Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

4.2K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/63311

⸱

9. Februar 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Zusammenfassung

Jüngste Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) haben die Erzeugung verschiedener Zelltypen, einschließlich Adipozyten, ermöglicht. Die derzeitigen Differenzierungsmethoden haben jedoch eine geringe Effizienz und erzeugen keine homogene Population von Adipozyten. Hier umgehen wir dieses Problem, indem wir eine all-trans-retinische Methode verwenden, um mesenchymale Stammzellen (MSCs) in hoher Ausbeute herzustellen. Durch die Regulierung von Signalwegen, die die Zellproliferation, das Überleben und die Adhäsion steuern, ermöglicht unsere Differenzierungsstrategie die effiziente Erzeugung von embryonalen Körperchen (EBs), die sich zu einer reinen Population multipotenter MSCs differenzieren. Die hohe Anzahl von MSCs, die durch diese Methode erzeugt werden, bietet eine ideale Quelle für die Bildung von Adipozyten. Die Heterogenität der Proben, die sich aus der Differenzierung von Adipozyten ergibt, bleibt jedoch eine Herausforderung. Daher haben wir eine Nilrot-basierte Methode zur Reinigung lipidhaltiger reifer Adipozyten mit FACS verwendet. Diese Sortierstrategie ermöglichte es uns, eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Adipozyten-assoziierten Stoffwechselstörungen unter Verwendung eines Pools von Adipozyten mit reduzierter Probenheterogenität und verbesserter Zellfunktionalität zu etablieren.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) fungieren als effektive transitorische Ressource für die Produktion von Zellen mesodermalen Ursprungs wie Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, die für die Modellierung ihrer jeweiligen genetischen Erkrankungen verwendet werden könnten. Bisherige Ansätze beruhten jedoch auf der Gewinnung dieser MSCs aus adulten Geweben 1, was die Herausforderung mit sich brachte, sie in großer Zahl von den Spendern zu erhalten, und die Einschränkung der funktionellen Lebensfähigkeit unter suboptimalen In-vitro-Kulturbedingungen mit sich brachte 1,2. Diese Hindernisse haben zu einem großen Bedarf an einem Protokoll für die Herstellung von MSCs in vitro geführt. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können als wertvolle Quelle für MSCs verwendet werden, die MSC-Eigenschaften aufweisen 3,4,5. Aus iPS-Zellen gewonnene MSCs können als therapeutische Option bei verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden. Auch die Fähigkeit von aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs, Adipozyten zu erzeugen, macht sie zu einem wertvollen In-vitro-Humanmodell zur Untersuchung von menschlicher Adipogenese, Fettleibigkeit und Adipozyten-assoziierten Erkrankungen.

Die derzeitigen Differenzierungsprotokolle von Adipozyten können in zwei Gruppen eingeteilt werden, wobei die eine die Differenzierung der Adipozyten unter Verwendung chemischer oder proteinbasierter Cocktails beinhaltet, die eine resultierende Ausbeute von 30%-60%6,7,8,9 ergeben, während die andere genetische Manipulation zur robusten Induktion von Schlüsseltranskriptionsfaktoren, die die Entwicklung von Adipozyten steuern, beinhaltet, um eine Ausbeute von 80%-90% zu erzielen10. 11. Sonstiges Die genetische Manipulation rekapituliert jedoch nicht den natürlichen Prozess der Adipozytendifferenzierung und verschleiert oft die subtilen Paradigmen, die während der Adipogenese auftreten, was sie für die Modellierung von Krankheiten unwirksam macht12,13. Daher stellen wir eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten von unreifen zu sortieren, indem lipidtragende Adipozyten fluoreszenzartig mit Nilrot markiert werden.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die transiente Inkubation von iPS-abgeleiteten Embryoidkörpern (EBs) mit all-trans-Retinsäure beinhaltet, um eine große Anzahl schnell proliferierender MSCs zu produzieren, die zur Erzeugung von Adipozyten verwendet werden könnten14. Wir stellen auch eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten aus dem heterogenen Differenzierungspool zu sortieren, indem ihre Lipidtröpfchen mit einem lipophilen Farbstoff fluoreszenzmarkiert werden. Nilrot. Dies würde es ermöglichen, eine reine Population reifer Adipozyten mit verbesserter Funktionalität zu erzeugen, um Adipozyten-assoziierte Stoffwechselstörungen genau zu modellieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die Studie wurde von der zuständigen institutionellen Forschungsethikkommission genehmigt und nach den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der HMC (Nr. 16260/16) und QBRI (Nr. 2016-003) genehmigt. Diese Arbeit ist auch für hES-Zellen wie H1 und H9 optimiert. Die Blutproben wurden von gesunden Personen mit vollständiger Einverständniserklärung entnommen. Die iPS-Zellen werden aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) gesunder Personen gebildet.

1. Kultivierung und Pflege von iPS-Zellen

  1. Bereiten Sie mit Basalmembranmatrix beschichtete Platten vor, indem Sie die Beschichtungsmatrix im Verhältnis 1:80 in Knockout-DMEM rekonstituieren und bei 4 °C lagern.
  2. Bereiten Sie iPS-Nährmedien vor, indem Sie 50 ml 10-fache Stammzell-Ergänzungsmedien zu 500 ml Stammzell-Basalmedium zusammen mit 5 ml 100-fachem Penicillin-Streptomycin (P/S) hinzufügen und bei 4 °C für die kurzfristige Anwendung oder bei -20 °C für die Langzeitanwendung lagern.
  3. Legen Sie die Platten mit einer Beschichtungsmatrix aus - 1 ml für eine 6-Well-Platte, 500 μl für eine 12-Well-Platte, 250 μl für eine 24-Well-Platte - und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 1-2 h.
  4. Entfernen Sie ein Aliquot der iPS-Nährmedien und wärmen Sie es vor Gebrauch bei Raumtemperatur vor.
  5. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit iPS-Zellen (ES-Zellen oder iPS-Zellen) in einem 37 °C-Wasserbad auf und geben Sie sie in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 2-3 ml Nährmedien.
  6. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 120 x g für 4 min bei Raumtemperatur (RT-23 °C).
  7. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml frisches Nährmedium hinzu, das mit einem 10 μM ROCK-Inhibitor (Y-27632) ergänzt ist. Platten Sie die Zellen in einer Vertiefung einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte und platzieren Sie die Platte bei 37 °C.
  8. Entfernen Sie nach 24 Stunden das Medium und ersetzen Sie es durch frische Nährmedien.
  9. Wechseln Sie das Medium jeden Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen.
  10. Wenn Sie die Konfluenz erreicht haben, passieren Sie die Zellen, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco.
    2. iPSCs-Dissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) - 500 μl für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, 250 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte - hinzufügen und 1 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Entfernen Sie das Dissoziationsreagenz und inkubieren Sie die Zellen trocken für 1 min bei 37 °C.
    4. Sammeln Sie die Zellen mit Nährmedien - 1 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 250 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte - in einem konischen 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 4 Minuten lang bei 120 x g .
    5. Resuspendieren Sie die Zellen in Nährmedien - 2 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 500 μl für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, ergänzt mit 10 μM ROCK-Inhibitor, und plattieren Sie sie auf frischen, matrixbeschichteten Platten bei 40% Konfluenz.

2. Unterscheidung von iPSC in MSCs

  1. MSC-Differenzierungsmedien werden durch Zugabe von 15 % fötalem Kälberserum (FBS) und 1 % P/S zu DMEM + Pyruvat mit niedrigem Glukosegehalt hergestellt und bei 4 °C gelagert.
  2. Wenn Sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, verwenden Sie iPS-Zellen für die Bildung von Embryoidkörpern (EB), indem Sie die unten beschriebenen Schritte befolgen.
    1. Waschen Sie die Zellen mit DPBS und inkubieren Sie sie mit Dissoziationsmedium/EDTA-500 μL für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte, 250 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
    2. 1 min bei 37 °C inkubieren, Dissoziationsreagenz absaugen und die Zellen weitere 1 min bei 37 °C halten. Um mit der MSC-Differenzierung zu beginnen, werden ~10-12 x 106 Zellen benötigt.
    3. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen 15-ml-Röhrchen mit Nährmedien. Achten Sie darauf, beim Sammeln sehr vorsichtig zu sein, um zu verhindern, dass die Zellen einzeln werden und die EB-Bildung ermöglicht wird. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 120 x g für 4 min.
    4. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml MSC-Differenzierungsmedien, die 10 μM ROCK-Inhibitor enthalten.
    5. Mischen und verteilen Sie 0,5 ml/Well in einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz.
      HINWEIS: Die Verwendung einer extrem niedrigen Bindungsplatte würde die Zellaggregation in EBs fördern, anstatt sich an der Oberfläche anzuheften.
    6. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator.
  3. Nach 24 Stunden sind die erreichten EBs mit einer Behandlung mit hoher Retinsäure (RA) zu induzieren, indem Sie die unten beschriebenen Schritte befolgen.
    1. Fügen Sie 10 μM RA zu 3 ml MSC-Differenzierungsmedium hinzu. Sammeln Sie EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Entfernen Sie den Überstand von EBs und fügen Sie MSC-Differenzierungsmedien hinzu, die mit 10 μM RA ergänzt werden.
    3. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen.
    4. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator. Stören Sie EBs für die nächsten 48 Stunden nicht.
    5. Sammeln Sie EBs nach 48 Stunden in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    6. Entfernen Sie den Überstand von EBs und fügen Sie MSC-Differenzierungsmedien hinzu, die mit 0,1 μM RA ergänzt sind.
    7. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in derselben 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen.
    8. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator. Stören Sie EBs für die nächsten 48 Stunden nicht.
  4. Entfernen Sie die RA, die den Zellen hinzugefügt wurde, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Sammeln Sie nach 48 Stunden der letzten RA-Behandlung die EBs und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie DMEM-Medien mit niedrigem Glukosegehalt ohne Zytokine hinzu.
    3. Vorsichtig resuspendieren und 0,5 ml/Well in einer 24-Well-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz verteilen. Stellen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator.
  5. Platten Sie die von iPSCs abgeleiteten EBs, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Nach 48 Stunden nach dem vorherigen Schritt (Schritt 2.4) sammeln Sie die EBs in einem 15-ml-Röhrchen und lassen Sie sie 15 Minuten lang einwirken.
    2. Überstand entfernen und in 2 ml frischem MSC-Differenzierungsmedium resuspendieren.
    3. Überführung in zwei Vertiefungen einer mit Basalmembranmatrix beschichteten 6-Well-Platte.
    4. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag für weitere 5 Tage.
    5. Entfernen Sie nach 5 Tagen das verbrauchte Medium und ersetzen Sie es durch ein frisches MSC-Differenzierungsmedium mit 2,5 ng/ml basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
  6. Passieren Sie die plattierten EBs, wenn sie eine Konfluenz von 80 % bis 90 % erreichen, indem Sie die unten beschriebenen Schritte ausführen.
    1. Waschen Sie die Zellen mit DPBS, fügen Sie Trypsin-EDTA-500 μL für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 3 min.
    2. Sammeln Sie die Zellen mit MSC-Differenzierungsmedien in einem konischen 15-ml-Röhrchen und schleudern Sie sie 4 Minuten lang bei 750 x g .
    3. Resuspendierung in MSC-Differenzierungsmedien mit 2,5 ng/ml bFGF und Platte der Zellen auf basalmembranmatrixbeschichteten Platten im Verhältnis 1:3.
    4. Wiederholen Sie die Passage, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen. Es wird erwartet, dass es durch 2-3 Passagen 3-6 Millionen Zellen gewinnt.

3. Durchflusszytometrische Analyse von aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs

HINWEIS: Nach 2-3 Passagen sollten die Zellen für die Effizienz der MSC-Differenzierung zugänglich gemacht werden. Die Differenzierung gilt als erfolgreich, wenn die Zellen die MSC-Differenzierungsmarker CD44, CD73, CD90 und CD105 mit einer Effizienz von mehr als 90 % exprimieren und keine hohen Mengen an hämatopoetischen Markern CD14, CD19, CD34 und CD45 exprimieren. Auf die Effizienz dieser Marker können Sie zugreifen, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.

  1. Passieren Sie die Zellen mit den oben beschriebenen Schritten (Schritt 2.6) und erhalten Sie 1 x 105 Zellen in einer Vertiefung einer 96-Well-Platte mit V-Boden.
  2. Zentrifugieren Sie die Platte bei 375 x g für 4 min bei 4 °C.
  3. 1 x 105 Zellen in 100 μl kaltem DPBS mit 1 μl konjugiertem Antikörper (Ab) resuspendieren (siehe Materialtabelle) und 30-40 min bei 4 °C inkubieren, um eine Lichtexposition zu vermeiden.
  4. Weitere 1 x 105 Zellen in 100 μl kaltem DPBS mit der entsprechenden Isotypkontrolle des konjugierten Ab in einer Konzentration von 1:100 ) resuspendieren und bei 4 °C für 30-40 min inkubieren, um eine Lichtexposition zu vermeiden.
  5. Nach der Inkubation wird die Platte bei 375 x g für 4 min bei 4 °C zentrifugiert. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Teller über der Spüle schütteln.
  6. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μl kaltem DPBS.
  7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 375 x g für 4 min bei 4 °C. Entsorgen Sie den Überstand.
  8. Resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl kaltem DPBS und sammeln Sie sie in dunklen, kalten 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bewahren Sie sie auf Eis auf, bis sie durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) analysiert werden.
  9. Verteilen Sie die Zellen für die FACS-Analyse mit Seitenstreuung (SSC-A) und Vorwärtsstreuung (FSC-A), um die Ablagerungen auszuschließen. Verteilen Sie die Gated Cells unter Verwendung der vorwärts gestreuten Höhe (FSC-H) im Vergleich zur vorwärts gestreuten Fläche (FSC-A), um Einzellinge von Dubletten aus der lebenden Zellpopulation zu unterscheiden.
    HINWEIS: Die Zellen wurden relativ zur Verschiebung der Isotypkontrolle für jeden Marker gegatet, und für die Analyse wurden mindestens 10.000 Gated Events aus jeder gefärbten Probe verwendet.

4. Differenzierung von MSCs in Adipozyten

  1. Bereiten Sie Basalmedien zur Adipozytendifferenzierung zu, indem Sie 10 % Knockout-Serumersatz (KOSR), 1 % Glutamin, 1 % P/S, 4,5 ng/μl Glukose zu minimalen essentiellen Medien (MEM)-alpha hinzufügen und bei 4 °C lagern.
  2. Ermöglichen Sie es MSCs, eine Konfluenz von über 90 % zu erreichen. Kultivieren Sie sie weitere 48 Stunden, damit sie eine Zeit des Wachstumsstopps durchlaufen können.
  3. Bereiten Sie ein vollständiges Adipozyten-Differenzierungsmedium vor, indem Sie 100 μg/ml 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX), 1 μM Dexamethason, 0,2 U/ml Insulin, 100 μM Indometacin und 10 μM Rosiglitazon zu den Basalmedien hinzufügen.
  4. Entfernen Sie MSC-Differenzierungsmedien und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  5. Fügen Sie ein vollständiges Adipozyten-Differenzierungsmedium hinzu - 2 ml für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 1 ml für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte - und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C. Wechseln Sie das komplette Differenzierungsmedium 14 Tage lang jeden zweiten Tag.

5. Bewertung der Differenzierungseffizienz von Adipozyten

  1. Überprüfen Sie am 14. Tag der Differenzierung die Effizienz der Differenzierung, indem Sie Zellen auf Adipozytenreifungsmarker, FABP4 und Adiponektin färben.
  2. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit DPBS.
  3. Fixieren Sie die Zellen mit 4%igem Paraformaldehyd (PFA) - 200 μL in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte - und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  4. Entsorgen Sie das PFA und waschen Sie es mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,5 % Tween (TBST) und legen Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Shaker. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal.
  5. Permeabilisieren Sie die fixierten Zellen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,5% Triton X-100 (PBST) und legen Sie sie für 15-20 min bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
  6. Verwerfen Sie das PBST und fügen Sie den Blockierungspuffer (5%-6% Rinderserumalbumin (BSA) in PBST)-500 μl für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und 250 μl für eine Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur auf dem Schüttler für 40-60 Minuten.
  7. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen FABP4, Adiponektin in 2%-3% BSA, in einer Konzentration von 1:500 (siehe Materialtabelle). Fügen Sie diese Antikörper nur zusammen, wenn sie bei verschiedenen Tieren aufgezogen wurden, und legen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C auf den Shaker.
  8. Entfernen Sie die primären Antikörper und waschen Sie die Zellen dreimal mit TBST (jeweils 15 Minuten) und legen Sie sie bei Raumtemperatur auf einen Shaker.
  9. Bereiten Sie Alexa Fluor-Sekundärantikörper in PBST (1:500) vor. Inkubieren Sie die Zellen in den sekundären Antikörperkombinationen (je nach Spezies, bei der der primäre Antikörper aufgezogen wird) für 60 min bei Raumtemperatur und decken Sie die Platte mit Alufolie ab, um sie vor Licht zu schützen.
  10. Entsorgen Sie die sekundären Antikörper, waschen Sie sie dreimal mit TBST und legen Sie die Platte auf den Shaker.
  11. Um die Zellkerne zu färben, fügen Sie 1 μg/ml Hoechst 33342-200 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang bei Raumtemperatur.
  12. Verwerfen Sie die Hoechst-Lösung und geben Sie PBS-500 μL für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte zu den Zellen. Halten Sie die Platten vor Licht geschützt, bis sie mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

6. Sortierung von Adipozyten mit Nilrot

  1. Bereiten Sie die Nilrot-Arbeitslösung durch Zugabe von 1 mg/ml Nilrot-Stammlösung in DMSO vor und lagern Sie sie bei -20 °C. Tauen Sie den roten Nilstamm unmittelbar vor der Anwendung auf und rekonstituieren Sie ihn in DPBS, um eine Arbeitslösungskonzentration von 300 nM zu erreichen.
  2. Am oder nach dem 14. Tag der Adipozytendifferenzierung wird das Medium aus den Zellen verworfen und mit DPBS gewaschen.
  3. Nilrote Arbeitslösung -1 ml in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte geben und bei 37 °C 15 min inkubieren.
  4. Entfernen Sie die Nilrotlösung und geben Sie Trypsin-EDTA -500 μL in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 4 min.
  5. Sammeln Sie die Zellen mit DMEM, das 5 % FBS enthält, in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren bei 750 x g für 4 min.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in DPBS-1 ml für 1 x 106 Zellen. Zentrifugieren bei 750 x g für 4 min.
  7. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie ihn in DPBS-1 ml für 1 x 106 Zellen. Verwenden Sie einen FACS-Sortierer, um die rot-positiven Nilzellen mithilfe des FL1-Kanals zu isolieren.
  8. Rekultivieren Sie die sortierten Zellen in Adipozyten-Differenzierungsmedien oder sammeln Sie die sortierten Zellen für die RNA- und Proteinisolierung.
  9. Extrahieren Sie RNA aus den sortierten Zellen und führen Sie eine relative quantitative Analyse von Adipozyten-Differenzierungsmarkern durch, einschließlich FABP4, PPARG und C/EBPA. Die Nilrot-positiven Zellen zeigen eine signifikante Hochregulation der Genexpression um mindestens das Zweifache im Vergleich zu unsortierten Zellen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Schematische Darstellung und Morphologie von Zellen während der mesenchymalen Differenzierung: Die Differenzierung von iPS-Zellen in MSCs umfasst verschiedene Entwicklungsstadien, die sich über EB-Bildung, MSC-Differenzierung und MSC-Expansion erstrecken (Abbildung 1). Während dieser Entwicklungsstadien erhalten die Zellen aufgrund der verschiedenen stimulierenden Chemikalien, denen sie ausgesetzt sind, eine unterschiedliche Morphologie. Nach Beginn der Differenzierung werden die Zellen in S...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Protokoll ist von größter Bedeutung, da es in der Lage ist, MSCs mit hoher Ausbeute und Effizienz zu liefern. Diese Massenproduktion von MSCs wurde durch die transiente Inkubation von iPSCs-abgeleiteten EBs mit 10 μM RA14,15 ermöglicht. Die transiente Behandlung mit 10 μM RA erhöhte die MSC-Ausbeute um das 11,2- bis 1542-fache14,15, wobei dieses Protokoll sowohl auf iPS-Zellen als auch auf hPS-Zell...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Fördernummer NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi wurde durch ein GSRA-Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AdiponektinAbcamab22554Adipozyten-Reifungsmarker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC Differenzierungsmarker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC Differenzierungsmarker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC Differenzierungsmarker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC-Differenzierungsmarker
anti-CD44abcamab93758MSC-Differenzierungsmarker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC-Differenzierungsmarker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC-Differenzierungsmarker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC-Differenzierungsmarker
bFGFForschung & Forschung D233-FPMSC-Nährmedienergänzung
C/EBPAAbcamab40761Adipozyten-Reifungsmarker
DexamethasonTorics1126Adipozyten-Differenzierungsmedienergänzung
FABP4Abcamab93945Adipozyten-Reifungsmarker
Fötales RinderserumThermoFisher10082147MSC-Nährmedienergänzung
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC Nahrungsergänzungsmittel für Nährmedien
IBMXSigma AldrichI5879Nahrungsergänzungsmittel für Adipozyten-Differenzierungsmedien
IndomethacinSigma AldrichI7378Nahrungsergänzungsmittel für Adipozyten-Differenzierungsmedien
InsulinSigma Aldrich91077CNahrungsergänzungsmittel für Adipozyten-Differenzierungsmedien
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basalmedien zur Herstellung von Matrigel
Low Glucose DMEMThermoFisher11885084MSC Kulturmedien
MatrigelCorning354230Beschichtungsmatrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipozyten-Differenzierungsmedien
NileredSigma Aldrich19123Sortiermarker für Adipozyten
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipozyten-Medienergänzung
Phosphatgepufferte KochsalzlösungThermoFisher14190144Waschpuffer
Pierce™ 20X TBS PufferThermo Fisher28358Waschpuffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipozyten-Reifungsmarker
ReLeSRStammzelle Technologies5872Dissoziationsreagenz
RetinsäureSigma AldrichR2625MSC Differenzierungsmedienergänzung
RockinhibitorTocris1254/10hPSC Nährmedienergänzung
RoziglitazonSigma AldrichR2408Adipozytendifferenzierungsmedienergänzung
StemFlexThermoFisherA334901hPSC Nährmedien
TritonThermo Fisher28314Permebealisierungsreagenz
TrypsinThermoFisher25200072Dissoziationsreagenz
Tween 20Sigma AldrichP7942Waschpuffer

Referenzen

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846(2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785(2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Differenzierung humaner iPSCsmesenchymale StammzellenAdipozytendifferenzierungNile Red Sortingreine Adipozytenpopulationembryoidale K rperFACS SortingMarker der Adipozytenreifunglipidhaltige Adipozyten
Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.