Methodenartikel

Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse in einem 2D-Kultursystem

DOI:

10.3791/63298

⸱

16. Dezember 2021

 , 
1College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation, 2Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorliegende Protokoll beschreibt eine verbesserte Methode zur Erhöhung der Koexpression von PDX1- und NKX6.1-Transkriptionsfaktoren in Pankreas-Vorläuferzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPS-Zellen) in planaren Monoschichten. Dies wird erreicht, indem die frische Matrix aufgefüllt, die Zelldichte manipuliert und die endodermalen Zellen dissoziiert werden.

Zusammenfassung

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Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) sind ein hervorragendes Werkzeug, um die frühe Pankreasentwicklung zu untersuchen und die genetischen Beiträge zu Diabetes zu untersuchen. hPSC-abgeleitete insulinsekretierende Zellen können für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung erzeugt werden, jedoch mit begrenzter Effizienz und funktionellen Eigenschaften. hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Vorläufer von Betazellen und anderen endokrinen Zellen sind, spezifizieren, wenn sie die beiden Transkriptionsfaktoren PDX1 und NKX6.1 co-exprimieren, die Vorläuferzellen zu funktionellen, Insulin-sezernierenden Betazellen sowohl in vitro als auch in vivo. hPSC-abgeleitete Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse werden derzeit im Rahmen klinischer Studien für die Zelltherapie bei Typ-1-Diabetes-Patienten eingesetzt. Aktuelle Verfahren erzeugen jedoch keinen hohen Anteil an NKX6.1 und Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, was zu einer Kogeneration von nicht-funktionellen endokrinen Zellen und wenigen Glukose-responsiven, Insulin-sekretierenden Zellen führt. Diese Arbeit entwickelte daher ein verbessertes Protokoll zur Erzeugung von hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern, die die Koexpression von PDX1 und NKX6.1 in einer 2D-Monoschicht maximieren. Die Faktoren wie Zelldichte, Verfügbarkeit frischer Matrix und Dissoziation von hPSC-abgeleiteten endodermalen Zellen werden moduliert, wodurch PDX1- und NKX6.1-Spiegel in den erzeugten Pankreas-Vorläuferzellen erhöht und die Verpflichtung zur alternativen hepatischen Linie minimiert wird. Die Studie zeigt, dass die Manipulation der physischen Umgebung der Zelle während der In-vitro-Differenzierung die Spezifikation der Abstammungslinie und die Genexpression beeinflussen kann. Daher ermöglicht das derzeit optimierte Protokoll die skalierbare Generierung von PDX1- und NKX6.1-co-exprimierenden Vorläuferzellen für die Zelltherapie und Krankheitsmodellierung.

Einleitung

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Diabetes ist eine komplexe Stoffwechselstörung, von der Millionen von Menschen weltweit betroffen sind. Die Supplementierung von Insulin gilt als einzige Behandlungsoption für Diabetes. Fortgeschrittenere Fälle werden mit einer Betazellersatztherapie behandelt, die durch Transplantation entweder der ganzen Kadaver-Bauchspeicheldrüse oder der Inselnerreicht wird 1,2. Mehrere Probleme umgeben die Transplantationstherapie, wie die Einschränkung der Verfügbarkeit und Qualität des Gewebes, die Invasivität von Transplantationsverfahren sowie der kontinuierliche Bedarf an Immunsuppressiva. Dies erfordert die Entdeckung neuer und alternativer Optionen für die Betazellersatztherapie 2,3. Humane pluripotente Stammzellen (hPS-Zellen) haben sich kürzlich als vielversprechendes Werkzeug für das Verständnis der menschlichen Pankreasbiologie und als nicht erschöpfende und potenziell personalisiertere Quelle für die Transplantationstherapie erwiesen 4,5,6,7. hPS-Zellen, einschließlich humaner embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und human-induzierter pluripotenter Stammzellen (hiPS-Zellen), haben eine hohe Selbsterneuerungskapazität und führen zu jedem Gewebetyp des menschlichen Körpers. hES-Zellen werden aus der inneren Zellmasse des Embryos abgeleitet, und hiPS-Zellen werden aus jeder somatischen Zelleumprogrammiert 4,8.

Gerichtete Differenzierungsprotokolle sind optimiert, um Betazellen der Bauchspeicheldrüse aus hPS-Zellen zu erzeugen, die hPS-Zellen invitro sequentiell durch pankreas-Entwicklungsstadien leiten. Diese Protokolle erzeugen hPSC-abgeleitete Inselorganoide. Während sie den Anteil der Betazellen der Bauchspeicheldrüse stark verbessert haben, ist die Effizienz der Protokolle sehr variabel. Es steigt nicht auf mehr als ~40% von NKX6.1+/INSULIN+ oder C-PEPTIDE + Zellen 5,9,10,11,12,13. Die erzeugten Betazellen sind jedoch hinsichtlich ihrer transkriptionellen und metabolischen Profile und ihrer Reaktion auf Glukose 4,5,14 nicht vollständig identisch mit den adulten menschlichen Betazellen. Den hPSC-abgeleiteten Betazellen fehlt die Genexpression von wichtigen Betazellmarkern wie PCSK2, PAX6, UCN3, MAFA, G6PC2 und KCNK3 im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Inseln5. Darüber hinaus haben die hPSC-abgeleiteten Betazellen eine verminderte Kalziumsignalisierung als Reaktion auf Glukose. Sie sind mit den kogenerierten polyhormonellen Zellen kontaminiert, die als Reaktion auf steigende Glukosespiegelkeine angemessenen Mengen an Insulin absondern5. Auf der anderen Seite könnten hPSC-abgeleitete Pankreas-Vorläuferzellen, die Inselvorläufer sind, in vitro effizienter erzeugt werden als Betazellen und könnten, wenn sie in vivo transplantiert werden, zu funktionellen, Insulin-sekretierenden Betazellen heranreifen15,16. Klinische Studien konzentrieren sich derzeit darauf, ihre Sicherheit und Wirksamkeit bei der Transplantation bei T1D-Probanden nachzuweisen.

Insbesondere die Expression der Transkriptionsfaktoren PDX1 (Pankreas- und Zwölffingerdarm-Homöobox 1) und NKX6.1 (NKX6 Homöobox 1) innerhalb derselben Pankreas-Vorläuferzelle ist entscheidend für das Engagement für eine Betazelllinie5. Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse, die NKX6.1 nicht exprimieren, führen zu polyhormonellen endokrinen Zellen oder nicht-funktionellen Betazellen17,18. Daher ist eine hohe Co-Expression von PDX1 und NKX6.1 im Pankreas-Vorläuferstadium essentiell, um letztendlich eine große Anzahl funktioneller Betazellen zu erzeugen. Studien haben gezeigt, dass ein embryoider Körper oder eine 3D-Kultur PDX1 und NKX6.1 in Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse verstärkt, bei denen die differenzierenden Zellen aggregiert sind, wobei sie zwischen 40% und 80% der PDX1+/NKX6.1+-Populationvariieren 12,19. Im Vergleich zu Suspensionskulturen sind 2D-Differenzierungskulturen jedoch kostengünstiger, praktikabler und bequemer für die Anwendung auf mehreren Zelllinien5. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Monolayer-Differenzierungskulturen mehr als bis zu 90% der PDX1+/NKX6.1+ co-exprimierenden hPSC-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen20,21,22 liefern. Die berichtete Methode verlieh den erzeugten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse eine hohe Replikationskapazität und verhinderte alternative Schicksalsspezifikationen wie die hepatische Linie21. Daher demonstriert dieses Protokoll hierin eine hocheffiziente Methode zur Differenzierung von hPSCs zu Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse, die PDX1 und NKX6.1 koexprimieren. Diese Methode verwendet die Technik der Dissoziation von hPSC-abgeleitetem Endoderm und der Manipulation der Zelldichte, gefolgt von einer erweiterten FGF- und Retinoid-Signalisierung sowie einer Hedgehog-Hemmung, um die PDX1- und NKX6.1-Koexpression zu fördern (Abbildung 1). Diese Methode kann eine skalierbare Generierung von hPSC-abgeleiteten Betazellvorläufern der Bauchspeicheldrüse für die Transplantationstherapie und Krankheitsmodellierung ermöglichen.

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Protokoll

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Die Studie wurde von der zuständigen institutionellen Forschungsethikkommission genehmigt und nach den ethischen Standards durchgeführt, die in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der HMC (Nr. 16260/16) und dem Qatar Biomedical Research Institute (QBRI) (Nr. 2016-003) genehmigt. Diese Arbeit ist für hESCs wie H1, H9 und HUES8 optimiert. Blutproben wurden von gesunden Personen aus dem Krankenhaus der Hamad Medical Corporation (HMC) mit voller Einwilligung nach Aufklärung entnommen. Die iPS-Zellen werden aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) des kontrollierten, gesunden Individuums23 erzeugt.

1. Vorbereitung der Kulturmedien

  1. Herstellung von Kulturmedien für humane pluripotente Stammzellen (hPSC)
    1. Herstellung von hPSC-Kulturmedien aus dem kommerziell erhältlichen Medium zur Erhaltung und Erweiterung humaner embryonaler Stammzellen durch Ergänzung von 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin (siehe Materialtabelle). Aliquot und lagern Sie das komplette Medium bei -20 °C für die Langzeit oder 4 °C für den sofortigen Gebrauch.
  2. Bereiten Sie Differenzierungsmedien der Stufe 1 vor (für Definitive Endoderm (DE)).
    1. Bereiten Sie Basalmedien aus MCDB 131-Medien durch Ergänzung mit 0,5% fettsäurefreiem Rinderserumalbumin (FFA-BSA), 1,5 g / L Natriumbicarbonat (NaHCO3), 10 mM Glukose, 2 mM Glutamax, 100 Einheiten / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin vor (siehe Tabelle der Materialien). Die vorbereiteten Medien mit einem 0,2 μm Filter filtrieren und bei 4 °C lagern.
    2. Medium der Stufe 1, das CHIR99021 enthält, aus dem Basalmedium (hergestellt in Schritt 1.2.1) herstellen, indem das Basalmedium bei 37 °C erwärmt und anschließend mit 2 μM CHIR99021, 100 ng/ml Activin A, 10 μM Rockinhibitor (Y-27632) und 0,25 mM Vitamin C ergänzt wird (siehe Materialtabelle). Mischen Sie das ergänzte Medium gut und bedecken Sie es mit Aluminiumfolie, um es vor Licht zu schützen.
      HINWEIS: Dieses Medium wird nur am ersten Tag der Differenzierung verwendet.
    3. Bereiten Sie Medium der Stufe 1 ohne CHIR99021 aus dem Basalmedium vor, indem Sie es bei 37 °C erwärmen und mit 100 ng/ml Activin A und 0,25 mM Vitamin C ergänzen und gut mischen.
      HINWEIS: 5 ng/ml Basis-FGF oder FGF2 können optional zu diesem Medium hinzugefügt werden. Dieses Medium wird für die verbleibenden Tage von Stufe 1 verwendet.
  3. Bereiten Sie Differenzierungsmedien der Stufe 2 vor (für primitive Darmröhre; PGT).
    1. Herstellen Sie Stufe 2 Differenzierungsmedien, die Rockinhibitor aus den Basalmedien enthalten, indem Sie sie bei 37 °C erwärmen und mit 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 μM CHIR99021, 10 μM Y-27632 (Rockinhibitor) und 0,25 mM Vitamin C ergänzen.
      HINWEIS: Dieses Medium wird am Tag der Dissoziation von endodermalen Zellen verwendet.
    2. Stufe 2 Differenzierungsmedien ohne Rockinhibitor werden nach dem gleichen Verfahren für die in Schritt 1.3.1 hergestellten Medien hergestellt, mit Ausnahme des Rockinhibitors.
      HINWEIS: Dieses Medium wird am zweiten Tag von Stufe 2 verwendet.
  4. Bereiten Sie Differenzierungsmedien der Stufe 3 vor (für den hinteren Vorderdarm).
    1. Bereiten Sie DMEM-Medien mit 4,5 g / L Glukose vor, ergänzen Sie dann mit 1% Penicillin-Streptomycin und 2 mM Glutamax und verwenden Sie es als Basalmedium für die Stadien 3 und 4.
    2. Erwärmen Sie das DMEM-Medium (hergestellt in Schritt 1.4.1) und ergänzen Sie es mit 2 μM Retinsäure, 0,25 μM SANT-1, 50 ng/ml FGF10, 50 ng/ml NOGGIN, 0,25 mM Vitamin C und 1% B27-Ergänzung ohne Vitamin A (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Dieses Medium wird für 4 Tage von Stufe 3 für P2-D (Protokoll 2, optimiert, dissoziiert) und 2 Tage von Stufe 3 für P1-ND (Protokoll 1, nicht optimiert, nicht dissoziiert) verwendet.
  5. Bereiten Sie Differenzierungsmedien der Stufe 4 vor (für Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse).
    1. Fügen Sie DMEM mit 4,5 g / L Glukose mit 100 ng / ml EGF, 10 mM Nicotinamid, 50 ng / ml NOGGIN, 0,25 mM Vitamin C und 1% B27-Ergänzung ohne Vitamin A hinzu (siehe Materialtabelle). Verwenden Sie dieses Medium für alle Tage von Stufe 4.
      HINWEIS: Halten Sie alle Reagenzien auf geeigneten Temperaturen, und alle Zytokine und empfindlichen Reagenzien müssen aliquotiert werden. Die aliquotierten Reagenzien auftauen und den basalen Medien zum Zeitpunkt des Wechsels der Differenzierungsmedien hinzufügen. Die Zusammensetzungen der verschiedenen Differenzierungsmedien sind in Tabelle 1 aufgeführt.

2. Herstellung von mit Basalmembranmatrix beschichteten Schalen

  1. handelsübliche Kellermatrix (siehe Materialtabelle) und aliquot auf Eis auftauen; Die Aliquots werden bei -20 °C eingefroren.
  2. Bevor Sie die Gewebekulturschalen beschichten, tauen Sie die gefrorenen Aliquots auf Eis auf. Fügen Sie dem gekühlten KO-DMEM/F-12-Medium (KnockOut DMEM/F-12) ein geeignetes Volumen der Membranmatrixlösung hinzu (siehe Materialtabelle), um die gewünschte verdünnte Konzentration zu erreichen und gut zu mischen. Lagern Sie die verdünnte Matrixlösung zur sofortigen Verwendung bei 4 °C.
  3. Die Oberfläche der mit Gewebekulturen behandelten Platten (siehe Materialtabelle) wird mit verdünnter Membranmatrixlösung bedeckt und die Platten mindestens 60 min lang bei 37 °C platziert, bevor die Zellen plattiert werden. Verwenden Sie eine Verdünnung von 1:50 der Membranmatrixlösung in KO-DMEM/F-12 für die Beschichtung von Zellen für das Pankreasdifferenzierungsexperiment und 1:80 für die Expansion undifferenzierter hPSCs.

3. Kultur undifferenzierter hPSC

  1. Passieren Sie die hPSCs, wenn die Kolonien einen Zusammenfluss von 70% -80% erreichen.
  2. Zum Durchgang waschen Sie die hPSCs einmal mit warmem PBS, saugen Sie sie mit einem tragbaren Vakuumsauger in der Gewebekulturhaube ab und fügen Sie 0,5 mM EDTA-Lösung in PBS hinzu, um die Oberfläche der Kolonie zu bedecken. Bei 37 °C, 5%CO2 für 1 min inkubieren oder bis sich die Ränder der Kolonien von der Plattenoberfläche lösen.
  3. Entfernen Sie die EDTA-Lösung und sammeln Sie die ablösenden Kolonien mit hPSC-Kulturmedium unter Verwendung einer P1000-Mikropipette. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen bei 128 x g für 4 min bei Raumtemperatur. Der Überstand ist zu verwerfen und die Zellen mit hPSC-Kulturmedien zu ergänzen, die 10 μM Y-27632 (Rockinhibitor)23,24 enthalten.
    HINWEIS: Durchlassung der hPSCs in mindestens einem Verhältnis von 1:3 auf 1:80 Membranmatrix-beschichteten Schalen. Für Differenzierungsexperimente werden die hPSCs jedoch auf 1:50 beschichtetem Geschirr angerichtet.

4. Induktion der definitiven Endoderm (DE)-Differenzierung in hPS-Zellen (Stufe 1)

  1. Wenn die hPSC-Kolonien einen Zusammenfluss von 70% -80% erreichen, waschen Sie sie zweimal mit warmem PBS und saugen Sie sie mit einem tragbaren Vakuumsauger in der Gewebekulturhaube ab, um mit der Differenzierung der Stufe 1 zu beginnen.
  2. Stufe 1 Differenzierungsmedium, das CHIR99021 (aus Schritt 1.2.2) enthält, in die Kolonien geben, 2 ml pro 6-Well-Platte, und bei 37 °C für 24 h inkubieren.
  3. Ersetzen Sie am nächsten Tag die verbrauchten Medien durch ein Differenzierungsmedium der Stufe 1 ohne CHIR99021 (Schritt 1.2.3).
  4. Alle 24 Stunden saugen Sie die verbrauchten Medien mit einem tragbaren Vakuumsauger in der Gewebekulturhaube ab und ersetzen Sie sie durch ein frisches Differenzierungsmedium der Stufe 1 ohne CHIR99021.
    HINWEIS: Stufe 1 kann auf bis zu 4 Tage verlängert werden. Die Länge von Stufe 1 ist abhängig von der verwendeten hPSC-Leitung und sollte entsprechend optimiert werden.

5. Immunfluoreszenzanalyse von hPSC-abgeleitetem DE (Stufe 1)

  1. Für die Immunfluoreszenz saugen Sie die verbrauchten Medien mit einem tragbaren Vakuumsauger in der Gewebekulturhaube aus den Vertiefungen ab und waschen Sie zweimal mit warmem PBS. Schwenken Sie die Platte, um Zelltrümmer loszuwerden.
  2. Bedecken Sie die Oberfläche der Vertiefungen mit 4% Paraformaldehyd (PFA), um die DE-Zellen zu fixieren; Fügen Sie beispielsweise 250 uL PFA pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu. Legen Sie die Platte für 20 min auf einen 2D-Shaker bei 20 x g .
  3. Nach der Fixierung die DE-Zellen mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,5% Tween (TBST) waschen (siehe Materialtabelle) und die Platte bei 20 x g für 10 min auf den Shaker legen. Wiederholen Sie diesen Schritt erneut.
  4. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen durch Zugabe eines großzügigen Volumens phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5% Triton X-100 (PBST); Geben Sie beispielsweise 1 ml PBST pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu und legen Sie die Platte bei 20 x g für 20 Minuten wieder auf den Shaker.
  5. Bereiten Sie 5% -6% BSA in PBST als blockierenden Puffer frisch vor und fügen Sie es den permeabilisierten Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Platte für mindestens 1 h in der blockierenden Lösung auf dem Schüttler.
  6. Die primären Antikörper gegen SOX17 und FOXA2 zusammen (siehe Materialtabelle) in 2%-3% BSA in PBST-Lösung verdünnen. Geben Sie die kombinierten Antikörper zu blockierten Zellen und legen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C bei niedriger Geschwindigkeit unter leichtem Schütteln auf den Shaker.
    HINWEIS: SOX17 und FOXA2 sind etablierte DE-Marker25,26.
  7. Am nächsten Tag saugen Sie die primären Antikörper mit einem tragbaren Vakuumfilter ab und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit TBST, jeweils 10 Minuten auf dem Shaker.
  8. Bereiten Sie eine 1:500-Verdünnung von Alexa fluor 488- und 568-konjugierten sekundären Antikörpern (siehe Materialtabelle) gegen die Spezies vor, in der die primären Antikörper hochgezogen wurden.
  9. Fügen Sie die sekundäre Antikörperkombination in die gefärbte Vertiefung und bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um sie vor Licht zu schützen. Stellen Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur auf den Shaker.
  10. Die sekundäre Antikörperlösung mit einem tragbaren Vakuumfilter absaugen und die gefärbten Vertiefungen mit TBST auf dem Schüttler 10 min lang waschen, wobei die Platte mit Folie abgedeckt wird. Wiederholen Sie den Waschschritt insgesamt dreimal.
  11. Bereiten Sie eine 1 μg/ml Hoechst 33342 Verdünnung in PBS vor, um die Kerne zu färben. Die Hoechst-Lösung in die Vertiefungen geben und die Platte für 2-3 min auf den Shaker legen.
  12. Saugen Sie die Hoechst-Lösung mit einem tragbaren Vakuumfilter ab und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS ab.
  13. Fügen Sie schließlich PBS zu den gefärbten Zellen hinzu und bilden Sie sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) im Dunkeln ab. Halten Sie die Platte mit Folie bedeckt, wenn Sie nicht abbilden, um die Fluorophorbleiche zu minimieren.
    HINWEIS: Alternativ kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die DE-Effizienz wie in Schritt 9.2 beschrieben zu bewerten.

6. Erzeugung der primitiven Darmröhre (PGT) aus hPSCs (Stufe 2)

HINWEIS: Wenn die Immunfluoreszenzanalyse in Schritt 5.13 als SOX17-FOXA2-Coexpression von 80% und höher bestimmt wird, fährt das Experiment mit Stufe 2 fort. Wenn der Wirkungsgrad <80% beträgt, verlängern Sie die Dauer von Stufe 1 auf 4 Tage.

  1. Am Tag 1 von Stufe 2 dissoziieren Sie die hPSC-abgeleiteten endodermalen Zellen mit TrypLE oder Accutase (siehe Materialtabelle) für das optimierte P2-D-Protokoll. Waschen Sie die adhärenten Zellen mit warmem PBS und fügen Sie warme 1 ml TrypLE- oder Accutase-Lösung pro Vertiefung einer 6-Well-Platte für 3-5 min bei 37 °C, 5%CO2 hinzu oder bis sich die Zellen voneinander zu lösen beginnen.
  2. Dissoziieren Sie die abgelösten Schichten oder Monoschichten von Zellen in den Vertiefungen und sammeln Sie sie dann zusammen in einem 15-ml-Polypropylenröhrchen unter Verwendung basaler Medien der Stufe 1/2 ohne Zytokine, die mindestens 0,5% entweder fetales Rinderserum (FBS) oder KnockOut-Serum (KOSR) enthalten (siehe Materialtabelle).
  3. Die Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C herunterdrehen und den Überstand verwerfen. Fügen Sie 1 ml steriles PBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet in einzelne Zellen.
  4. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zähler (siehe Materialtabelle), indem Sie das empfohlene Zellvolumen in den Kammerobjektträger laden. Die resuspendierten Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C schleudern und den Überstand verwerfen.
  5. Resuspendieren Sie das Pellet in dem entsprechenden Volumen des Differenzierungsmediums der Stufe 2, das Rockinhibitor enthält, mit einer Dichte von 2,5-3,5 x 105 Zellen/cm2.
    HINWEIS: Diese Anzahl kann für die meisten Zelllinien auf ein Spaltungsverhältnis von 1:2 sinken, abhängig von der Proliferationsrate. Das Gesamtvolumen beträgt 2 ml Medien mit resuspendierten Zellen in 1 Vertiefung einer 6-Well-Platte.
  6. Die resuspendierten Zellen werden auf 1:50 membranmatrixbeschichteten Platten (hergestellt in Schritt 2) beschichtet und bei 37 °C, 5%CO2 im Inkubator inkubiert.
  7. 24 h später wird das Medium durch ein Differenzierungsmedium der Stufe 2 ohne Rockinhibitor (hergestellt in Schritt 1.3.2) ersetzt.

7. Bildung des hinteren Vorderdarms aus hPS-Zellen (Stadium 3)

  1. Saugen Sie die verbrauchten Medien der Stufe 2 mit einem tragbaren Vakuumsauger in der Gewebekulturhaube ab und waschen Sie die Zellen mit warmem PBS.
  2. Differenzierungsmedien der Stufe 3 aus Schritt 1.4 in die Zellen geben und bei 37 °C, 5% CO2 inkubieren.
  3. Nach 24 h ersetzen Sie die verbrauchten Medien durch frisch vorbereitete Differenzierungsmedien der Stufe 3. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Tage für das P2-D-Protokoll (optimiert) und nur 2 Tage für das nicht dissoziierte P1-ND.

8. Generierung von Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse aus hPS-Zellen (Stadium 4)

  1. Nach 4 Tagen der Behandlung im Stadium 3 waschen Sie die Zellen mit warmem PBS, schwenken Sie die Platte vorsichtig und saugen Sie sie mit einem tragbaren Vakuumsauger ab. Fügen Sie dann Stufe 4 Differenzierungsmedien aus Schritt 1.5 zu den Zellen hinzu.
  2. Ersetzen Sie nach 24 Stunden die verbrauchten Medien durch frisch vorbereitete Medien der Stufe 4. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Tage.

9. Bewertung der Differenzierungseffizienz der Erzeugung von Pankreasvorläuferzellen aus hPS-Zellen

  1. Durchführung der Immunfluoreszenzanalyse der hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläuferzellen (Stadium 4) zur Expression von PDX1 und NKX6.1.
    HINWEIS: PDX1 und NKX6.1 sind gut etablierte Pankreas-Vorläufermarker17,18.
    1. Führen Sie Fixierung, Permeabilisierung, Blockierung und Antikörperinkubation und -wäsche gemäß Schritt 5 durch.
    2. Färben Sie die hPSC-abgeleiteten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse mit einer Kombination von PDX1- und NKX6.1-Antikörpern (siehe Materialtabelle), verdünnt in 2%-3% BSA in PBST.
    3. Verwenden Sie 1:500 Verdünnungen geeigneter Alexa fluor 488- und 568- konjugierter sekundärer Antikörper (siehe Materialtabelle).
  2. Durchführung einer durchflusszytometrischen Analyse von hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläuferzellen zur Expression von PDX1 und NKX6.1.
    HINWEIS: Die Durchflusszytometrie-Analyse von Pankreasmarkern in den generierten hPSC-abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen bietet eine Möglichkeit, die PDX1- und NKX6.1-koexprimierenden Zellen zu quantifizieren.
    1. Am Ende von Stufe 4 waschen Sie die Zellen zweimal mit warmem PBS und fügen Sie genügend TrypLE oder Accutase hinzu, um die Oberfläche der Vertiefungen zu bedecken, z. B. 1 ml TrypLE oder Accutase pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte für 5-7 min in den Inkubator oder bis sich die Zellen von der Oberfläche lösen.
    2. Dissoziieren Sie die anhaftenden Zellblätter im Well mit einer P1000-Mikropipette, bevor Sie sie in einem 15-ml-Polypropylenrohr sammeln.
    3. Spinn Sie die Zellen in hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläuferzellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C herunter und verwerfen Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Zellen mit PBS, indem Sie sie in einzelne Zellen zerlegen. Zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Zähler (siehe Materialtabelle) und notieren Sie die Konzentration in der Anzahl der Zellen pro ml.
    4. Bei 800 x g 5 min bei 4 °C drehen und den Überstand verwerfen. 200 μL gekühltes PBS in das Pellet geben und dissoziieren.
    5. Fügen Sie 2 ml gekühltes 80% Ethanol tropfenweise hinzu, wobei das Röhrchen bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit (400 x g bei Raumtemperatur) auf einem Wirbel liegt. Schließen Sie die Kappen fest und legen Sie die Röhrchen über Nacht leicht geneigt auf den Shaker bei 4 °C.
    6. Die Zellen bei 800 x g für 5 min bei 4 °C herunterdrehen und mit PBS waschen, um alle Klumpen fixierter Zellen zu dissoziieren.
    7. Blockieren Sie die fixierten Zellen mit 5%-6% BSA-Lösung in PBST für mindestens 1 h bei Raumtemperatur oder 4 °C über Nacht auf dem Shaker.
    8. Färbung für die Pankreas-Vorläufermarker, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
      1. Verteilung von 2.00.000 Zellen pro Zustand, einschließlich geeigneter Isotypkontrollen in Abhängigkeit von der IgG-Unterklasse der Wirtsspezies des primären Antikörpers, ungefärbter und sekundärer Antikörperkontrollen in einer 96-Well-V-Bodenplatte oder 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen.
      2. Drehen Sie die Platte bei 800 x g für 5 min bei 4 °C herunter und drehen Sie die Platte mit einer schnellen Bewegung, um den Überstand zu verwerfen, ohne die Pellets zu verlieren. Bereiten Sie primäre Antikörperverdünnungen in 3%iger BSA-Lösung vor (siehe Materialtabelle).
        HINWEIS: Die Konzentration der primären Antikörper kann zwischen 1:50 und 1:200 liegen.
      3. Die gefärbten Zellen mindestens 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker mit leichtem Schütteln bei niedriger Geschwindigkeit inkubieren.
      4. Waschen Sie die gefärbten Zellen dreimal mit TBST, indem Sie die Zellen in den Vertiefungen auf und ab pipettieren. Drehen und verwerfen Sie den Überstand wie in Schritt 9.2.8.2.
      5. 1:500 Verdünnung von sekundären Antikörpern (Alexa fluor 488- und 647-konjugierte Antikörper) in PBS (siehe Tabelle der Materialien). 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
      6. Waschen Sie die gefärbten Zellen mindestens zweimal mit TBST, indem Sie die Zellen auf und ab pipettieren. Drehen Sie die Platte und verwerfen Sie den Überstand wie in Schritt 9.2.8.2.
      7. Sammeln Sie die gefärbten Zellen in mindestens 100 μL PBS und übertragen Sie sie in lichtgeschützte FACS-Röhrchen (siehe Materialtabelle). Führen Sie die Proben auf einem Durchflusszytometriegerät aus.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Ergebnisse zeigen, dass das optimierte Protokoll P2-D (Abbildung 1A) die Differenzierungseffizienz der Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse durch Hochregulierung der PDX1- und NKX6.1-Koexpression verbesserte (Abbildung 2A, B und Abbildung 3A). Insbesondere zeigten die Ergebnisse, dass die Dissoziation endodermaler Zellen und ihre Replattierung auf frischer Membranmatrix zusammen mit einer längeren Dauer von St...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit beschreibt ein erweitertes Protokoll zur Erzeugung von Pankreas-Vorläuferzellen aus hPS-Zellen mit einer hohen Co-Expression von PDX1 und NKX6.1. Die Dissoziation und Replattierung des hPSC-abgeleiteten Endoderms bei halber Dichte auf frischer Matrix führte zu einem höheren PDX1 und NKX6.1 in hPSC-abgeleiteten Pankreasvorläufern.

Obwohl der Wachstumsfaktor-Cocktail für jedes Stadium P1-ND 27 sehr ähnlich ist, wurde gezeigt, dass eine erweiterte Behandlung im Stadium 3, einschließl...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Grant No. NPRP10-1221-160041).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
15 mL, konisch, ZentrifugenröhrchenThermo Scientific339651
20X TBS Tween 20Thermo Scientific28360
24-Well-Kulturplatten, flacher Boden mit DeckelCostar3524
50 mL, konisch, ZentrifugenröhrchenThermo Scientific339652
6-Well-Kulturplatten, multiserviertThermo Scientific
AccutaseStem Cell Technologies0-7920
Activin AR& D338-ACRekonstituiert in 4 mM HCl
Anti NKX6.1 Antikörper, monoklonalerMaus DSHBF55A12-CVerdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:2000 für immunfärbende
Anti-PDX1 Antikörper, Meerschweinchen polyklonalerAbcamab47308Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:1000 für die Immunfärbung
B27 minus Vit AThermoFisher12587010
Rinderserumalbumin, Hitzeschockfraktion, fettsäurefreiSigmaA7030
CHIR 99021Tocris4423Rekonstituiert in DMSO
DMEM,ThermoFisher41965047
Donkey Anti-Maus IgG (H + L) hoch kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568InvitrogenA10037
Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488A-21206
DPBS 1XThermoFisher14190144
EGFThermoFisherPHG0313rekonstituiert in 0,1 % BSA in PBS
FGF10R& D345-FGRekonstituiert in PBS
GlucoseSigma AldrichG8644
Hoechst 33258Sigma23491-45-4
InversesMikroskop OlympusIX73
KnockOut DMEM/F-12 (1X)Gibco12660-012
KnockOut SR SerumersatzGibco10828-028
L-Ascorbinsäure (Vitamin C)SigmaA92902Rekonstituiert in destilliertem Wasser
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basalmembran MatrixCorning354230Aliquotieren Sie die aufgetaute Brühe und frieren Sie sie bei -20 °C ein.
MCDB131ThermoFisher10372019
Maus Anti-SOX17ORIGENECF500096Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:2000 für die Immunfärbung
mTeSR PlusStem Cell Technologies85850Mischen Sie das Basalmedium mit Zusatz. Aliquotieren und bei -20 Grad lagern; C für längere Zeit oder bei 4 & Grad; C für den sofortigen Einsatz
Nalgene Filtereinheiten, 0,2 & Mikro; m PESThermoFisher566-0020
NicotinamidSigma72340Rekonstituiert in destilliertem Wasser
NOGGINR& D6057-NGRekonstituiert in 0,1 % BSA in
4 % in PBSChemCruzsc-281692
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)ThermoFisher15140122
Tragbarer Vakuumsauger
Kaninchen-Anti-FOXA2-Zellsignaltechnologie3143Verdünnt auf 1:100 für die Durchflusszytometrie und 1:500 für Immunfärbung
RetinsäureSigma AldrichR2625Rekonstituiert in DMSO
Rock-Inhibitor (Y-27632)ReproCell04-0012-02Rekonstituiert in DMSO
FACS Röhrchen aus Polystyrol mit rundem Boden und Kappen, STERILStellar ScientificFSC-9010
SANT-1Sigma AldrichS4572Rekonstituiert in DMSO-Natrium
BicarbonatSigmaS5761-500G
StemFlexThermoFisherA3349401Mischen Sie das Basalmedium mit Ergänzung. Aliquotieren und bei -20 Grad lagern; C für längere Zeit oder bei 4 & Grad; C für den sofortigen Gebrauch
TALI Cellular Analysis SlideInvitrogenT10794
Tali bildbasiertes Zytometer automatisierter ZellzählerInvitrogenT10796
Triton X-100Sigma9002-93-1
TrypLE 100 mLThermoFisher12563011
Tween 20SigmaP2287
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Invitrogen15575-038
140685PBS-Paraformaldehydlösung

Referenzen

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2D Kultursystempankreatische ProgenitorenPDX1 NKX6 1 Koexpressioninsulinsekretierende ZellenZelltherapie bei Diabetesendodermale ZelldissoziationDurchflusszytometrieFluoreszenzmikroskopie

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