Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.
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Methodenartikel
Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) sind ein hervorragendes Werkzeug, um die frühe Pankreasentwicklung zu untersuchen und die genetischen Beiträge zu Diabetes zu untersuchen. hPSC-abgeleitete insulinsekretierende Zellen können für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung erzeugt werden, jedoch mit begrenzter Effizienz und funktionellen Eigenschaften. hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Vorläufer von Betazellen und anderen endokrinen Zellen sind, spezifizieren, wenn sie die beiden Transkriptionsfaktoren PDX1 und NKX6.1 co-exprimieren, die Vorläuferzellen zu funktionellen, Insulin-sezernierenden Betazellen sowohl in vitro als auch in vivo. hPSC-abgeleitete Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse werden derzeit im Rahmen klinischer Studien für die Zelltherapie bei Typ-1-Diabetes-Patienten eingesetzt. Aktuelle Verfahren erzeugen jedoch keinen hohen Anteil an NKX6.1 und Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, was zu einer Kogeneration von nicht-funktionellen endokrinen Zellen und wenigen Glukose-responsiven, Insulin-sekretierenden Zellen führt. Diese Arbeit entwickelte daher ein verbessertes Protokoll zur Erzeugung von hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern, die die Koexpression von PDX1 und NKX6.1 in einer 2D-Monoschicht maximieren. Die Faktoren wie Zelldichte, Verfügbarkeit frischer Matrix und Dissoziation von hPSC-abgeleiteten endodermalen Zellen werden moduliert, wodurch PDX1- und NKX6.1-Spiegel in den erzeugten Pankreas-Vorläuferzellen erhöht und die Verpflichtung zur alternativen hepatischen Linie minimiert wird. Die Studie zeigt, dass die Manipulation der physischen Umgebung der Zelle während der In-vitro-Differenzierung die Spezifikation der Abstammungslinie und die Genexpression beeinflussen kann. Daher ermöglicht das derzeit optimierte Protokoll die skalierbare Generierung von PDX1- und NKX6.1-co-exprimierenden Vorläuferzellen für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung.
Einleitung
Diabetes ist eine komplexe Stoffwechselstörung, von der Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Die Supplementierung von Insulin gilt als einzige Behandlungsoption für Diabetes. Fortgeschrittenere Fälle werden mit einer Betazellersatztherapie behandelt, die durch Transplantation entweder der ganzen Kadaver-Bauchspeicheldrüse oder der Inselnerreicht wird 1,2. Mehrere Probleme umgeben die Transplantationstherapie, wie die Einschränkung der Verfügbarkeit und Qualität des Gewebes, die Invasivität von Transplantationsverfahren sowie der kontinuierliche Bedarf an Immunsuppressiva. Dies erfordert die Entdecku....
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Protokoll
Die Studie wurde von der zuständigen institutionellen Forschungsethikkommission genehmigt und nach den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der HMC (Nr. 16260/16) und dem Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (Nr. 2016-003) genehmigt. Diese Arbeit ist für hESCs wie H1, H9 und HUES8 optimiert. Blutproben wurden von gesunden Personen aus dem Krankenhaus der Hamad Medical Corporation (HMC) mit voller Einwilligung nach Aufklärung entnommen. Die iPS-Zellen werden aus peripheren mononuk....
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Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, dass das optimierte Protokoll P2-D (Abbildung 1A) die Differenzierungseffizienz der Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse durch Hochregulierung der PDX1- und NKX6.1-Koexpression verbesserte (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A). Insbesondere zeigten die Ergebnisse, dass die Dissoziation endodermaler Zellen und ihre Replattierung auf frischer Membranmatrix zusammen mit einer längeren Dauer von St.......
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Diskussion
Diese Arbeit beschreibt ein erweitertes Protokoll zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen aus hPS-Zellen mit einer hohen Co-Expression von PDX1 und NKX6.1. Die Dissoziation und Replattierung des hPSC-abgeleiteten Endoderms bei halber Dichte auf frischer Matrix führte zu einem höheren PDX1 und NKX6.1 in hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern.
Obwohl der Wachstumsfaktor-Cocktail für jedes Stadium P1-ND 27 sehr ähnlich ist, wurde gezeigt, dass eine erweiterte Behandlung im Stadium 3, einschließl.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Grant No. NPRP10-1221-160041).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15 mL, konisch, Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 339651 | |
| 20X TBS Tween 20 | Thermo Scientific | 28360 | |
| 24-Well-Kulturplatten, flacher Boden mit Deckel | Costar | 3524 | |
| 50 mL, konisch, Zentrifugenröhrchen | Thermo Scientific | 339652 | |
| 6-Well-Kulturplatten, multiserviert | Thermo Scientific | ||
| Accutase | Stem Cell Technologies | 0-7920 | |
| Activin A | R& D | 338-AC | Rekonstituiert in 4 mM HCl |
| Anti NKX6.1 Antikörper, monoklonaler | Maus DSHB | F55A12-C | Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:2000 für immunfärbende |
| Anti-PDX1 Antikörper, Meerschweinchen polyklonaler | Abcam | ab47308 | Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:1000 für die Immunfärbung |
| B27 minus Vit A | ThermoFisher | 12587010 | |
| Rinderserumalbumin, Hitzeschockfraktion, fettsäurefrei | Sigma | A7030 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | Rekonstituiert in DMSO |
| DMEM, | ThermoFisher | 41965047 | |
| Donkey Anti-Maus IgG (H + L) hoch kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | |
| Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 | A-21206 | ||
| DPBS 1X | ThermoFisher | 14190144 | |
| EGF | ThermoFisher | PHG0313 | rekonstituiert in 0,1 % BSA in PBS |
| FGF10 | R& D | 345-FG | Rekonstituiert in PBS |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8644 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 23491-45-4 | |
| Inverses | Mikroskop Olympus | IX73 | |
| KnockOut DMEM/F-12 (1X) | Gibco | 12660-012 | |
| KnockOut SR Serumersatz | Gibco | 10828-028 | |
| L-Ascorbinsäure (Vitamin C) | Sigma | A92902 | Rekonstituiert in destilliertem Wasser |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran Matrix | Corning | 354230 | Aliquotieren Sie die aufgetaute Brühe und frieren Sie sie bei -20 °C ein. |
| MCDB131 | ThermoFisher | 10372019 | |
| Maus Anti-SOX17 | ORIGENE | CF500096 | Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:2000 für die Immunfärbung |
| mTeSR Plus | Stem Cell Technologies | 85850 | Mischen Sie das Basalmedium mit Zusatz. Aliquotieren und bei -20 Grad lagern; C für längere Zeit oder bei 4 & Grad; C für den sofortigen Einsatz |
| Nalgene Filtereinheiten, 0,2 & Mikro; m PES | ThermoFisher | 566-0020 | |
| Nicotinamid | Sigma | 72340 | Rekonstituiert in destilliertem Wasser |
| NOGGIN | R& D | 6057-NG | Rekonstituiert in 0,1 % BSA in |
| 4 % in PBS | ChemCruz | sc-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | ThermoFisher | 15140122 | |
| Tragbarer Vakuumsauger | |||
| Kaninchen-Anti-FOXA2-Zellsignaltechnologie | 3143 | Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:500 für Immunfärbung | |
| Retinsäure | Sigma Aldrich | R2625 | Rekonstituiert in DMSO |
| Rock-Inhibitor (Y-27632) | ReproCell | 04-0012-02 | Rekonstituiert in DMSO |
| FACS Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappen, STERIL | Stellar Scientific | FSC-9010 | |
| SANT-1 | Sigma Aldrich | S4572 | Rekonstituiert in DMSO-Natrium |
| Bicarbonat | Sigma | S5761-500G | |
| StemFlex | ThermoFisher | A3349401 | Mischen Sie das Basalmedium mit Ergänzung. Aliquotieren und bei -20 Grad lagern; C für längere Zeit oder bei 4 & Grad; C für den sofortigen Gebrauch |
| TALI Cellular Analysis Slide | Invitrogen | T10794 | |
| Tali bildbasiertes Zytometer automatisierter Zellzähler | Invitrogen | T10796 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| TrypLE 100 mL | ThermoFisher | 12563011 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575-038 |
Referenzen
- Rickels, M. R., Robertson, R. P. Pancreatic islet transplantation in humans: Recent progress and future directions. Endocrine Reviews. 40 (2), 631-668 (2019).
- Latres, E., Finan, D. A., Greenstein, J. L., Kowalski, A., Kieffer, T. J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
