Methodenartikel

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

DOI:

10.3791/63337

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13. Mai 2022

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1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Zusammenfassung

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Das Redoxgleichgewicht spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Die erhöhte Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) fördert die Modifikation von Proteinen, Lipiden und DNA, was schließlich zu einer Veränderung der Zellfunktion und des Zelltods führen kann. Daher ist es für die Zellen von Vorteil, ihre antioxidative Abwehr als Reaktion auf schädliche Beleidigungen zu erhöhen, entweder durch Aktivierung eines antioxidativen Weges wie Keap1 / Nrf2 oder durch Verbesserung der Redoxfänger (Vitamine A, C und E, β-Carotin und Polyphenole, unter anderem). Entzündungen und oxidativer Stress sind an der Pathogenese und dem Fortschreiten von Retinopathien wie der diabetischen Retinopathie (DR) und der Frühgeborenen-Retinopathie (ROP) beteiligt. Da Müller-Gliazellen (MGCs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von neuronalem Netzhautgewebe spielen, gelten sie als ideales Modell, um diese zellulären Schutzmechanismen zu untersuchen. In diesem Sinne ist die Quantifizierung der ROS-Spiegel mit einer reproduzierbaren und einfachen Methode unerlässlich, um den Beitrag von Signalwegen oder Molekülen zu beurteilen, die am antioxidativen Zellabwehrmechanismus beteiligt sind. In diesem Artikel geben wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren, die für die Messung von ROS mit DCFH-DA-Sonde und Durchflusszytometrie in MGCs erforderlich sind. Wichtige Schritte für die Datenverarbeitung der Durchflusszytometrie mit der Software werden hier bereitgestellt, so dass die Leser in der Lage sein werden, ROS-Werte (geometrische Mittel von FITC) zu messen und Fluoreszenzhistogramme zu analysieren. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um nicht nur den Anstieg des ROS nach einer zellulären Beleidigung zu bewerten, sondern auch die antioxidative Wirkung bestimmter Moleküle zu untersuchen, die eine schützende Wirkung auf die Zellen haben können.

Einleitung

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Die neuronale Netzhaut ist ein sehr organisiertes Gewebe, das gut definierte neuronale Schichten aufweist. In diesen sind Neuronen (Ganglien-, Amakrin-, bipolare, horizontale und Photorezeptorzellen) miteinander und auch mit Müller-Gliazellen (MGCs) und Astrozyten verbunden, was zu einer adäquaten Phototransduktion und Verarbeitung visueller Informationenführt 1,2. Es ist bekannt, dass MGCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielen, da sie den gesamten Netzhautabschnitt durchqueren und somit mit allen Zelltypen interagieren können, die mehrere Schutzprozesse modulieren. Es ....

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Protokoll

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HINWEIS: Informationen zu Pufferzusammensetzungen finden Sie in Tabelle 1.

1. Zellkulturvorbereitung

HINWEIS: Beschrieben wird hier die Kulturvorbereitung von MIO-M1-Zellen, einer spontan immortalisierten menschlichen Müller-Gliazelllinie (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Verwenden Sie immer die richtige aseptische Technik und arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube.

  1. Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) komplettes Medium vor. Zu DMEM, das 4,5 g/L D-Glucose und 110 mg/L Natriumpyruvat enthält, fügen Sie 10% hitzeinaktiviertes FBS,....

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Ergebnisse

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Wie im Protokollabschnitt beschrieben, haben wir repräsentative und quantitative Daten gezeigt, die die Durchflusszytometrie-Detektion der ROS-Produktion mit der Fluoreszenzsonde DCFH-DA aus MIO-M1-Zellen demonstrieren, die mit ROS-Induktor, A oder B stimuliert wurden. Wie erwartet, beobachteten wir Veränderungen der FITC-Fluoreszenz in unstimulierten Zellen oberhalb der Autofluoreszenzspiegel (Abbildung 1A, vergleichen Sie "Basalkontrolle" vs. "Autofluoreszenzkontrolle", Punktdiagrammdiagra.......

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Diskussion

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Mehrere pathologische Zustände wie Krebs, entzündliche Erkrankungen, Ischämie / Reperfusion, ischämische Herzerkrankungen, Diabetes und Retinopathien sowie physiologische Situationen wie das Altern führen zu einer ROS-Überproduktion 6,7,8,9,10,11. Daher sind der Nachweis, die Messung und das Verständnis des Signalwegs, der an.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken María Pilar Crespo und Paula Alejandra Abadie von CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gabriela Furlan und Noelia Maldonado für die Zellkulturunterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication von FCQ) für die Videoproduktion und -bearbeitung.

Dieser Artikel wurde durch Zuschüsse von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) und Proyecto de In....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)Gibco von life technologies15630-080
BD FACSCanto II DurchflusszytometerBDBiosciences FACSCanto
BD FACSDiva softwareBD Biosciences
Zellkulturschalen 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
ZentrifugeThermoSorvall legend micro 17 R
Zentrifugenröhrchen (15 ml)BIOFILCFT011150
Zentrifugenröhrchen (50 ml)BIOFILCFT011500
KryovialCRYO. S - Greiner Bio-One126263
DimethylsulfoxidSigma-AldrichW387520-1KG
Dinatriumhydrogen-phosphat-HeptahydratMerck106575
DMEM ohne PhenolrotGibco von life technologies31053-028
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Gibco von life technologies11995065
Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA), Dinatriumsalz, DihydratMerck324503
Fötales RinderserumInternegocios
FlowJo v10 SoftwareBD Biosciences
GlukoseMerck108337
Hämozytometer, Neubauer-KammerBOECO,Deutschland
Laminar-Flow-HaubeESCOAC2-6E8
L-Glutamin (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RotInvitrogen  M36008
Penicillin/StreptomycinGibco von life technologies15140-122
KaliumchloridMerck104936
KaliumdihydrogenphosphatMerck4878
Runde Polystyrolröhrchen 5 ml (Durchflusszytometrieröhrchen)Falcon - CorningBD-352008
NatriumazidMerck822335
NatriumchloridMerck106404
NatriumhydroxidMerck106462
SPINWIN Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mlTarson500010-N
Gewebekulturplatte 6 WellBIOFILTCP011006
TrypanblauMerck111732
Trypsin-EDTA 0,5% 10XGibco von life technologies15400-054
Vortex-MischerLabnet International, Inc.

Referenzen

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  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Oxidativer Stressantioxidative AbwehrRedox GleichgewichtFluoreszenzhistogrammzellul re Hom ostaseROS Quantifizierung

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