Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit einem rotierenden Zellkultursystem

Summary

Dies ist eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems zur Kultivierung von Lymphozyten in simulierter Schwerelosigkeit mit speziellen Einweg-Kulturgefäßen. Diese Kultivierungsmethode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Abstract

Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es einige Möglichkeiten, Zellkulturen auf der Erde einer simulierten Schwerelosigkeit (SMG) auszusetzen. Diese Optionen unterscheiden sich in ihren Methoden, Prinzipien und ihrer Eignung für die Verwendung mit Suspensionszellkulturen. In dieser Arbeit wird ein Zellkulturverfahren beschrieben, bei dem Lymphozyten unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystems, auch bekannt als 2D-Klinostat oder Rotating Wall Vessel (RWV)-Gerät, einer simulierten Schwerelosigkeit ausgesetzt werden. Diese Zellkulturmethode nutzt das Prinzip der zeitgemittelten Gravitationsvektoraufhebung, um die Schwerelosigkeit zu simulieren, indem die Zellen um eine horizontale Achse gedreht werden. Die in diesem System kultivierten Zellen können geerntet und in vielen verschiedenen experimentellen Assays verwendet werden, um die Auswirkungen der simulierten Schwerelosigkeit auf die zelluläre Funktion und Physiologie zu bewerten. Die Kultivierungstechnik kann je nach verwendetem Zelltyp oder Zelllinie leicht variieren, aber die hier beschriebene Methode kann auf jede Suspensionszellkultur angewendet werden.

Introduction

Es hat sich gezeigt, dass die Raumfahrt viele Aspekte der menschlichen Physiologie beeinflusst, einschließlich des Immunsystems. Viele Studien haben Hinweise auf eine Fehlregulation des Immunsystems als Folge von Raumflügen in vivo und Exposition gegenüber simulierter Schwerelosigkeit (SMG) in vitro gezeigt 1,2,3,4. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Mikrogravitation bezieht sich auf die "Schwerelosigkeit", die aufgrund geringer Gravitationskräfte in der Weltraumumgebung erlebt^{wird 5}. Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern.

Echte Schwerelosigkeitsbedingungen für die wissenschaftliche Forschung können im Weltraum an Bord der Internationalen Raumstation (ISS) oder in Nanosatelliten, die in den Orbit gebracht werden, erreicht werden. Diese Optionen können jedoch unglaublich kostspielig und komplex in der Orchestrierung sein. Angesichts der derzeitigen Einschränkungen der biologischen Forschung im Weltraum gibt es mehrere Möglichkeiten, echte Schwerelosigkeit und SMG auf der Erde zu induzieren. Es gibt groß angelegte Operationen, die kurze Perioden echter Schwerelosigkeit auf der Erde erzeugen können, darunter Falltürme, Parabelflüge und Höhenforschungsraketen. Diese Methoden sind jedoch nicht übermäßig geeignet, um die Auswirkungen der Schwerelosigkeit auf biologische Systeme zu untersuchen, was vor allem auf ihre kurzen Zeiträume der Mikrogravitationsbehandlung (d. h. Sekunden bis 20 Minuten) zurückzuführen ist. Diese Methoden werden an anderer Stelle ausführlicher erörtert ^5,6. Zu den Optionen, die für die biologische Zellkultur geeignet sind, gehören kleine Geräte wie 2D-Klinostate oder RWV-Geräte (Rotating Wall Vessel) und 3D-Klinostate oder Zufallspositioniermaschinen (RPM). Diese Geräte können in Zellkulturinkubatoren bei 37 °C und 5 % CO₂ aufgestellt werden und drehen die Zellkultur entweder um eine horizontale Achse (2D) oder um zwei senkrechte Achsen (3D)⁵. Es ist jedoch wichtig zu betonen, dass diese Kultivierungsmethoden SMG erzeugen, im Gegensatz zur echten Schwerelosigkeit, die im Weltraum für biologische Forschungskontexte am besten erreicht werden kann.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Schritte zur Subvention von Lymphozyten mit SMG unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen RWV-Geräts (Table of Materials) zu skizzieren, das unter die 2D-Klinostat-Klassifikation fällt. Während es vom Hersteller ein allgemeines Protokoll für den Betrieb dieses Geräts gibt, zielt der aktuelle Artikel darauf ab, die Schritte zur Fehlerbehebung und Optimierung genauer zu behandeln. Dieser Artikel behandelt auch die Theorie hinter der Funktionsweise dieses Geräts zur Herstellung von SMG in Suspensionszellkultur, insbesondere mit Lymphozyten. Suspensionszellkultur bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Zellen, die in supplementierten Nährmedien frei wachsen, ohne an einem zusätzlichen Gerüst zu haften. Viele Zelltypen werden in Suspensionszellkultur gezüchtet, darunter auch Lymphozyten. Lymphozyten sind Zellen des Immunsystems, einschließlich T-, B- und natürlicher Killerzellen (NK), die sich in lymphatischen Organen und im Blutkreislauf befinden⁷.

Der hier beschriebene RWV-2D-Klinostat arbeitet nach dem Prinzip der zeitlich gemittelten Gravitationsvektor-Nullifikation 5,6,8,9^, wobei der Gravitationsvektor durch Rotation der Zellkultur um eine horizontale Achse randomisiert wird. Dies wird erreicht, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen angepasst wird. Solange die Rotationsgeschwindigkeit des Kulturgefäßes gut auf die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen abgestimmt ist, bleiben die Zellen im freien Fall und können nicht sedimentieren, wie es in der Weltraumumgebung der Fall ist. Nach einer anfänglichen Beschleunigungsphase erreicht das Medium im Kulturgefäß schließlich mit der Zeit eine "Festkörperrotation". Diese horizontale Rotation induziert auch eine laminare Strömung im Zellkulturgefäß. Dadurch entsteht eine "scherarme" Umgebung, da die Scherspannung, die durch laminare Strömung auf die Zellen induziert wird, viel geringer ist als die der turbulenten Strömung. Da der Klinostat jedoch kein perfektes System ist, gibt es einige kleine, laminare Flüssigkeitsbewegungen, die eine minimale Scherspannung auf die Zellen ausüben. So werden die im Medium schwebenden Zellen bei der Rotation von dieser Strömung mitgerissen. Während der horizontalen Rotation wirkt der Schwerkraftvektor auf die Zellen und bringt sie in eine oszillierende Bahn, wie in Abbildung 1 dargestellt. Eine weitere kleine Quelle der Scherspannung wird dadurch verursacht, dass die Zellen durch das Medium "fallen" und eine laminare Strömung um die Zellen herum verursachen. Wenn sich das Kulturgefäß um eine horizontale Achse dreht, dreht sich auch der Schwerkraftvektor, den die Zellen erfahren. Im Laufe der Zeit wird dieser rotierende Schwerkraftvektor gemittelt, um gegen Null zu gehen. Dieses Phänomen wird als zeitgemittelte Gravitationsvektor-Nullifikation bezeichnet und induziert einen Zustand von^SMG 5,6,8,9. Dieses Gerät wurde verwendet, um die Auswirkungen von SMG auf viele Zelltypen zu untersuchen, von denen einige in den Referenzen¹⁰, ^{11, 12} behandelt werden. Weitere Beispiele finden Sie auf der Website des Geräteherstellers.

Dieses RWV-Gerät verwendet spezielle "High Aspect Ratio Vessels" (HARVs), die über den Gerätehersteller erhältlich sind. Diese HARVs fassen jeweils 10 ml Zellkultur; Es sind jedoch auch 50-ml-HARVs erhältlich. Es können entweder 10-ml- oder 50-ml-HARVs verwendet werden, je nachdem, wie viele Zellen benötigt werden, um nachgeschaltete experimentelle Assays durchzuführen, was im Abschnitt "Diskussion" näher erläutert wird. Die HARVs bestehen aus Polycarbonat und verfügen über eine Silikon-Oxygenierungsmembran, um den Gasaustausch während der Zellkultur zu ermöglichen. Dadurch wird der pH-Wert des Zellmediums aufrechterhalten und eine effiziente Zellatmung ermöglicht. An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich eine Hauptfüllöffnung und zwei Spritzenöffnungen mit Verschluss (Abbildung 2A). Nachdem die Zellkultur durch die Hauptfüllöffnung geladen wurde, werden zwei Spritzen auf das Gefäß geladen, um die Blasenentfernung zu unterstützen. Bei Verwendung der 10-ml-Gefäße funktionieren zwei 3-ml-Spritzen gut. Eine Spritze wird leer auf das Gerät aufgesteckt, wobei die Spritze vollständig niedergedrückt ist, und die andere wird mit 3 ml Zellkultur gefüllt (Abbildung 2E). Diese werden in Kombination verwendet, um Blasen aus dem Gefäß zu entfernen, was für die Aufrechterhaltung der SMG-Behandlung wichtig ist. Im Allgemeinen wird empfohlen, zwei Negativkontrollen einzurichten, die als "Flask"-Kontrolle und "1G"-Kontrolle bezeichnet werden können. Die "Flask"-Kontrolle entspricht Zellen, die in einem Standard-T25-Suspensionszellkulturkolben gezüchtet werden. Die 1G-Kontrolle entspricht Zellen, die in dem speziellen 10-ml-Kulturgefäß gezüchtet werden, das einfach in den Inkubator gelegt wird (d. h. ohne SMG-Behandlung). Weitere Informationen zu den Steuerelementen finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

Die hier beschriebene Methode eignet sich für jeden Forscher, der die Auswirkungen von SMG auf Lymphozyten untersuchen möchte, mit besonderem Fokus auf NK-Zellen unter Verwendung der NK92-Zelllinie¹³. Die Ergebnisse dieser Studien könnten uns helfen, die negativen Auswirkungen der Raumfahrt auf das menschliche Immunsystem besser zu verstehen und abzumildern.

Protocol

Anmerkungen: Die folgenden Schritte sollten in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Vorbereitung von Gefäßen für die Zellkultur

1. Nehmen Sie die Kulturgefäße aus der Plastikverpackung. Beschriften Sie jedes Gefäß am Rand entsprechend dem verwendeten Zelltyp/der Zelllinie, ob es sich um die Kontrolle (1G) oder die Behandlung (SMG) handelt, und alle anderen relevanten Informationen.
2. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Zapfen/O-Ring der Einfüllöffnung zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift/O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Entfernen Sie die Kappen nicht von den Spritzenanschlüssen.
   Anmerkungen: Wenn der Stift/O-Ring versehentlich berührt wird, sprühen Sie den Kappenstift mit 70%igem Ethanol ein und lassen Sie ihn einige Augenblicke (nach oben) stehen, während Sie das Gefäß füllen. Wenn Sie bereit sind, die Einfüllöffnung wieder zu schließen, nehmen Sie die Kappe mit einem frischen Papiertuch auf, um die Kappe gründlich zu trocknen, bevor Sie sie wieder auf das Gefäß setzen.
3. Befüllen Sie das Gefäß mit 10 ml des für die Zellkultur geeigneten Komplettmediums mit einer sterilen serologischen Pipette und setzen Sie die Kappe vorsichtig wieder auf die Einfüllöffnung.
   HINWEIS: Hier wurde die NK92 NK-Zelllinie verwendet, die in GM1-Medien kultiviert wurde, wie zuvor in einer klinischen Studie mit NK92-Zellen als Zelltherapie validiert wurde¹⁴. Welche Nährmedien verwendet werden, hängt von der zu kultivierenden Zelllinie oder dem Zelltyp ab. Bitte informieren Sie sich auf der Website des Anbieters über die richtige Medienrezeptur für die verwendete Zelllinie oder den verwendeten Zelltyp.
4. Stellen Sie sicher, dass die Kappen der Spritzenöffnungen und die Einfüllöffnung sicher verschlossen sind, und stellen Sie die gefüllten Gefäße in einen Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C und 5 % CO_2, während Sie die nachfolgenden Schritte zur Vorbereitung der Gefäße für die Zellkultur durchführen.
   Anmerkungen: Dieser Vorbereitungsschritt hilft, die Bildung großer Blasen zu minimieren, um das Ausstoßen von Blasen später in Schritt 6 zu erleichtern.

2. Vorbereitung der Stammzellkultur für den SMG-Behandlungsaufbau

1. Lagern Sie die interessierenden Zellen bei Nichtgebrauch bei einer Temperatur von weniger als -130 °C oder idealerweise in einer flüssigen Stickstoffdampfphase.
2. Tauen Sie die Zellen mindestens 1 Woche vor dem Einrichten der geplanten Behandlung auf und kultivieren Sie sie mit dem entsprechenden Rezept für Zellkulturmedien, das Sie auf der Website des Anbieters finden. Planen Sie, wie viele Zellen benötigt werden, um die Behandlung einzurichten (Details unten in den folgenden Schritten), und stellen Sie sicher, dass Sie die Kulturen früh genug beginnen, um eine ausreichende Proliferation und Anpassung an die Kultur zu ermöglichen.
3. Lagern Sie die Zellkultur in einem Inkubator mit 37 °C und 5 % CO₂ . Weitere Einzelheiten zur Standard-Zellkulturpraxis werden an anderer Stelle^{behandelt 15}.
4. Bestimmen Sie am Tag des geplanten SMG-Behandlungsaufbaus die Ausgangskonzentration und Lebensfähigkeit der ursprünglichen Zellkultur.
   1. Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration der Ausgangszellkultur (z. B. Hämozytometer, ViCell, Durchflusszytometrie usw.). Achten Sie auf die lebensfähige Zellkonzentration (Zellen pro ml) und die Lebensfähigkeit (%) der Zellen, um sicherzustellen, dass die Lebensfähigkeit idealerweise größer als 85 % ist. Ein Protokoll für die Verwendung eines Hämozytometers findet sich an anderer Stelle¹⁶.
5. Bestimmen Sie die geeignete Zellkeimdichte/-konzentration der Zellkultur für die SMG-Behandlung unter Berücksichtigung des optimalen Zellkonzentrationsbereichs des jeweiligen Zelltyps/der Zelllinie, ihrer Verdopplungszeit und der Dauer der SMG-Behandlung. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt "Diskussion".
   HINWEIS: Erfahrungsgemäß liegt der optimale Konzentrationsbereich für NK92-Zellen zwischen 0,3 x 10⁶ - 1,2 x 10⁶ Zellen/ml. In der Regel haben diese Zellen eine Verdopplungszeit von 48-72 h und werden als solche alle 2-3 Tage gefüttert. Da die Behandlungsdauer 72 h betrug, wurden die Zellen am unteren Ende ihres optimalen Bereichs bei 0,4-0,5 x 10⁶ Zellen/ml ausgesät. Der Lieferant empfiehlt diese Aussaatdichte auch, wenn die erste Zellkultur aus einem frischen Fläschchen mit NK92-Zellen gestartet wird.
6. Bestimmen Sie das Volumen der Stammzellkultur, das zum Einrichten der Behandlung und der Kontrollen benötigt wird.
   HINWEIS: Pro Versuchsgruppe werden 10 ml Zellkultur benötigt. Wenn drei Versuchsgruppen aufgebaut werden (d. h. eine Behandlung: "SMG" und zwei Negativkontrollen: "Flask" und "1G"), reichen weitere 10 ml Zellkultur aus, um in ein 15-ml-Röhrchen zu aliquotieren, das zum Laden der HAHR-Spritzen verwendet wird. Dies sind insgesamt 40 ml, die je nach spezifischem Versuchsaufbau schwanken können.
7. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen, die zum Einrichten der Behandlung benötigt werden.
   1. Berechnen Sie die Gesamtzahl der benötigten Zellen, indem Sie die gewählte Seeding-Dichte (Zellen/ml) mit dem benötigten Gesamtvolumen (ml) multiplizieren.
      HINWEIS: Aus Erfahrung mit NK92 werden 40 ml Stammzellkultur wie oben beschrieben bei einer Seeding-Konzentration von 0,4-0,5 x 10⁶ Zellen/ml hergestellt. Daher werden 16-20 x 10⁶ NK92-Zellen benötigt, um den typischen Behandlungsaufbau abzuschließen. Für die NK92-Zelllinie ist es besser, etwas mehr Zellen zu verwenden als etwas weniger Zellen, um eine hohe Lebensfähigkeit während der gesamten Behandlung aufrechtzuerhalten.
8. Bestimmen Sie das Volumen der anfänglichen Zellkultur, die heruntergedreht werden soll.
   1. Da die Zellkonzentration als Zellen/ml angegeben wird, teilen Sie die Gesamtzahl der für das Experiment benötigten Zellen (Zellen) durch die gemessene Startkonzentration der Zellkultur (Zellen/ml).
      Anmerkungen: Wenn z. B. 16 x 10 6 Zellen benötigt werden und die Anfangskonzentration der Kultur 0,8 x 10⁶ Zellen/ml beträgt, sollten 20 ml der Kultur heruntergeschleudert werden.
9. Stellen Sie die endgültige Zellkultur her.
   1. Zentrifugieren Sie die entsprechende Anzahl von Zellen bei 300 x g für 8 min in einem konischen 50-ml-Röhrchen.
   2. Gießen Sie den Überstand vorsichtig in einen Abfallbehälter und schnippen Sie vorsichtig mit dem Röhrchen, um das Pellet in dem kleinen Restvolumen wieder zu suspendieren.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen in der entsprechenden Menge des erwärmten (37 °C) Komplettmediums, um die Kultur auf die gewünschte Samendichte zu bringen. Dieses Volumen wurde in Schritt 2.6 berechnet.
   4. Verschließen Sie das 50-ml-Röhrchen fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um die Zellsuspension gründlich zu mischen.
      HINWEIS: Wenn mehr als 50 ml benötigt werden, um das gesamte Experiment aufzubauen, ist es am besten, die Gesamtzahl der Zellen, die in einem konischen 50-ml-Röhrchen benötigt werden, zu zentrifugieren und diese in der Hälfte des benötigten Volumens zu resuspendieren. Dann gut mischen und 1:2 in einem separaten konischen 50-ml-Röhrchen verdünnen. Wenn z. B. 100 ml bei 0,4 x 10 6 Zellen/ml benötigt werden, drehen Sie 40 x 10⁶ Zellen in einem 50-ml-Röhrchen herunter, resuspendieren Sie sie in 50 ml Medien, übertragen Sie 25 ml in ein anderes 50-ml-Röhrchen und füllen Sie dann beide mit 25 ml frischem Medium auf.

3. Beladung von Behältern mit Stammzellkultur

1. Entnehmen Sie die mediengrundierten Gefäße aus dem Inkubator.
2. Wenn eine "Flask"-Steuerung verwendet wird, laden Sie einen T25-Suspensionskulturkolben mit 10 ml Zellkultur aus dem oben vorbereiteten Bestand. Geben Sie außerdem 10 ml der Stammzellkultur in ein separates konisches 15-ml-Röhrchen, das zum Laden der Spritzen verwendet wird.
3. Schrauben Sie die Spritzenanschlusskappen ab, um sie aus dem Gefäß zu entfernen, und stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden (Abbildung 2C).
4. Stabilisieren Sie das Gefäß und öffnen Sie die Einfüllöffnung vorsichtig, ohne den Zapfen/O-Ring der Einfüllöffnung zu berühren. Setzen Sie die Kappe mit dem Stift/O-Ring nach oben auf ein Ethanolpad, während das Gefäß gefüllt wird. Schrauben Sie die Kappen vorsichtig von den Spritzenöffnungen ab.
5. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne in der geöffneten Position befinden (Abbildung 2C). Gießen Sie das Medium vorsichtig aus dem Gefäß in einen Abfallbehälter, entfernen Sie das Medium mit einer serologischen Pipette oder saugen Sie es mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas ab, die am Vakuumsystem befestigt ist, ohne die Sauerstoffversorgungsmembran zu berühren.
6. Verschließen Sie das konische 50-ml-Röhrchen, das die Stammzellkultur enthält, fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.
7. Ziehen Sie 10 ml Zellkulturvorrat aus dem 50-ml-Röhrchen mit einer frischen, sterilen serologischen Pipette auf. Nehmen Sie das Gefäß auf und kippen Sie es so, dass die Einfüllöffnung nach oben zeigt, und geben Sie dann die Zellkulturbrühe vorsichtig durch die Einfüllöffnung in das Gefäß ab.
   Anmerkungen: Seien Sie vorsichtig und achten Sie auf das Volumen, damit die Kultur beim Kippen des Gefäßes nicht durch die Spritzenöffnungen verschüttet wird.
8. Versuchen Sie, das Gefäß bis zum oberen Rand der Lippe der Einfüllöffnung zu füllen, ohne etwas zu verschütten. Kippen Sie das Gefäß während des Befüllens wieder nach unten, um ein Verschütten zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Sauerstoffmembran nicht mit der Pipette zu berühren, da diese sehr zerbrechlich ist.
   Anmerkungen: Das Befüllen des Gefäßes kann etwas Übung erfordern. Seien Sie geduldig und gehen Sie langsam vor. Wenn sich an der Öffnung der Einfüllöffnung ein Luftpolsterfilm bildet, stört dies das Beladen des Behälters. Schlagen Sie in diesem Fall vorsichtig auf das Gefäß, um die durch die Luftpolsterfolie erzeugte Versiegelung zu brechen.
9. Sobald das Gefäß beladen ist, setzen Sie die Kappe der Einfüllöffnung vorsichtig wieder auf und achten Sie darauf, dass Sie den Hering/O-Ring nicht berühren.
10. Auf die Spritzen legen.
    Anmerkungen: An der Vorderseite des Gefäßes befinden sich zwei Spritzenanschlüsse (Abbildung 2A). Einer enthält eine leere Spritze und der andere eine Spritze voller Zellkulturen (Abbildung 2E).
    1. Befestigen Sie zunächst die leere 3-ml-Spritze an einem der Spritzenanschlüsse und stellen Sie sicher, dass die Spritze vollständig niedergedrückt ist.
       Anmerkungen: Pumpen Sie die Spritzen einige Male, bevor Sie sie am Gefäß befestigen, da sie anfangs etwas fest sitzen. Tun Sie dies in der biologischen Sicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erhalten.
    2. Verschließen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit 10 ml aliquotierter Zellkultur fest und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um den Inhalt gründlich zu mischen.
    3. Tauchen Sie dann die zweite 3-ml-Spritze vorsichtig halb in die Zellkultur ein und ziehen Sie etwas Kultur auf. Um die Luftblase oben in der Spritze zu minimieren, geben Sie diese vollständig in das Röhrchen zurück und ziehen Sie dann 3 ml der Kultur auf.
    4. Befestigen Sie die gefüllte Spritze an der verbleibenden Spritzenöffnung und desinfizieren Sie die Spritzen vorsichtig und um die Füllöffnung herum mit einem Ethanolpad. Bringen Sie kein Ethanol auf die Sauerstoffversorgungsmembran. Jetzt ist das Gefäß bereit, um von Blasen befreit zu werden.
       Anmerkungen: Die zweite gefüllte Spritze für das zweite Gefäß ist aufgrund der Tiefe des 15-ml-Röhrchens schwieriger zu beladen. Es hilft, den Schlauch während des Befüllens der Spritze zu kippen, um die Abdichtung zwischen der zu füllenden Spritze und der Zellkultur aufrechtzuerhalten.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3-3.10 für die restlichen Gefäße. Wenn im konischen 50-ml-Röhrchen für das letzte Gefäß nicht genügend Zellkultur vorhanden ist (z. B. 9,5 ml statt 10 ml), gewinnen Sie die verbleibende Menge aus dem konischen 15-ml-Röhrchen zurück, das zum Laden der Spritzen verwendet wurde.
       HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen nicht in einer sterilen biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, da das Gefäß jetzt ein geschlossenes, steriles System ist.

4. Blasen aus den Gefäßen entfernen

Anmerkungen: Blasen sind in diesem Aufbau unvermeidlich und müssen während der gesamten Behandlung konsequent entfernt werden (Abbildung 3). Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

1. Stellen Sie sicher, dass sich die Absperrhähne der Spritzenöffnungen in der geschlossenen Position befinden (Abbildung 2D), um die Migration von Zellen und Blasen aus den Spritzen in die Gefäße zu begrenzen. Dies ist besonders später während der Behandlung wichtig (siehe unten). Um die ersten Blasen aufzufangen, drehen Sie das Gefäß auf den Kopf und schlagen Sie ein paar Mal auf die Seite.
2. Drehen Sie das Gefäß schnell wieder nach oben und dann in einem leichten Winkel nach oben, so dass die Blasen alle zur Oberseite des Gefäßes schwimmen (Abbildung 3B).
3. Manövrieren Sie die Blasen mit der leeren Spritze unter den Anschluss und beobachten Sie, wie sie beginnen, in den Anschluss einzudringen. Öffnen Sie beide Absperrhähne der Spritzenöffnungen (Abbildung 2C).
4. Schlagen Sie vorsichtig auf das Gefäß, damit die Blasen in die leere Spritze schwimmen können. Saugen Sie die größeren Blasen langsam mit der leeren Spritze auf, während Sie die volle Spritze vorsichtig nach unten drücken, um den Druck im Gefäß aufrechtzuerhalten, damit die Sauerstoffmembran nicht platzt.
   Anmerkungen: Größere Blasen müssen aufgesaugt werden, während kleine Blasen und Mikrobläschen dazu angeregt werden können, in die Spritze zu schwimmen, indem sie in die Spritzenöffnungen manövriert und sanft auf das Gefäß geschlagen werden. Nach einigen Stunden Behandlung ist es sehr wichtig, die "Kreuzkontamination" zwischen den Zellen in den Spritzen und den Zellen im Kulturgefäß zu minimieren. Dies liegt daran, dass die Zellen in den Spritzen nicht die gleiche Menge an Sauerstoff erhalten oder SMG ausgesetzt sind wie die Zellen im Gefäß.
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 einige Male, um sicherzustellen, dass alle Blasen entfernt sind. Entfernen Sie alle Blasen, einschließlich Mikrobläschen, aus den Gefäßen.
   Anmerkungen: Die Blasen sind durch die Sauerstoffversorgungsmembran (Rückseite des Gefäßes) leicht zu sehen, wenn das Gefäß auf eine Lichtquelle (Fenster, Licht usw.) gerichtet ist. Wenn Sie die Schritte 4.2 und 4.3 ausführen, schauen Sie sich die Blasen an, die sich von der Rückseite des Gefäßes bewegen, um die schwerer zu sehenden Blasen zu visualisieren.
6. Wenn die Blasen effektiv entfernt wurden, schließen Sie die Absperrhähne der Spritzenöffnungen. Lassen Sie die Spritzen während der Behandlung dran, um eine anschließende Blasenentfernung zu ermöglichen, und stellen Sie sicher, dass das Volumen in beiden Spritzen ungefähr gleich ist.

5. Befestigen des Gefäßes am drehbaren Sockel

1. Wischen Sie die Oberfläche des rotierenden Sockels und des Flachbandkabels vorsichtig mit 70 % Ethanol ab.
2. Stellen Sie sicher, dass das mitgelieferte Flachbandkabel an das Netzteil angeschlossen ist. Legen Sie den drehbaren Sockel in den Inkubator und befestigen Sie das Flachbandkabel am Sockel. Stellen Sie sicher, dass sich die Stromversorgung in der Nähe, aber außerhalb des Inkubators befindet. Abbildung 4 zeigt den rotierenden Sockel und die Stromversorgung für den Kontext.
3. Befestigen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie die Gefäßgewinde am rotierenden Stift ausrichten und den rotierenden Stift an der Basis vorsichtig gegen den Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie sicher, dass das Gefäß sicher befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass der Inkubator eine Luftfeuchtigkeit von nahezu 100 % beibehält, indem Sie die Wasserschale mit ausreichend autoklaviertem Umkehrosmosewasser (RO) füllen.
4. Wählen Sie eine geeignete Drehzahl (U/min). Passen Sie die Rotationsgeschwindigkeit an die Sedimentationsgeschwindigkeit der Zellen an, so dass die Zellen gar nicht erst "durch das Medium fallen", sondern sich in einer kleinen Umlaufbahn drehen. Dieses Phänomen ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
   HINWEIS: Das Unternehmen empfiehlt, die Rotation bei 8-10 U/min für Lymphozyten zu beginnen. In diesem Fall wurden NK92-Zellen mit 11 U/min gedreht, wie in einer früheren Arbeit¹⁷ gezeigt wurde. Je nach Zellgröße sollte die Drehzahl bei größeren Zellen erhöht und bei kleineren Zellen verringert werden. Das gleiche Muster gilt, wenn die verwendeten Zellen während der Kultivierung zum Verklumpen neigen. Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

6. Behandlung

1. Wählen Sie eine geeignete Behandlungsdauer für die Forschungsanwendung, die davon abhängen kann, welche Parameter der Zellfunktion/-physiologie untersucht werden. Weitere Informationen hierzu finden Sie im Abschnitt "Diskussion".
   HINWEIS: In diesem Fall wurden die NK92-Zellen einer 72-stündigen SMG-Behandlung unterzogen, basierend auf den Ergebnissen früherer Studien^18,19. Während der Behandlung bilden sich unweigerlich Blasen, die entfernt werden müssen. Um dies zu erleichtern, kann die Rotation kurzzeitig gestoppt und wieder gestartet werden. In Schritt 7.1 erfahren Sie, wie Sie das SMG-Gefäß sicher entfernen können.
2. Überprüfen Sie am ersten Tag der Behandlung alle paar Stunden, ob sich Blasen bilden, indem Sie die Schritte 4.2-4.6 wiederholen. Überprüfen Sie nach dem ersten Tag die Gefäße nach Bedarf (mindestens einmal täglich) und wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.6 bis zum Ende der Behandlung.

7. Entnahme von Zellen aus den Gefäßen

1. Sobald die geplante Behandlungslänge abgelaufen ist, stoppen Sie die Rotation und zerlegen Sie das Gerät. Entfernen Sie das SMG-Behandlungsgefäß, indem Sie das Gefäß vorsichtig stationär halten, während Sie den Drehstift des Geräts im Uhrzeigersinn drehen.
2. Bringen Sie den Kontrollkolben, das Kontrollgefäß 1G und das behandelte SMG-Gefäß in eine sterile biologische Sicherheitswerkbank.
3. Nimm jedes Gefäß (nur 1G und MP, nicht die Flasche) und drehe es auf den Kopf, so dass es nach unten zeigt, und schlage vorsichtig darauf, um alle Zellen in Suspension zu bringen. Drehen Sie dann das Gefäß mit der Einfüllöffnung nach unten auf die Seite und schlagen Sie erneut auf das Gefäß, um die Zellen für eine effiziente Aspiration in Richtung der Einfüllöffnung zu ermutigen.
4. Behandeln Sie jedes Gefäß einzeln. Schrauben Sie die Spritzen von den beiden Anschlüssen ab und entsorgen Sie sie im Bioabfall. Öffnen Sie die Absperrhähne an den Spritzenöffnungen.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Kappe der Einfüllöffnung und ziehen Sie den Inhalt mit einer sterilen serologischen 10-ml-Pipette auf, wobei Sie das Gefäß kippen, während es entleert wird. Geben Sie den Inhalt der Gruppen "Flask", "1G" und "SMG" in einzeln beschriftete konische 15-ml-Röhrchen ab.
6. Schließen Sie jedes Röhrchen und drehen Sie es einige Male vorsichtig um, um sicherzustellen, dass sie richtig gemischt sind. Verwenden Sie die bevorzugte Methode zur Bestimmung der Konzentration und Lebensfähigkeit der resultierenden Zellkultur, um sie für die Verwendung in nachfolgenden experimentellen Assays vorzubereiten.

Results

Diese Kultivierungsmethode gilt als erfolgreich, wenn 1) die Proliferation der Zellen in allen Kontrollgruppen (und idealerweise in allen Versuchsgruppen) annähernd konsistent ist, 2) die Proliferation angesichts der Aussaatdichte, der Behandlungsdauer und der Verdopplungszeit des Zelltyps/der Zelllinie angemessen ist und 3) die Lebensfähigkeit der geernteten Zellen 85 % oder mehr beträgt (Tabelle 1 ). Idealerweise sollten die resultierenden Zellen so gesund sein wie in einer Standardzellkultur, insbeson...

Discussion

Während sich die Menschheit auf längere Weltraummissionen zu Mond und Mars vorbereitet, muss mehr Forschung betrieben werden, um ernsthafte Gesundheitsrisiken bei Astronauten zu mindern. Ein wichtiger Aspekt der Weltraumumgebung, der sich auf die menschliche Physiologie auswirkt, ist die Schwerelosigkeit. Hier wurde ein Zellkulturverfahren beschrieben, um Lymphozyten mit einem kommerziell erhältlichen rotierenden Zellkultursystem einem SMG zu unterziehen.

Dieses Protokoll enthält einige wichti...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Einweggefäß mit hohem Aspektverhältnis (HARV) (10 mL)	Synthecon	D-410	Gamma-sterilisierte Kulturgefäße (4/Karton)
Luer-Lok-Spitzenspritzen (3 mL)	BD	309657	Zum Befestigen an den 10-ml-HARVs
NK92 Zelllinien-ATCC		CRL-2407
Rotations-Zellkultursystem (RCCS)	Synthecon	RCCS-4D	Drehwandgefäß-Gerät; 2D-Klinostat
Sarsedt 15 mL konische Röhrchen	Fisher Scientific	50-809-220
Sarsedt 50 mL konische Röhrchen	Fisher Scientific	50-809-218
Sarsedt sterile serologische Pipetten	Fisher Scientific	86.1254.001
T25 Suspensionskulturflaschen	Sarsedt	83.3910.502	Für die Kontrolle von Kolben