Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur Isolierung der Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus und die anschließende Analyse der Atmung mittels Oxygen Consumption Rate (OCR) unter Verwendung von mikroplattenbasierten respirometrischen Assays. Diese Pipeline kann angewendet werden, um die Auswirkungen mehrerer umweltbedingter oder genetischer Eingriffe auf den mitochondrialen Stoffwechsel zu untersuchen.

Zusammenfassung

Der größte Teil der Energie der Zelle wird durch den Abbau von Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren über verschiedene Wege gewonnen, die auf dem mitochondrialen oxidativen Phosphorylierungssystem (OXPHOS) zusammenlaufen, das als Reaktion auf zelluläre Anforderungen reguliert wird. Das Lipidmolekül Coenzym Q (CoQ) ist in diesem Prozess essentiell, indem es Elektronen durch konstante Oxidations- / Reduktionszyklen in den Komplex III in der Elektronentransportkette (ETC) überträgt. Der Zustand der Mitochondrien und letztendlich die Zellgesundheit können durch Messung des ETC-Sauerstoffverbrauchs mithilfe von respirometrischen Assays beurteilt werden. Diese Studien werden typischerweise in etablierten oder primären Zelllinien durchgeführt, die mehrere Tage lang kultiviert wurden. In beiden Fällen können die erhaltenen Atmungsparameter von den normalen physiologischen Bedingungen in einem bestimmten Organ oder Gewebe abgewichen sein.

Darüber hinaus behindern die intrinsischen Eigenschaften von kultivierten Einzelfasern, die aus der Skelettmuskulatur isoliert wurden, diese Art der Analyse. Dieses Papier stellt ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll für die Analyse der Atmung in frisch isolierten Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus vor. Wir bieten auch Lösungen für potenzielle Probleme, die in jedem Schritt des Prozesses auftreten können. Die hier vorgestellte Methode könnte angewendet werden, um Sauerstoffverbrauchsraten in verschiedenen transgenen Mausmodellen zu vergleichen und die mitochondriale Reaktion auf medikamentöse Behandlungen oder andere Faktoren wie Altern oder Geschlecht zu untersuchen. Dies ist eine praktikable Methode, um auf entscheidende Fragen zum mitochondrialen bioenergetischen Stoffwechsel und zur Regulation zu antworten.

Einleitung

Mitochondrien sind die primären Stoffwechselorganellen in der ^Zelle1. Diese spezialisierten membranumschlossenen Organellen verwenden Nährstoffmoleküle, um Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP) von OXPHOS zu erzeugen. Dieser Prozess beruht auf dem Transfer von Elektronen aus Donormolekülen in einer Reihe von Redoxreaktionen im ^ETC2. CoQ ist das einzige redoxaktive Lipid, das endogen in allen Zellmembranen und zirkulierenden Lipoproteinen produziert wird und eine antioxidative Funktion ^zeigt3. Es ist ein wesentlicher Bestandteil des ETC und überträgt Elektronen vom NADH-abhängigen Komplex I....

Protokoll

Mausgehäuse und Gewebeentnahme wurden unter Verwendung von Protokollen durchgeführt, die von der Ethikkommission der Universidad Pablo de Olavide (Sevilla, Spanien; Protokolle 24/04/2018/056 und 12/03/2021/033) in Übereinstimmung mit dem spanischen Königlichen Dekret 53/2013, der europäischen Richtlinie 2010/63/EU und anderen relevanten Richtlinien genehmigt wurden.

1. Vorbereitung von Beständen, Puffern und Reagenzien für die Atmungstests

1. Bereiten Sie die folgenden Lagerlösungen vor, die monatelang bei der angegebenen Temperatur gelagert werden können. Verwenden Sie in allen Fällen hochreines _H2O.
   ....

Ergebnisse

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die In-vivo-Analyse der mitochondrialen Atmung durch die Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Ein Überblick über die Methode ist in Abbildung 1 dargestellt. Nach der Sezierung der Skelettmuskulatur von den Hinterbeinen (Abbildung 2) werden die Gewebe homogenisiert und die Mitochondrien unter isotonischen Bedingungen durch serielle Zentrifugationen gereinigt. Die Reinheit der verschie.......

Diskussion

Alle Methoden, die zur Untersuchung der mitochondrialen Atmung verwendet werden, haben ihre Grenzen; Daher ist es entscheidend, die Methode auszuwählen, die am besten zu einer bestimmten experimentellen Fragestellung passt. Diese Arbeit bietet ein aktualisiertes und detailliertes Protokoll zur Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus, um verschiedene Atemassays zur Untersuchung der mitochondrialen Funktion durchzuführen. Tatsächlich ist die Untersuchung der mitochondrialen Bioenergetik in isolierte.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ADP	Sigma	A5285	Aktie bei -20 ° C
AKT Antikörper	Cell Signaling Technology	C67E7	Kaninchen (Wirtsspezies)
Anti-Ziege HRP	Sigma	401504	Kaninchen (Wirtsspezies)
Anti-Maus HRP	Cell Signaling	#7076	Pferd (Wirtsspezies)
Antimycin A	Sigma	A8674	Bestand bei -20 ° C
anti-Rabbit HRP	Cell Signaling	#7074	Ziege (Wirtsspezies)
Ascorbinsäure	Sigma	A5960	Bestand bei RT
Bactin-Antikörper	Sigma	MBS4-48085	Ziege (Wirtsspezies)
Bio-Rad Protein Assay Kit II	Bio-Rad	5000002	Es enthält 5x Bradford-Reagenz und BSA mit bekannter Konzentration für die Standardkurve
BSA, Fraktion V, Fettsäurefreies	Calbiochem	126575	Lager bei 4 ° C
C Röhrchen	Miltenyi Biotec	130-093-237	Purpurdeckel
Calnexin-Antikörper	ThermoFisher	MA3-027	Maus (Wirtsspezies)
D-mannitol	Sigma	M4125	Bestand bei RT
EDTA	BDH	280254D	Bestand bei 4 ° C
EGTA	Sigma	E-4378	Bestand bei RT
FCCP	Sigma	C2920	Bestand bei -20 ° C
gentleMACS Dissoziator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Homogenisator
HEPES	Sigma	H3375	Bestand bei RT
HSP70 Antikörper	Proteintech	10995-1-AP	Kaninchen (Wirtsspezies)
LDH-A Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	SC27230	Ziege (Wirtsart)
Magnesiumchlorid	ChemCruz	sc-255260A	Lager bei RT
Apfelsäure	Sigma	P1645	Bestand bei RT
Mikroplatten-Spektralphotometer	BMG LABTECH GmbH	POLARstar OMEGA S/N 415-0292	Bestand bei RT
Milli-Q Wasser	Millipore System	F7HA17757A	Reinstwasser
mtTFA Antikörper	Santa Cruz Biotechnologie	SC23588	Ziege (Wirtsspezies)
Na+/K+-ATPase α 1 Antikörper	Novus Biologicals	NB300-14755	Maus (Wirtsspezies)
Oligomycin	Sigma	O4876	Lagerbestand bei -20 ° C
Palmitoyl-L-Carnitin	Sigma	P1645	Lagerbestand bei -20 ° C
PBS Tabletten	Sigma	P4417-100TAB	1x Lagerbestand bei RT
Kaliumdihydrogenphosphat	ChemCruz	sc-203211	Lagerbestand bei RT
Kaliumhydroxid	Sigma	60377	Lagerbestand bei RT
Brenztraubensäure	Sigma	107360	Lagerbestand bei 4 ° C
Rotenon	Sigma	R8875	Bestand bei -20 ° C
Seahorse XF24 Mitochondrienfluss-Analysator	Agilent Technologies	420179	XFe24-Modell
Seahorse XFe24 FluxPak mini	Agilent Technologies	102342-100	Das Kit enthält Kartuschen, Mikrotiterplatten und Kalibrierlösung
Succinat	Sigma	S7626	Bestand bei RT
Saccharose	Sigma	S9378	Bestand bei RT
TIMM23 Antikörper	Abcam	ab230253	Kaninchen (Wirtsart)
TMPD	Sigma	T7394	Lagerbestand bei -20 ° C
TOMM20 Antikörper	Abcam	ab56783	Maus (Wirtsspezies)
VDAC Antikörper	Abcam	ab15895	Kaninchen (Wirtsspezies)