Effiziente und kostengünstige Elektroporationsmethode zur Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Signalwege im Granulatzellvorläufer

Summary

Hier stellen wir ein reproduzierbares In-vitro-Elektroporationsprotokoll für die genetische Manipulation von primären Kleinhirn-Granulazellvorläufern (GCPs) vor, das kostengünstig, effizient und lebensfähig ist. Darüber hinaus demonstriert dieses Protokoll auch eine einfache Methode für die molekulare Untersuchung primärer Cilium-abhängiger Hedgehog-Signalwege in primären GCP-Zellen.

Abstract

Das primäre Cilium ist eine kritische Signalorganelle, die auf fast jeder Zelle vorkommt, die Hedgehog (Hh) -Signalreize von der Zelloberfläche überträgt. Im Granulatzellvorläufer (GCP) fungiert das primäre Cilium als zentrales Signalzentrum, das die Proliferation von Vorläuferzellen orchestriert, indem es den Hh-Signalweg moduliert. Die Untersuchung der primären Cilium-abhängigen Hh-Signalmaschinerie wird durch in vitro genetische Manipulation der Signalwegkomponenten erleichtert, um ihre dynamische Lokalisierung zum primären Cilium sichtbar zu machen. Die Transfektion von Transgenen in den Primärkulturen von GCPs unter Verwendung der derzeit bekannten Elektroporationsmethoden ist jedoch im Allgemeinen kostspielig und führt häufig zu einer geringen Zelllebensfähigkeit und unerwünschten Transfektionseffizienz. Dieses Papier stellt ein effizientes, kostengünstiges und einfaches Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Transfektionseffizienz von ~ 80-90% und eine optimale Zelllebensfähigkeit aufweist. Dies ist eine einfache, reproduzierbare und effiziente genetische Modifikationsmethode, die auf die Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hedgehog-Signalwegs in primären GCP-Kulturen anwendbar ist.

Introduction

Kleinhirn-GCPs werden häufig verwendet, um die Maschinerie des Hh-Signalwegs in neuronalen Vorläuferzelltypen aufgrund ihrer hohen Häufigkeit und hohen Empfindlichkeit gegenüber dem Hh-Signalweg in vivo zu untersuchen1,2,3,4. In GCPs fungiert das primäre Cilium als pivotaler Hh-Signaltransduktionshub5, der die Proliferation der Vorläuferzellen orchestriert6,7,8. Die In-vitro-Visualisierung von Hh-Signalkomponente....

Protocol

Alle tierbezogenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für den Umgang mit Tieren und dem vom Gesundheitsministerium in Hongkong genehmigten Protokoll durchgeführt. Tierversuchslizenzen gemäß der Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) wurden vom Gesundheitsministerium der Regierung von Hongkong erhalten. Die Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit der vom HKBU-Forschungsbüro und dem Laborsicherheitsausschuss genehmigten Tiersicherheitsethik durchgeführt. Ausführliche Informationen zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien finden Sie in der Materialtabelle .

1. Vorbereitun....

Results

Unter Verwendung des Opti-MEM (siehe Materialtabelle) als universelles Reagenz könnte diese vorgeschlagene Elektroporationsmethode eine konstant hohe Elektroporationseffizienz von ~ 80-90% erreichen (Abbildung 1). Die Elektroporationseffizienz des Smo-EGFP-Vektors wurde bei DIV 2 nach der Elektroporation durch Quantifizierung des Prozentsatzes grün fluoreszenzpositiver Zellen in allen gepaarten Box-Protein-6 (Pax6)-exprimierenden GCP-Zellen bestimmt. Die Elektroporationseffi.......

Discussion

Die Transfektion von Transgenen in primärer GCP-Kultur durch Elektroporationsmethode ist typischerweise mit einer geringen Zelllebensfähigkeit und einer schlechten Transfektionseffizienz ^{assoziiert9,10}. Dieses Papier stellt ein kostengünstiges und reproduzierbares Elektroporationsprotokoll vor, das eine hohe Effizienz und Lebensfähigkeit bewiesen hat. Darüber hinaus demonstrieren wir auch eine einfache Methode zur Untersuchung des primären Cilium-abhängigen Hh-Si.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GCP Culture
B27 Nahrungsergänzungsmittel	Life Technologies LTD	17504044
Cell Sieb, 70 & Mikro; m	Corning	352350
DNase I aus Rinderpankreas	Roche	11284932001
Earle' s Balanced Salt Solution	Gibco, Life Technologies	14155063
FBS, qualifiziert	Thermo Scientific	SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Life Technologies	35050061	L-Glutaminersatz
L-Cystein Sigma	Aldrich	C7352
Matrigel	BD Biosciences	354277	Basalmembranmatrix
Neurobasal	Gibco, Life Technologies	21103049
Papain, Suspension	Worthington Biochemical Corporation	LS003126
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma Aldrich	P6407
SAG	Cayman Chemical	11914-1	Geglätteter Agonist
IF-Färbung
Rinderserumalbumin	Sigma Aldrich	A7906
Paraformaldehyd	Sigma Aldrich	P6148
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab	Rockland	600-101-215	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Anti-Arl13b Maus monoklonal ab	NeuroMab	75-287	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Anti-Pax6 Kaninchen polyklonal ab	Covance	PRB-278P	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Sekundäre Antikörpermischung
Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ziege IgG	Invitrogen	A-11055	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 Esel Anti-Maus IgG	Invitrogen	A-31570	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 Esel Anti-Kaninchen	IgG Invitrogen	A-31573	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
DAPI	Thermo Scientific	62247	Verdünnungsfaktor: 1 : 1000
Elektroporation
CU 500 Küvettenkammer	Nepagene	CU500
EPA Elektroporationsküvette (2 mm Abstand)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	serumreduziertes Medium für die Transfektion
pEGFP-mSmo	Addgene	25395
Super Elektroporator NEPA21 TYP II In Vitro und In Vivo Elektroporation	Nepagene	NEPA21	Elektroporator