Methodenartikel

Raumzeitliche subzelluläre Manipulation des Mikrotubuli-Zytoskeletts im lebenden Präimplantations-Mausembryo mittels Photostatinen

DOI:

10.3791/63290

⸱

30. November 2021

 ,  ,  ,  , 
1Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University, 2School of BioSciences, The University of Melbourne

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Typische Mikrotubuli-Inhibitoren, die in der Grundlagen- und angewandten Forschung weit verbreitet sind, haben weitreichende Auswirkungen auf Zellen. In jüngster Zeit haben sich Photostatine zu einer Klasse von photoschaltbaren Mikrotubuli-Inhibitoren entwickelt, die in der Lage sind, mikrotubuli augenblicklich, reversibel, räumlich-zeitlich präzise zu manipulieren. Dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll beschreibt die Anwendung von Photostatinen in einem 3D-lebenden Präimplantations-Mausembryo.

Zusammenfassung

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Das Mikrotubuli-Zytoskelett bildet das Gerüst einer Zelle und ist grundlegend für den intrazellulären Transport, die Zellteilung und die Signaltransduktion. Traditionelle pharmakologische Störungen des allgegenwärtigen Mikrotubuli-Netzwerks, die beispielsweise Nocodazol verwenden, können verheerende Folgen für jede Zelle haben. Reversibel photoschaltbare Mikrotubuli-Inhibitoren haben das Potenzial, die Einschränkungen zu überwinden, indem sie die Umsetzung von Arzneimittelwirkungen in einer räumlich-zeitlich kontrollierten Weise ermöglichen. Eine solche Familie von Medikamenten sind die Azobenol-basierten Photostatine (PSTs). Diese Verbindungen sind unter dunklen Bedingungen inaktiv und binden bei Beleuchtung mit UV-Licht an die Colchicin-Bindungsstelle des β-Tubulins und blockieren die Mikrotubulipolymerisation und den dynamischen Umsatz. Hier soll die Anwendung von PSTs im 3-dimensionalen (3D) lebenden Präimplantations-Mausembryo das Mikrotubuli-Netzwerk auf subzellulärer Ebene stören. Dieses Protokoll enthält Anweisungen für den Versuchsaufbau sowie Lichtaktivierungs- und Deaktivierungsparameter für PSTs mit konfokaler Lebendzellmikroskopie. Dies gewährleistet die Reproduzierbarkeit und ermöglicht es anderen, dieses Verfahren auf ihre Forschungsfragen anzuwenden. Innovative Fotoschalter wie PSTs können sich zu leistungsstarken Werkzeugen entwickeln, um das Verständnis des dynamischen intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks voranzutreiben und das Zytoskelett in Echtzeit nicht-invasiv zu manipulieren. Darüber hinaus können sich PSTs in anderen 3D-Strukturen wie Organoiden, Blastoiden oder Embryonen anderer Spezies als nützlich erweisen.

Einleitung

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Die Mikrotubuli-Architektur variiert stark zwischen verschiedenen Zelltypen, um verschiedene Funktionen zu unterstützen 1,2. Seine dynamische Natur des Wachstums und der Schrumpfung ermöglicht eine schnelle Anpassung an extra- und intrazelluläre Hinweise und die Reaktion auf die sich ständig ändernden Bedürfnisse einer Zelle. Daher kann es als der "morphologische Fingerabdruck" betrachtet werden, der eine Schlüsselrolle bei der zellulären Identität spielt.

Das pharmakologische Targeting des Mikrotubuli-Zytoskeletts unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren hat zu einer Fülle grundlegender Entdeckungen in der Entwicklungsbiologie, Stammzellbiologie, Krebsbiologie und Neurobiologiegeführt 3,4,5,6,7. Dieser Ansatz ist zwar unverzichtbar, weist jedoch verschiedene Einschränkungen wie Toxizität und Off-Target-Effekte auf. Zum Beispiel ist eines der am weitesten verbreiteten Mikrotubuli-Targeting-Mittel, Nocodazol, ein starkes Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel8. Niedermolekulare Inhibitoren wie Nocodazol sind jedoch ab dem Zeitpunkt der Anwendung aktiv, und angesichts der essentiellen Natur des Mikrotubuli-Zytoskeletts für viele kritische zelluläre Funktionen kann die globale Depolymerisation von Mikrotubuli Off-Target-Effekte erzeugen, die für viele Anwendungen ungeeignet sein können. Darüber hinaus ist die Nocodazol-Behandlung irreversibel, es sei denn, die Proben werden frei von dem Arzneimittel gewaschen, wodurch eine kontinuierliche Live-Bildgebung und damit eine präzise Verfolgung einzelner Mikrotubuli-Filamente verhindert wird.

Die Entwicklung lichtaktivierter Verbindungen begann mit der Schaffung von photounkäfigförmigen Molekülen und hat eine neue Ära in der gezielten und überwachung der Auswirkungen der Wachstumshemmung von Mikrotubuli auf präzise und räumlich-zeitlich kontrollierte Weise eingeläutet. Eine Familie von reversibel photoschaltbaren Medikamenten, Photostatine (PSTs), wurde entwickelt, indem die Stilbenkomponente von Combretastatin A-4 durch Azobenzel 9 ersetztwurde. PSTs sind bis zur Beleuchtung mit UV-Licht inaktiv, wobei die inaktive Transkonfiguration durch reversible Isomerisierung in die aktive cis-Konfiguration umgewandelt wird. Cis-PSTs hemmen die Mikrotubulipolymerisation durch Bindung an die Colchicin-Bindungsstelle von β-Tubulin, blockieren seine Grenzfläche mit β-Tubulin und verhindern die für das Wachstum der Mikrotubuli erforderliche Dimerisierung10. Unter einer Kohorte von PSTs hat sich PST-1P als Bleiverbindung herauskristallisiert, da es die höchste Potenz hat, vollständig wasserlöslich ist und nach der Beleuchtung einen schnellen Beginn der Bioaktivität zeigt.

Die effektivste Trans- bis Cis-Isomerisierung von PSTs erfolgt bei Wellenlängen zwischen 360-420 nm, was zwei Optionen für die PST-Aktivierung ermöglicht. Eine 405-nm-Laserlinie auf einem typischen konfokalen Mikroskop kann für eine optimale räumliche Ausrichtung der Mikrotubuli-Wachstumshemmung verabreicht werden. Die Möglichkeit, den Ort und das Timing der PST-Aktivierung durch 405-nm-Laserbeleuchtung zu bestimmen, erleichtert eine präzise zeitliche und räumliche Kontrolle, die eine Störung der Mikrotubuli-Dynamik auf subzellulärer Ebene innerhalb von Subsekunden-Reaktionszeitenermöglicht 9. Alternativ ermöglicht ein erschwingliches LED-UV-Licht die Beleuchtung des gesamten Organismus, um eine organismusweite Störung der Mikrotubuli-Architektur zu induzieren. Dies kann eine kostengünstige Alternative für Forscher sein, für die der genau zeitlich abgestimmte Beginn der Hemmung und nicht das räumliche Targeting das Ziel ist. Ein weiteres Merkmal von PSTs ist ihre On-Demand-Inaktivierung durch Anlegen von grünem Licht einer Wellenlänge im Bereich von 510-540 nm9. Dies ermöglicht die Rückverfolgung von Mikrotubuli-Filamenten vor, während und nach der PST-vermittelten Wachstumshemmung.

PSTs, obwohl noch ein relativ neues Design, wurden in zahlreichen In-vitro-Anwendungen in verschiedenen Forschungsbereicheneingesetzt 11, einschließlich der Untersuchung neuer Mechanismen der Zellmigration in Amöboiden12, in Neuronen, die aus dem Gehirn der neugeborenen Mausisoliert wurden 13, und der Flügelepithelentwicklung in Drosophila melanogaster14 . Andere lichtreaktive Medikamente haben sich als wertvolle Werkzeuge zur gezielten Störung der Zellfunktion erwiesen. Zum Beispiel wurde ein Analogon von Blebbistatin, Azidoblebbistatin, zur verstärkten Myosinhemmung unter Beleuchtung15,16 verwendet. Dies unterstreicht das Potenzial für neue Entdeckungen aufgrund der Fähigkeit zur räumlich-zeitlich kontrollierten Hemmung der zellulären Funktion.

Lebende 3D-Organismen präsentieren hervorragende, aber empfindlichere Systeme, um die Dynamik von Mikrotubuli auf Ganztier-, Einzelzell- oder subzellulärer Ebene unter physiologischen Bedingungen zu manipulieren. Insbesondere der Präimplantationsmausembryo bietet einen außergewöhnlichen Einblick in das Innenleben der Zelle sowie in die interzellulären Beziehungen innerhalb eines Organismus17. Zeitlich und räumlich zielgerichtete aufeinanderfolgende Zyklen der Aktivierung und Deaktivierung von PSTs trugen zur Charakterisierung der Interphasenbrücke, einer postzytokinetischen Struktur zwischen Zellen, als nicht-zentrosomales Mikrotubuli-organisierendes Zentrum im Präimplantationsmausembryobei 16. Ein ähnlicher Versuchsaufbau zeigte die Beteiligung wachsender Mikrotubuli an der Versiegelung des Mausembryos, um die Blastozystenbildung zu ermöglichen18. Darüber hinaus wurden PSTs auch in ganzen Zebrafischembryonen verwendet, um die neuronale Zellmigration zu untersuchen, indem das Wachstum von Mikrotubuli in einer Untergruppe von Zellen im Hinterhirn gehemmtwurde 19.

Dieses Protokoll beschreibt den experimentellen Aufbau und die Verwendung von PST-1P im Präimplantations-Mausembryo. Die hier vorgestellten Anweisungen können auch die Anwendung von PSTs für eine breite Palette von Zielen wie die Untersuchung der Chromosomensegregation und Zellteilung, des Handels mit intrazellulärer Fracht sowie der Zellmorphogenese und -migration leiten. Darüber hinaus werden solche Studien die Implementierung von PSTs in Organoidsystemen, Blastoiden und anderen Embryomodellen wie Caenorhabditis elegans und Xenopus laevis unterstützen und möglicherweise die Verwendung von PSTs für In-vitro-Fertilisationstechnologien erweitern.

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Protokoll

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Die Experimente wurden von der Monash Animal Ethics Committee unter der Tierethiknummer 19143 genehmigt. Die Tiere wurden in der Tiereinrichtung (Monash Animal Research Platform) unter strikten ethischen Richtlinien unter bestimmten pathogenfreien Tierstallbedingungen untergebracht.

1. Präimplantations-Maus-Embryo-Entnahme

  1. Superovulierte und paarende Mäuse wie zuvor beschrieben16,18, in Übereinstimmung mit den institutionellen tierethischen Richtlinien.
    HINWEIS: Die am häufigsten verwendeten Stämme für die Lebendembryonenentnahme sind C57BL/6- oder FVB/N-Mäuse. Alle hier gezeigten Daten wurden mit FVB/N-Mäusen generiert.
  2. Am Morgen nach der Paarung spülen Sie Zygoten aus dem Eileiter mit M2-Medium wiebeschrieben 20 oder Human Tubal Fluid (HTF) -Medium. Unter Verwendung einer Mundpipettenvorrichtung wie beschrieben21,22 werden Zygoten in einer 35-mm-Kulturschale, die mit einer ausreichenden Menge Mineralöl überzogen ist, in eine 35-mm-Kulturschale überlagert, die mit einem ausreichenden Volumen Mineralöl überzogen ist, um eine Medienberichterstattung zu gewährleisten, auf frische Kalium-Simplex-optimierte Medium-Tröpfchen (KSOM) übertragen, die auf 37 °C vorerwärmt und auf 5 % CO2 ausgeglichen werden.
  3. Microinject-Zygoten wie beschrieben20 mit cRNA-Kodierung für einen roten, fluoreszierend markierten Mikrotubuli plus Endmarker. Hier wurde cRNA für das End Binding Protein 3 (EB3)-dTomato in einer Konzentration von 30 ng/μL nach Präparation und Reinigung wie beschrieben16,18 und Verdünnung in Mikroinjektionspuffer verwendet.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, cRNA im Voraus vorzubereiten und bei -20 ° C zu lagern, bis dies erforderlich ist.
  4. Kultivieren Sie Embryonen in Dunkelheit bei 37 °C und 5% CO2 , bis die Embryonen das gewünschte Entwicklungsstadium für die PST-1P-Behandlung erreicht haben.
    HINWEIS: Für eine umfassende Ressource der Kulturzeiten, die für verschiedene Embryonalstadien erforderlich sind, siehe23. Für 16-Zell-Stadium-Embryonen, die hier verwendet werden, Kultur bis zum embryonalen Tag 3 (E3) nach der Befruchtung.

2. Zubereitung von Medikamenten und bildgebenden Gerichten

HINWEIS: Arbeiten Sie bei den Schritten 2.1-2.10 ausschließlich bei Dunkelheit oder Rotlicht, um eine unbeabsichtigte PST-1P-Aktivierung zu vermeiden. Aluminiumfolie oder dunkle Abdeckungen sollten für alle Rohre und Schalen verwendet werden, die PSTs enthalten.

  1. Bereiten Sie eine Lagerkonzentration von 50 mM PST-1P in Reinstwasser vor.
    HINWEIS: Das Molekulargewicht von PST-1P beträgt 440 g / mol. Die Lagerlösung ist bis zu 1 Jahr bei -20 °C stabil. PST-1P ist in Wasser oder wässrigem Puffer löslich, löst sich aber nicht leicht in DMSO auf.
  2. Aus Schritt 2.1 wird eine Zwischenarbeitskonzentration von 800 μM PST-1P in Reinstwasser hergestellt.
  3. PST-1P in frischem KSOM auf eine Endkonzentration von 40 μM verdünnen. Da ein typisches Experiment etwa 20 μL PST-1P-behandeltes KSOM erfordert, verdünnen Sie 1 μL 800 μM PST-1P in 19 μL KSOM für ein Endvolumen von 20 μL, um sicherzustellen, dass ausreichend Medium im Voraus vorbereitet wird, wobei nur rotes Licht für die Sichtbarkeit verwendet wird.
    HINWEIS: Sowohl die Konzentration als auch der Aktivierungsstatus einer PST-1P-Verdünnung können überprüft werden, indem ein UV-Vis-Absorptionsspektrum mit einem Spektralphotometer gemessen wird, das während der Assay-Etablierung durchgeführt werden sollte. Die Absorption bei 380 nm (A380) einer vollständig trans 40 μM-Verdünnung in einer 1-cm-Küvette sollte ungefähr 0,8 betragen. Sowohl cis- als auch trans-Formen haben die gleiche Absorption bei 455 nm (A455). Wenn das Verhältnis von A380 zu A455 ungefähr 9:1 beträgt, ist die Verdünnung inaktiv (vollständig trans). Wenn das Verhältnis A380:A455 1:2 beträgt, wird die Verdünnung vollständig aktiviert (vollständig cis). Zwischenverhältnisse spiegeln Zwischenzustände der Aktivierung wider.
  4. Um den Kammerobjektträger für die Live-Bildgebung vorzubereiten, pipettieren Sie 10 μL PST-1P-behandeltes KSOM in die Mitte eines Bohrlochs, um einen halbkugelförmigen Tröpfchen zu bilden (Abbildung 1A).
  5. Fügen Sie vorsichtig ausreichend Mineralöl hinzu, um den Tröpfchen zu bedecken, und stellen Sie sicher, dass er das Medium nicht verteilt. Dadurch wird sichergestellt, dass das Tröpfchen nicht verdunstet.
  6. Vorwärmen und CO2-equilibrieren Sie die Kammerschiebeschale in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 3 h oder höchstens über Nacht.
  7. Am Ende der Gleichgewichtsperiode in Schritt 2.6 wird eine 35-mm-Kulturschale mit einem 10-μL-Tröpfchen PST-1P-behandeltem, vorgewärmtem und gleichgestelltem KSOM als Waschschritt zubereitet. Nicht mit Öl überlagern.
  8. Transfer von Embryonen durch Mundpipettieren in das PST-1P-behandelte KSOM-Tröpfchen aus Schritt 2.7.
    HINWEIS: Die Schritte 2.7 und 2.8 werden für das Mundpipettieren von Embryonen empfohlen, sind jedoch optional.
  9. Sofortige Übertragung von Embryonen durch Mundpipettieren in die Mitte des PST-1P-behandelten KSOM-Tröpfchens in dem in den Schritten 2.4-2.6 vorbereiteten Objektträger der Bildgebungskammer (Abbildung 1A).
  10. Inkubieren Sie Embryonen bei 37 °C und 5% CO2 in PST-1P-behandeltem KSOM im Objektträger der Bildgebungskammer für mindestens 1 Stunde vor der Bildgebung. Wenn möglich, montieren Sie den Kammerobjektträger auf dem Mikroskop in einer Umgebungskammer bei 37 °C und 5%CO2 und in völliger Dunkelheit, um sicherzustellen, dass sich alle PST-1Ps in der inaktiven Transkonfiguration befinden und dass Embryonen auf den Boden der Schale sinken können.

3. Live-Bildgebung und PST-1P-Photoaktivierung

HINWEIS: Die Schritte 3.1-3.13 werden an einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop durchgeführt, das mit Lawinenphotodiodendetektoren (APDs) und einer dunklen Umgebungskammer ausgestattet ist. Diese Anweisungen beziehen sich speziell auf die Bildgebung unter Verwendung der in der Materialtabelle beschriebenen Erfassungssoftware. Sie können aber auch auf andere konfokale Mikroskopiesysteme angewendet werden.

  1. Bereiten Sie ein 63x/1,2 NA Wasseröl-Tauchobjektiv mit dem vorgeschriebenen Tauchmedium vor.
  2. Verwenden Sie eine Rotlichtlampe zur Führung der Positionierung, um das Objektiv zu bewegen, um das Tauchmedium zu kontaktieren. Vermeiden Sie in diesem Stadium die Verwendung von weißem oder Hellfeldlicht, um die Embryonen zu finden, da dies PST-1P frühreif aktivieren könnte.
  3. Lokalisieren Sie mit dem Okular und unter Rotlichtbeleuchtung den Rand des Mediumtröpfchens und positionieren Sie das Objektiv direkt über dieser Stelle. Dies kann dem Benutzer helfen, sich zu orientieren und die Fokusebene zu finden.
  4. Als nächstes verwenden Sie durch das Okular oder beim softwaregestützten Live-Modus-Scannen einen Rotwellenlängenfilter oder einen 561-nm-Laser, um die Embryonen im Tröpfchen zu lokalisieren.
  5. Verwenden Sie Bühnencontroller und den Live-Scanning-Modus, um die Start- und Endpunkte für die Aufnahme eines Z-Stacks des gesamten Embryos festzulegen.
  6. Passen Sie die Laserleistungseinstellungen an (typischerweise ist bei hochempfindlichen Detektoren wie den APDs eine Laserleistung von 561 nm von weniger als 5% ausreichend), der digitale Offset (typischerweise bei -0,900), um das Erscheinungsbild von EB3-dTomato-Kometen zu optimieren und Hintergrundgeräusche zu minimieren, Pinhole bei 2 μm, Pixelauflösung von 512 x 512 und Pixelverweilzeit von 3,15 μs.
  7. Erwerben Sie einen Z-Stapel des gesamten Embryos mit 1-μm-Schnittintervallen, um Bereiche des Mikrotubuliwachstums im gesamten Organismus zu beurteilen (Abbildung 1B).
  8. Verwenden Sie das 3D-Z-Stack-Bild aus Schritt 3.7, um Bereiche von Interesse (ROIs) für EB3-dTomato-Tracking-Experimente zu identifizieren. Erhöhen Sie den Zoom auf das 3-fache und zeichnen Sie einen rechteckigen ROI um den spezifischen subzellulären Bereich von Interesse.
  9. Erfassen Sie einen Zeitrafferfilm einer einzelnen Z-Ebene mit den typischen Werten der Bildgebungsparameter: 561 nm Laserleistung bei 5%, digitaler Offset von -0,900, Pixelauflösung von 512 x 512, Pinhole bei 3 μm, Pixelverweilzeit von 3,15 μs, Zoom von 3x, Zeitintervall von 500 ms.
    HINWEIS: 120 Zeitrahmen bieten einen Tracking-Film von 1 Minute und sollten für die Datenanalyse ausreichen. Die Erfassung kann länger fortgesetzt werden, sofern die Bleiche des Fluorophors minimal ist (Abbildung 1C).
  10. Um PST-1P zu aktivieren, wechseln Sie zu einem 405-nm-Laser und erfassen Sie einen weiteren Zeitrafferfilm mit dem 405-nm-Laser, der auf 10 % Leistung eingestellt ist, Pixelauflösung von 512 x 512, maximal geöffneter Lochblende, Pixelverweilzeit von 3,15 μs, Zoom von 3x, Zeitintervall von 500 ms und insgesamt 20 Bildern (Abbildung 1D).
  11. Wechseln Sie zurück zum 561-nm-Laser und wiederholen Sie die Erfassung wie in Schritt 3.9, um den Verlust von EB3-dTomato-Kometen nach der Aktivierung von PST-1P zu bestätigen (Abbildung 1E). Stellen Sie sicher, dass diese Erfassung so schnell wie möglich nach der Aktivierung erfolgt.
    HINWEIS: Schritt 3.10 kann wiederholt durchgeführt werden, um eine längere Hemmung von EB3-dTomato-Kometen zu erreichen. Embryonen müssen jedoch sorgfältig überwacht werden, um Schäden durch UV-Licht zu vermeiden.
  12. Um PST-1P wieder in seinen inaktiven Trans-Zustand zu versetzen, schalten Sie einen 514-nm-Laser mit einer Leistung von 10% ein. Erwerben Sie einen Zeitrafferfilm mit einem 514-nm-Lasersatz von 10 %, einer Pixelauflösung von 512 x 512, maximal geöffnetem Loch, einer Pixelverweilzeit von 3,15 μs, einem Zoom von 3x, einem Zeitintervall von 500 ms und insgesamt 20 Zeitrahmen (Abbildung 1F).
  13. Wiederholen Sie Schritt 3.11, um die Wiederherstellung von EB3-dTomato-Kometen zu visualisieren (Abbildung 1G).

4. Bilddatenanalyse

  1. Um die Hemmung der Mikrotubulipolymerisation durch PSTs zu analysieren und zu quantifizieren, verwenden Sie Softwareprogramme, die den Forschern zur Verfügung stehen, um ihren spezifischen Bedürfnissen gerecht zu werden. Diejenigen, die für die Verwendung empfohlen werden, verfügen über ein Tracking-Tool, das die Bewegung, Richtung und Geschwindigkeit der EB3-dTomato-Kometen16,18 manuell oder automatisch verfolgen kann.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung der PST-1P-Photoaktivierung und -Deaktivierung im lebenden 3D-Präimplantationsmaus-Embryo. Alle Experimente werden in völliger Dunkelheit (schwarzer Hintergrund) oder nur durch Rotlichtbeleuchtung durchgeführt. (A) Lebende Präimplantations-Mausembryonen, die EB3-dTomate exprimieren, werden in ein 16-Zell-Stadium kultiviert und dann in einen Tropfen KSOM mit 40 μM PST-1P in einem Objektträger der Bildgebungskammer überführt. (B) Ein 3D-Bild des gesamten Embryos ermöglicht die Beurteilung des Mikrotubuli-Wachstums durch Visualisierung der Verteilung von EB3-dTomato-Kometen. (C) Um das Experiment zu starten, werden EB3-dTomato-Kometen in einer subzellulären Region mittels Zeitraffer-Bildgebung verfolgt. (D) Die nachfolgende PST-1P-Photoaktivierung in derselben subzellulären Region mit einem 405-nm-Laser führt zum Verlust von EB3-dTomaten-Kometen (E). Eine verstärkte PST-1P-Aktivierung kann bei Bedarf durch sequentielle 405 nm Lichtbeleuchtung realisiert werden. (F-G) Um PST-1P in seinen inaktiven Zustand zurückzuversetzen und EB3-dTomato-Kometen wiederherzustellen, wird ein 514-nm-Laser auf dieselbe subzelluläre Region angewendet. Bei Bedarf können mehrere Runden der Photoaktivierung und Deaktivierung durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Ergebnisse

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In Übereinstimmung mit dem Protokoll wurden Präimplantations-Mausembryonen mit cRNA für EB3 mikroinjiziert, die mit rot fluoreszierenden dTomato (EB3-dTomato) markiert wurde. Dies ermöglicht die Visualisierung wachsender Mikrotubuli, da EB3 an polymerisierende Mikrotubuli plus ends24 bindet.

Die Experimente wurden 3 Tage nach der Befruchtung (E3) durchgeführt, wenn der Mausembryo aus 16 Zellen besteht. Abhängig von der zu untersuchenden wissenschaftlichen Fragestellung ...

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Diskussion

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Das Mikrotubuli-Netzwerk ist integraler Bestandteil des grundlegenden Innenlebens einer Zelle. Folglich stellt dies eine Herausforderung bei der Manipulation der Mikrotubulidynamik in lebenden Organismen dar, da jede Störung des Netzwerks tendenziell weitreichende Folgen für alle Aspekte der zellulären Funktion hat. Das Aufkommen von photoschaltbaren Mikrotubuli-Targeting-Verbindungen stellt eine Möglichkeit dar, das Zytoskelett auf subzellulärer Ebene präzise zu manipulieren, mit überlegener Kontrolle für die Induktion ...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären kein konkurrierendes oder finanzielles Interesse.

Danksagungen

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Die Autoren danken Dr. Oliver Thorn-Seshold und Li Gao für die Bereitstellung von Photostatinen und Ratschlägen zur Manuskriptvorbereitung, Monash Production für die Unterstützung bei den Dreharbeiten und Monash Micro Imaging für die Unterstützung der Mikroskopie.

Diese Arbeit wurde durch den Projektzuschuss APP2002507 des National Health and Medical Research Council (NHMRC) an J.Z. und das Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR) Azrieli-Stipendium für J.Z. Das Australian Regenerative Medicine Institute wird durch Zuschüsse der Landesregierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AspiratorröhrchenSigma-AldrichA5177Für Mundabsauggeräte
Objektträger - LabTekThermo Fisher ScientificNUN155411 cRNA-Kodierung
für EB3-dTomatoN/AN/AHergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von mMessage in vitro Transkriptionskit
Kulturschalen - 35mmThermo Fisher Scientific150560
Humanes Chorion-WachstumshormonSigma-AldrichC8554
Humane Tubenflüssigkeit (HTF) MediumCosmo-BioCSR-R-B071
Imaris BildanalysesoftwareBitplane
Immersion Oil W 2010Carl Zeiss444969-0000-000Zur Verwendung mit Mikroskop-Immersionsobjektiv
LED-Taschenlampe - Rotes LichtCelestron93588
M2 mediumSigma-AldrichM7167
Mäuse - Wildtyp FVB/N, Rüden und HündinnenN/AN/AHündinnen 8-9 Wochen alt. Rüden im Alter von 2-6 Monaten.
Mikrokapillarpipetten - KimbleSigma-AldrichZ543306Für Mundaspirationsapparate
MikroinjektionspufferN/AN/A5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,4
MineralölOrigioART-4008-5P
mMessage In vitro TranskriptionskitThermo Fisher ScientificAM1340
NanoDrop SpektralphotometerThermo Fisher Scientific
Kalium-Simplex-optimiertes Medium (KSOM) MediumCosmo-BioCSR-R-B074
Trächtige Stutenserum GonadotropinProspec BioHOR-272
PST-1PN/AN/ABorowiak, M. et al., Photoschaltbare Inhibitoren der Mikrotubuli-Dynamik kontrollieren optisch die Mitose und den Zelltod. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA-AufreinigungskitSangonB511361-0100
ReinstwasserSigma-AldrichW1503
ZEN Black SoftwareCarl Zeiss

Referenzen

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