אלה הופכים את האור לפתרון חדש ורב-תכליתי לשליטה גמישה על תסיסה מיקרוביאלית.

מעבר להקרנה של המושבות הטובות ביותר, כפי שנדון בפרוטוקולים, יש לייעל גם פרמטרים אחרים כגון צפיפות התאים שבהם תרבויות עוברות מצמיחה לייצור (ρs), אורכי תקופות הייצור והדגרה ומחזורי החובה הקלים. הערכים הטובים ביותר של פרמטרים אלה הם תלויי מוצר ומתח ולכן יש אופטימיזציה מחדש עבור כל יישום חדש. לדוגמה, מסלולים המערבים מוצרים סופיים רעילים עשויים להפיק תועלת מערכי ρs גבוהים יותר, המאפשרים הצטברות מספקת של תאים לפני גרימת ייצור 6,7, בעוד מעגל חלש יותר אך פחות דולף עשוי להעדיף ערכים נמוכים יותר של ρs כדי למקסם את זמן הביטוי הכולל. כמו כן, מסלולים מסוימים וחלבונים רקומביננטיים עשויים להפיק תועלת מרמות ביטוי ביניים, אשר ניתן להשיג עם חובות אור ייחודיות. יתר על כן, במקרה של תסיסה המשתמשת במעגלי OptoAMP, ניתן למטב את מספר השלבים הזמניים. בעוד הפרוטוקול המודגם מתאר תהליך תלת פאזי, תסיסה באמצעות מעגלים אלה ניתן לשלוט עם מספר רב יותר של שלבים המוגדרים על ידי לוחות זמנים ומשך אור ייחודיים. לכן, מגוון של פרמטרים אלה צריך להיבדק כדי לייעל את הביצועים.

הימנעות ממקורות של זיהום אור מהווה שיקול חשוב במהלך ההתקנה הניסיונית. עבור תהליכים הדורשים עיכוב של גירוי אור עד שלבים מאוחרים יותר (למשל, תסיסה כהה לאור), עבודה בחדר חשוך עשוי להיות מומלץ כדי למנוע הפעלה מוקדמת של מערכות אופטוגנטיות. במקרים אלה, ניתן ליישם מקור אור אינרטי לנראות במהלך ההתקנה הניסיונית (לדוגמה, מקור אור אדום רחוק של ~ 700 ננומטר בעת עבודה עם מערכות המופעלות על ידי אור כחול). יתרון של תהליכים שמתחילים בצמיחה הנגרמת על ידי אור (אור לחושך) הוא שניתן לבצע מניפולציות ניסיוניות ראשוניות תחת אור הסביבה עם ראות בשפע.

הקלות שבה ניתן להחיל מספר עצום של לוחות זמנים של חובה קלה על תסיסה מציגה את ההזדמנות לפתח שיטות תפוקה גבוהה יותר כדי לאזן מסלולים biosynthetic ולהבהיר את התנאים האופטימליים למקסם את פרודוקטיביות התסיסה. במקום לאזן מסלולים מטבוליים על ידי בדיקת מספר גדול של מבנים מורכבים קומבינטוריים שיש כל אנזים לידי ביטוי על ידי מקדמים של עוצמות שונות, מסלולים יכולים להיות מאוזנים על ידי רמות ביטוי גנים משתנות באמצעות מחזורי חובת אור שונים ממספר קטן בהרבה של מבנים. זה מטשטש את הצורך במערך ניסיוני מסורבל יותר, כגון חידוש במדיית אינדוקציה שונה או דילול סדרתי עבור ממריצים כימיים. ניסויים אופטוגנטיים עשויים להיות אוטומטיים אפילו כדי להגדיל את התפוקה באמצעות בקרי סיליקו כדי לספק פולסים אור מתוזמן במיוחד או מקומי לבריכות מדגם שונות30. עם זאת, ניסויים בעלי תפוקה גבוהה בתנאי אור שונים חייבים להיות מופרדים במידה מספקת כדי למנוע זיהום צולב של אור, אשר יכול להוות אילוצים מרחביים. בנוסף, הדרישה לגירוי אור מונעת את השימוש ברוב קוראי הלוחות והמיקרו-ביו-ראקטורים למדידות מתמשכות. אמנם עדיין לא זמין באופן נרחב מסחרית, מספר מכשירים ואלגוריתמים פותחו לאחרונה עבור תפוקה גבוהה וניסויים אופטוגנטיים מתמשכים, אשר מסייעים להתמודד עם אילוצים מרחביים אלה31,32,33,34. לכן, למרות מגבלות אלה, אופטוגנטיקה מציעה פוטנציאל עצום להגדיל את התפוקה הניסיונית תוך מתן שליטה משופרת.

הפרוטוקולים והווידאו המוצגים כאן יורידו בתקווה את המחסומים לחוקרים אחרים לאמץ בקרות אופטוגנטיות של חילוף החומרים התאי והתסיסות המיקרוביות. אופטוגנטיקה היא טכנולוגיה המאפשרת מחקר בסיסי ויישומים ביוטכנולוגיה שעשויים להפיק תועלת משליטה מכווננת של ביטויי גנים, כגון גנטיקה, ביולוגיה מולקולרית ותאית, חילוף חומרים, ביולוגיה של מערכות וסייברגנטיקה35,36,37,38. בנוסף, רגולציה אופטוגנטית של ביטוי גנים הודגמה במיקרואורגניזמים אחרים כגון Bacillus subtilis ו- Pseudomonas aeruginosa, דבר המצביע על כך שניתן להרחיב את היתרונות של שליטה באור למחקר וליישום של מינים מגוונים39,40,41. אפשרויות אלה מדגישות את הפוטנציאל העתידי של אופטוגנטיקה להנדסה מטבולית, ייצור חלבונים ויישומים ביוטכנולוגיה אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הגישו בקשה למספר פטנטים עבור המעגלים האופטוגנטיים והשיטות המתוארות במאמר זה.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי משרד האנרגיה של ארה"ב, משרד המדע, המשרד למחקר ביולוגי וסביבתי פרס DE-SC0019363, פרס הקריירה של NSF CBET-1751840, קרנות הצדקה של פיו ופרס המורה-מלומד של קמיל דרייפוס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengineering. 7 (4), 151 (2020).
  3. Venayak, N., Anesiadis, N., Cluett, W. R., Mahadevan, R. Engineering metabolism through dynamic control. Current Opinion in Biotechnology. 34, 142-152 (2015).
  4. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Avalos, J. L. Current and future modalities of dynamic control in metabolic engineering. Current Opinion in Biotechnology. 52, 56-65 (2018).
  5. Zhao, E. M., et al. Design and characterization of rapid optogenetic circuits for dynamic control in yeast metabolic engineering. ACS Synthetic Biology. 9 (12), 3254-3266 (2020).
  6. Lalwani, M. A., et al. Optogenetic control of the lac operon for bacterial chemical and protein production. Nature Chemical Biology. 17 (1), 71-79 (2021).
  7. Zhao, E. M., et al. Optogenetic regulation of engineered cellular metabolism for microbial chemical production. Nature. 555 (7698), 683-687 (2018).
  8. Baumschlager, A., Khammash, M. Synthetic biological approaches for optogenetics and tools for transcriptional light-control in bacteria. Advanced Biology. 5 (5), 2000256 (2021).
  9. Dvorak, P., et al. Exacerbation of substrate toxicity by IPTG in Escherichia coli BL21(DE3) carrying a synthetic metabolic pathway. Microbial Cell Factories. 14, 201 (2015).
  10. Hartline, C. J., Schmitz, A. C., Han, Y., Zhang, F. Dynamic control in metabolic engineering: Theories, tools, and applications. Metabolic Engineering. 63, 126-140 (2021).
  11. Ni, C., Dinh, C. V., Prather, K. L. J. Dynamic control of metabolism. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 12, 519-560 (2021).
  12. Zhao, E. M., et al. Optogenetic amplification circuits for light-induced metabolic control. ACS Synthetic Biology. 10 (5), 1143-1154 (2021).
  13. Lalwani, M. A., Zhao, E. M., Wegner, S. A., Avalos, J. L. The Neurospora crassa Inducible Q System Enables Simultaneous Optogenetic Amplification and Inversion in Saccharomyces cerevisiae for Bidirectional Control of Gene Expression. ACS Synthetic Biology. 10 (8), 2060-2075 (2021).
  14. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  15. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  16. Marx, H., Mecklenbräuker, A., Gasser, B., Sauer, M., Mattanovich, D. Directed gene copy number amplification in Pichia pastoris by vector integration into the ribosomal DNA locus. FEMS Yeast Research. 9 (8), 1260-1270 (2009).
  17. Nordén, K., et al. Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris. BMC Biotechnology. 11, 47 (2011).
  18. Zhao, E. M., et al. Light-based control of metabolic flux through assembly of synthetic organelles. Nature Chemical Biology. 15 (6), 589-597 (2019).
  19. Dowee, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
  20. Zhou, K., Edgar, S., Stephanopoulos, G. Engineering microbes to synthesize plant isoprenoids. Methods in Enzymology. 575, 225-245 (2016).
  21. Arfman, N., Worrell, V., Ingram, L. O. Use of the tac promoter and lacI(q) for the controlled expression of Zymomonas mobilis fermentative genes in Escherichia coli and Zymomonas mobilis. Journal of Bacteriology. 174 (22), 7370-7378 (1992).
  22. Steen, E. J., et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of n-butanol. Microbial Cell Factories. 7 (1), 1-8 (2008).
  23. Tan, S. Z., Manchester, S., Prather, K. L. J. Controlling central carbon metabolism for improved pathway yields in Saccharomyces cerevisiae. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 116-124 (2015).
  24. Jayaraman, P., et al. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6994 (2016).
  25. Fernandez-Rodriguez, J., Moser, F., Song, M., Voigt, C. A. Engineering RGB color vision into Escherichia coli. Nature Chemical Biology. 13 (7), 706-708 (2017).
  26. Ding, Q., et al. Light-powered Escherichia coli cell division for chemical production. Nature Communications. 11 (1), 1-14 (2020).
  27. Senoo, S., Tandar, S. T., Kitamura, S., Toya, Y., Shimizu, H. Light-inducible flux control of triosephosphate isomerase on glycolysis in Escherichia coli. Biotechnology and Bioengineering. 116 (12), 3292-3300 (2019).
  28. Ramakrishnan, P., Tabor, J. J. Repurposing synechocystis PCC6803 UirS-UirR as a UV-violet/green photoreversible transcriptional regulatory tool in E. Coli. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 733-740 (2016).
  29. Tabor, J. J., Levskaya, A., Voigt, C. A. Multichromatic control of gene expression in escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 405 (2), 315-324 (2011).
  30. Stewart, C. J., McClean, M. N. Design and implementation of an automated illuminating, culturing, and sampling system for microbial optogenetic applications. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (120), e54894 (2017).
  31. Grødem, E. O. S., Sweeney, K., McClean, M. N. Automated calibration of optoPlate LEDs to reduce light dose variation in optogenetic experiments. BioTechniques. 69 (4), 313-316 (2020).
  32. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, (2016).
  33. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  34. Steel, H., Habgood, R., Kelly, C., Papachristodoulou, A. In situ characterisation and manipulation of biological systems with Chi.Bio. PLoS Biology. 18 (7), (2020).
  35. Carrasco-López, C., García-Echauri, S. A., Kichuk, T., Avalos, J. L. Optogenetics and biosensors set the stage for metabolic cybergenetics. Current Opinion in Biotechnology. 65, 296-309 (2020).
  36. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7 (1), 1-11 (2016).
  37. Melendez, J., et al. Real-time optogenetic control of intracellular protein concentration in microbial cell cultures. Integrative Biology: Quantitative Biosciences From Nano to Macro. 6 (3), 366-372 (2014).
  38. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  39. Castillo-Hair, S. M., Baerman, E. A., Fujita, M., Igoshin, O. A., Tabor, J. J. Optogenetic control of Bacillus subtilis gene expression. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  40. Xia, A., et al. Optogenetic modification of pseudomonas aeruginosa enables controllable twitching motility and host infection. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 531-541 (2021).
  41. Pu, L., Yang, S., Xia, A., Jin, F. Optogenetics manipulation enables prevention of biofilm formation of engineered pseudomonas aeruginosa on surfaces. ACS Synthetic Biology. 7 (1), 200-208 (2018).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 181
תסיסה מבוקרת אור לייצור כימיקלים וחלבון מיקרוביאליים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A.,… More

Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter