Methodenartikel

Quantifizierung reaktiver Sauerstoffspezies mittels 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde und Durchflusszytometrie in Müller-Gliazellen

DOI:

10.3791/63337

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13. Mai 2022

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier schlagen wir ein systematisiertes, zugängliches und reproduzierbares Protokoll vor, um zelluläre reaktive Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung einer 2′,7′-Dichlorfluorescein-Diacetatsonde (DCFH-DA) in Müller-Gliazellen (MGCs) nachzuweisen. Diese Methode quantifiziert die gesamten zellulären ROS-Spiegel mit einem Durchflusszytometer. Dieses Protokoll ist sehr einfach zu bedienen, geeignet und reproduzierbar.

Zusammenfassung

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Das Redoxgleichgewicht spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase. Die erhöhte Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) fördert die Modifikation von Proteinen, Lipiden und DNA, was schließlich zu einer Veränderung der Zellfunktion und des Zelltods führen kann. Daher ist es für die Zellen von Vorteil, ihre antioxidative Abwehr als Reaktion auf schädliche Beleidigungen zu erhöhen, entweder durch Aktivierung eines antioxidativen Weges wie Keap1 / Nrf2 oder durch Verbesserung der Redoxfänger (Vitamine A, C und E, β-Carotin und Polyphenole, unter anderem). Entzündungen und oxidativer Stress sind an der Pathogenese und dem Fortschreiten von Retinopathien wie der diabetischen Retinopathie (DR) und der Frühgeborenen-Retinopathie (ROP) beteiligt. Da Müller-Gliazellen (MGCs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase von neuronalem Netzhautgewebe spielen, gelten sie als ideales Modell, um diese zellulären Schutzmechanismen zu untersuchen. In diesem Sinne ist die Quantifizierung der ROS-Spiegel mit einer reproduzierbaren und einfachen Methode unerlässlich, um den Beitrag von Signalwegen oder Molekülen zu beurteilen, die am antioxidativen Zellabwehrmechanismus beteiligt sind. In diesem Artikel geben wir eine vollständige Beschreibung der Verfahren, die für die Messung von ROS mit DCFH-DA-Sonde und Durchflusszytometrie in MGCs erforderlich sind. Wichtige Schritte für die Datenverarbeitung der Durchflusszytometrie mit der Software werden hier bereitgestellt, so dass die Leser in der Lage sein werden, ROS-Werte (geometrische Mittel von FITC) zu messen und Fluoreszenzhistogramme zu analysieren. Diese Werkzeuge sind sehr hilfreich, um nicht nur den Anstieg des ROS nach einer zellulären Beleidigung zu bewerten, sondern auch die antioxidative Wirkung bestimmter Moleküle zu untersuchen, die eine schützende Wirkung auf die Zellen haben können.

Einleitung

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Die neuronale Netzhaut ist ein sehr organisiertes Gewebe, das gut definierte neuronale Schichten aufweist. In diesen sind Neuronen (Ganglien-, Amakrin-, bipolare, horizontale und Photorezeptorzellen) miteinander und auch mit Müller-Gliazellen (MGCs) und Astrozyten verbunden, was zu einer adäquaten Phototransduktion und Verarbeitung visueller Informationenführt 1,2. Es ist bekannt, dass MGCs eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der retinalen Homöostase spielen, da sie den gesamten Netzhautabschnitt durchqueren und somit mit allen Zelltypen interagieren können, die mehrere Schutzprozesse modulieren. Es wurde berichtet, dass MGCs mehrere wichtige Funktionen für die Erhaltung und das Überleben von retinalen Neuronen haben, einschließlich Glykolyse zur Energieversorgung von Neuronen, die Entfernung von neuronalen Abfällen, das Recycling von Neurotransmittern und die Freisetzung neurotropher Faktoren, unter anderem 3,4,5.

Auf der anderen Seite sind Entzündungen, oxidativer und nitrosativer Stress an der Pathogenese und dem Fortschreiten vieler menschlicher Krankheiten beteiligt, einschließlich der Retinopathien 6,7,8,9,10,11. Das Redoxgleichgewicht in den Zellen hängt von einer strengen Regulierung der ROS-Werte ab. ROS werden ständig unter physiologischen Bedingungen hauptsächlich durch aerobe Atmung erzeugt. Zu den Hauptmitgliedern der ROS-Familie gehören reaktive freie Radikale wie das Superoxid-Anion (O2͘͘͘͘•−), Hydroxylradikale (•OH), verschiedene Peroxide (ROOR′), Hydroperoxide (ROOH) und das radikalfreie Wasserstoffperoxid (H2O2)12,13. In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass ROS eine wichtige Signalisierungsrolle in den Zellen spielt, indem es essentielle Prozesse steuert. MGCs haben eine starke antioxidative Abwehr durch die Aktivierung des transkriptionellen Kernfaktors Erythroid-2-verwandter Faktor 2 (Nrf2) und die anschließende Expression von antioxidativen Proteinen, um die übermäßige Produktion von ROS unter pathologischen Bedingungenzu beseitigen 14,15,16. Wenn die Zellen ihr Redoxgleichgewicht aufgrund einer übertriebenen Produktion von ROS oder einer mangelhaften Fähigkeit, ROS zu entfernen, verlieren, fördert die Anhäufung von oxidativem Stress schädliche Veränderungen in Proteinen, Lipiden und DNA, was zu zellulärem Stress oder Tod führt. Die Erhöhung des retinalen antioxidativen Abwehrsystems verbessert die Auflösung und Vorbeugung von Retinopathien wie ROP und RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Daher ist die Messung der ROS-Produktion in Echtzeit ein leistungsfähiges und nützliches Werkzeug.

Es gibt mehrere Methoden, um die ROS-Produktion oder den oxidativen Stress in Zellen zu messen. Unter diesen ist die 2',7'-Dichlorfluorescein-Diacetat (DCFH-DA)-Sonde eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur direkten Quantifizierung des Redoxzustands einer Zelle25,26,27,28. Diese Sonde ist lipophil und nicht fluoreszierend. Die Diffusion dieser Sonde über die Zellmembran ermöglicht ihre Spaltung durch intrazelluläre Esterasen an den beiden Esterbindungen, wodurch ein relativ polares und zellmembranundurchlässiges Produkt, 2′,7'-Dichlorfluorescein (H2 DCF), entsteht. Dieses nicht-fluoreszierende Molekül reichert sich intrazellulär an, und die anschließende Oxidation durch ROS ergibt das hochfluoreszierende Produkt DCF. Die Oxidation der Sonde ist das Produkt der Wirkung mehrerer Arten von ROS (Peroxynitrit, Hydroxylradikale, Stickstoffmonoxid oder Peroxide), die durch Durchflusszytometrie oder konfokale Mikroskopie (Emission bei 530 nm und Anregung bei 485 nm) nachgewiesen werden können. Die Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass Superoxid und Wasserstoffperoxid nicht stark mitH2DCF25,29 reagieren. In diesem Artikel verwenden wir die DCFH-DA-Sonde, um ROS durch Durchflusszytometrie zu messen und zu quantifizieren. Aus diesem Grund induzieren wir die ROS-Produktion, indem wir MGCs mit ROS-Induktor, A oder B, stimulieren, bevor wir die Zellen mit der Fluoreszenzsonde beladen. Darüber hinaus verwenden wir eine antioxidative Verbindung. Schließlich zeigen wir repräsentative und zuverlässige Daten, die mit diesem Protokoll erhalten wurden.

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Protokoll

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HINWEIS: Informationen zu Pufferzusammensetzungen finden Sie in Tabelle 1.

1. Zellkulturvorbereitung

HINWEIS: Beschrieben wird hier die Kulturvorbereitung von MIO-M1-Zellen, einer spontan immortalisierten menschlichen Müller-Gliazelllinie (Moorfield's/Institute of Ophthalmology- Müller 1). Verwenden Sie immer die richtige aseptische Technik und arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube.

  1. Bereiten Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle's Medium (DMEM) komplettes Medium vor. Zu DMEM, das 4,5 g/L D-Glucose und 110 mg/L Natriumpyruvat enthält, fügen Sie 10% hitzeinaktiviertes FBS, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES), 2 mM L-Glutamin und 50 U/ml Penicillin/Streptomycin hinzu. Bereiten Sie das frische Medium vor, an dem Tag, an dem die MIO-M1-Zellen aufgetaut werden.
  2. Tauen Sie die gefrorenen MIO-M1-Zellen an Tag 1 auf.
    1. Entfernen Sie dazu die kryovialen 5 x 105 MIO-M1-Zellen in FBS mit 10% DMSO aus der Flüssigstickstofflagerung und legen Sie sie sofort in ein 37 °C warmes Wasserbad.
      HINWEIS: Tragen Sie immer eine Gesichtsmaske oder Schutzbrille, da in flüssigem Stickstoff gelagerte Kryoviten beim Auftauen eine Explosionsgefahr darstellen.
    2. Tauen Sie die MIO-M1-Zellen schnell auf (in weniger als 1 min), indem Sie die Durchstechflasche im 37 ° C-Wasserbad erwärmen, bis nur noch ein kleines bisschen Eis in der Durchstechflasche vorhanden ist.
    3. Wischen Sie die Außenseite der Durchstechflasche mit 70% Ethanol ab und geben Sie sie auf eine Laminar-Flow-Haube.
    4. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen aus der Durchstechflasche in ein steriles 15-ml-Röhrchen und fügen Sie dann 6 ml vorgewärmtes komplettes DMEM-Medium tropfenweise hinzu.
    5. Zentrifen Sie die Zellsuspension bei ca. 600 x g für 5 min. Nach der Zentrifugation werden ein klarer Überstand und ein komplettes Pellet visualisiert. Verwerfen Sie den Überstand mit einer Pipette, ohne das Zellpellet zu stören.
    6. Dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml vollständigem DMEM-Medium. Übertragen Sie diese Zellsuspension in eine Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 100 mm und inkubieren Sie die Platte für ca. 2 Tage bei 37 °C, 5% CO2.
  3. Wenn die MIO-M1-Zellen an Tag 4 zu 80%-90% konfluieren, führen Sie die folgenden Schritte aus.
    1. Übertragen Sie die Platte aus dem Inkubator in eine Laminar-Flow-Haube. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie ihn 2x mit 5 ml sterilem und vorgewärmtem PBS. Aspirieren Sie das PBS.
    2. Geben Sie 1 ml 0,5% Trypsin-EDTA-Lösung ab und inkubieren Sie bei 37 °C im CO 2-Inkubator für 3-5 Minuten, um die Zellen zu lösen.
    3. Fügen Sie 7 ml des gesamten DMEM-Mediums hinzu, um die Trypsin-Wirkung zu hemmen. Disaggregieren Sie gruppierte trypsinisierte MGCs, indem Sie langsam nach oben und unten pipettieren (P1000). Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.
    4. Zentrifuge bei 600 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in 2 ml kompletten DMEM-Medien. Übertragen Sie 1 ml dieser Zellsuspension in eine 100-mm-Platte, die 9 ml vorgewärmtes komplettes DMEM-Medium enthält.
    5. Wiederholen Sie die Aktion mit einer weiteren 100-mm-Platte. Inkubieren Sie die Platte für ca. 1 Tag bei 37 °C in einem 5% CO2 Inkubator.
  4. Wenn beide Platten zu 80% -90% konfluent werden (an Tag 6), übertragen Sie die Platte in eine laminare Flow-Haube. Führen Sie Schritt 1.3 aus. um ein Zellpellet zu erhalten.
  5. Dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständiger DMEM-Medien. Zählen Sie die MIO-M1-Zellen mit einem Hämozytometer (Neubauer-Kammer) und einer Trypan-Blue-Lösung, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Setzen Sie die Glasabdeckung auf den zentralen Bereich der Neubauer Kammer. Stellen Sie die Kammer auf eine ebene Fläche (z. B. einen Tisch oder eine Werkbank).
    2. Mischen Sie ein gleiches Volumen von Trypan-Blau-Fleck mit den Zellen. Mischen Sie beispielsweise 60 μL Trypanblau mit 60 μL Zellen für eine 1:2-Verdünnung.
    3. Aus dieser Mischung 10 μL mit einer Mikropipette in eine Neubauer-Kammer laden.
    4. Stellen Sie die beladene Neubauerkammer auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie dann das Licht ein und passen Sie die Helligkeit an.
    5. Bewegen Sie die Mikroskopstufe in eine optimale Position und passen Sie den Fokus an, bis ein scharfes Bild der Zellen erhalten wird.
    6. Zählen Sie die Zellen innerhalb der vier Quadrate (unterteilt in 16), die sich an der Ecke des Hämozytometers befinden (Volumen: je 0,1 mm3).
    7. Berechnen Sie die Zellkonzentration anhand der folgenden Gleichungen.
      Konzentration = (Anzahl der Zellen x 10.000)/Anzahl der Quadrate
      Konzentration = (Anzahl der Zellen x 10.000)/4
      Konzentration = Anzahl der Zellen x 2500
      HINWEIS: Wenn eine Zellverdünnung durchgeführt wird, sollte die erhaltene Konzentration vor der Verdünnung in die ursprüngliche Konzentration umgewandelt werden.
      Konzentration = (Anzahl der Zellen x 2500 x 2) = (Anzahl der Zellen x 5000 Zellen/ml)
    8. Stellen Sie die Zellsuspension auf 1 x 10 5 Zellen/ml in vollständigem DMEM-Medium und die Platte 2 ml dieser Zellsuspension in eine 6-Well-Platte (2 x 105 Zellen/Well) ein. Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Zellen homogen zu verteilen. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte über Nacht bei 37 °C in einem 5% CO 2-Inkubator.

2. Assay-Bedingungen und -Kontrollen

  1. Schließen Sie die folgenden experimentellen Kontrollen für jedes Experiment ein:
    1. Autofluoreszenzkontrolle (Zellen ohne DCFH-DA-Sonde, Steuerung zur Einstellung der Durchflusszytometerparameter).
    2. Basale Kontrolle (unstimulierte Zellen).
    3. Positivkontrolle (Zellen, die mit einem ROS-Induktor, A oder B behandelt werden).
    4. Negativkontrolle (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung behandelt werden)
    5. Probe (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung und ROS-Induktor, A oder B behandelt werden).

3. Durchführung des Assays

HINWEIS: Der Assay wird an Tag 7 durchgeführt. Verwenden Sie immer die richtige aseptische Technik und arbeiten Sie in einer Laminar-Flow-Haube, sofern nicht anders angegeben.

  1. Bereiten Sie ein niedriges Serum-DMEM vor. Ergänzen Sie DMEM mit 4,5 g/L D-Glucose und 110 mg/L Natriumpyruvat mit 0,5% hitzeinaktiviertem FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin und 50 U/ml Penicillin/Streptomycin. Bereiten Sie das frische Medium an dem Tag vor, an dem der MIO-M1 behandelt wird.
  2. Übertragen Sie die 6-Well-Platte (60% -70% Konfluenz) aus dem Inkubator auf eine laminare Flow-Haube. Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen 1x mit PBS. Fügen Sie 2 ml des niedrigen Serum-DMEM pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 2 h bei 37 °C, 5% CO2. Dies geschieht, um die Zellen zu verhungern.
  3. Nach dem Verhungern des Serums behandeln Sie die Zellen 6 h lang mit der antioxidativen Verbindung.
    1. Saugen Sie den Überstand ab und fügen Sie 2 ml des verdünnten Bestands unter den folgenden Bedingungen hinzu: Negativkontrolle (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung behandelt wurden) und Probe (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung und ROS-Induktor, A oder B behandelt wurden).
    2. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 6 h bei 37 °C, 5% CO2.
      HINWEIS: Wenn Sie eine andere antioxidative Verbindung oder einen ROS-Inhibitor verwenden, standardisieren Sie die optimale Zeit und Konzentration für die Reize.
  4. Nach 6 Stunden Inkubation behandeln Sie die Zellen mit ROS-Induktor, A oder B, für 30 min.
    1. Fügen Sie die Reize zu den folgenden Bedingungen hinzu: Positivkontrolle (Zellen, die mit einem ROS-Induktor, A oder B behandelt werden) und Probenvertiefungen (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung und ROS-Induktor, A oder B behandelt werden).
      HINWEIS: Halten Sie die Lagerlösungen auf Eis.
    2. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 30 min bei 37 °C, 5% CO2.
      HINWEIS: Wenn Sie einen anderen ROS-Induktor verwenden, standardisieren Sie die optimale Zeit und Konzentration für die Reize richtig.
  5. Laden Sie die Zellen mit der DCFH-DA-Sonde.
    1. Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen in der 6-Well-Platte 3x mit PBS, um alle Reize zu entfernen.
    2. Schalten Sie das Licht der Laminar-Flow-Haube aus und arbeiten Sie im Dunkeln. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:1000 der 5 mM DCFH-DA-Sonden-Stammlösung vor, um eine Endkonzentration von 5 μM DCFH-DA in DMEM ohne Phenolrot in einem 15-ml-Rohr zu erhalten.
    3. Mischen Sie vorsichtig mit einem Wirbel und fügen Sie 1 ml dieser Lösung zu den folgenden Vertiefungen hinzu: Basalkontrolle (nicht stimulierte Zellen), Positivkontrolle (Zellen, die mit einem ROS-Induktor behandelt werden), Negativkontrolle (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung behandelt werden) und Probenvertiefungen (Zellen, die mit antioxidativer Verbindung behandelt werden, und ROS-Induktor, A oder B).
    4. Geben Sie 1 ml DMEM ohne Phenolrot in die Autofluoreszenz-Kontrollzellen.
    5. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte für 30 min bei 37 °C, 5% CO2.
      HINWEIS: Die Sonde ist lichtempfindlich. Verwerfen Sie die gesamte nicht verwendete Sondenlösung.

4. Zellpräparation für die Durchflusszytometrie

  1. Nach 6 h die Platte auf Eis halten. Von diesem Schritt an ist es nicht mehr notwendig, die richtige aseptische Technik zu verwenden und in einer laminaren Durchflusshaube zu arbeiten.
  2. Waschen Sie die Zellen 3x mit 2 ml kaltem PBS pro Well. Fügen Sie jedem Bohrloch 0,5 ml kalt ablösenden Puffer hinzu. Ernten Sie die Zellen, indem Sie mit einer P1000-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren.
  3. Sammeln Sie sie in beschrifteten 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 600 x g für 5 min bei 4 °C.
    HINWEIS: Vermeiden Sie bei der Ernte der Zellen die Blasenbildung, indem Sie die P1000-Pipette auf 0,4 ml einstellen. Arbeiten Sie von diesem Schritt an schnell.
  4. Wenn die Zentrifugation endet, legen Sie markierte 1,5-ml-Röhrchen mit den Zellen auf Eis. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig und dissoziieren Sie das Zellpellet vorsichtig mit Klopfen.
  5. Fügen Sie 1 ml FACS-Puffer zu jedem markierten 1,5-ml-Röhrchen hinzu, um die Zellen zu waschen. Verwenden Sie bei Bedarf einen Wirbel mit der niedrigsten Intensität für die vollständige Dissoziation des Zellpellets. Zentrifen Sie sie bei 600 x g für 5 min bei 4 °C. Wiederholen Sie diese Schritte 2x mehr. (Führen Sie insgesamt drei Wäschen durch).
  6. Wenn die letzte Wäsche endet, beschriften Sie 5 ml runde Polystyrolröhrchen (Durchflusszytometrieröhrchen) für alle experimentellen Bedingungen (siehe Schritt 2.).
  7. Wenn die Zentrifugation endet, resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 μL FACS-Puffer. Dissoziieren Sie das Pellet vorsichtig in jedem 1,5-ml-Rohr unter Verwendung eines Wirbels. Auf beschriftete 5 ml Rundbodenrohre übertragen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis sie auf dem Durchflusszytometer analysiert werden.

5. Datenerfassung in einem Durchflusszytometer

  1. Erstellen Sie mit der Durchflusszytometrie-Software ein neues Experiment. Gehen Sie dazu in der Menüleiste zu Experiment und klicken Sie auf Neues Experiment (Strg+E).
  2. Gehen Sie außerdem in der Menüleiste zu Ansicht und klicken Sie auf die folgenden Optionen: Symbolleiste, Statusleiste, Browser, Zytometer, Inspektor, Arbeitsblatt, Erfassungs-Dashboard und Biexponentieller Editor, um diese Fenster im Arbeitsbereich anzuzeigen.
  3. Klicken Sie links neben der Software auf die Specimen_001 . Dadurch wird eine Liste der Röhren (Tube_001, Tube_002 usw.) geöffnet. Um die Röhrchen für die Steuerungen und verschiedene Versuchsbedingungen zu beschriften, doppelklicken Sie auf Tube_001, Tube_002 usw. und benennen Sie sie um (siehe Schritt 2.).
  4. Wählen Sie die zu analysierenden Kanäle / Parameter (FSC, SSC, FITC und APC oder ein anderes Fluorchrom, um den Quadranten zu sehen) in der ersten Röhre aus den Zytometereinstellungen des Experiments aus.
  5. Klicken Sie auf das Symbol Aktueller Röhrenzeiger , um die Röhre auszuwählen, und das Symbol ändert sich in Grün. Legen Sie die Röhre "Autofluoreszenzkontrolle" auf den Aspiratorarm und bewegen Sie die Basis vorsichtig nur nach links.
    1. Um das Beispiel "Autofluoreszenzkontrolle" auszuführen, wechseln Sie zum Fenster Erfassungsdashboard und klicken Sie auf Daten erfassen. Öffnen Sie ein Punktdiagramm für FSC (auf der x-Achse) im Gegensatz zu SSC (auf der y-Achse).
    2. Passen Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannung schnell an, um sicherzustellen, dass die Ereignisse im Diagramm angezeigt werden. Klicken Sie im Fenster Akquisitions-Dashboard auf Acquire beenden. In diesem Experiment wurden die folgenden Spannungseinstellungen verwendet: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
  6. Um die FITC-Spannung einzustellen, führen Sie die "Positivkontrolle (Zellen, die mit einem ROS-Induktor, A oder B behandelt werden)" aus. Passen Sie die Spannung so an, dass alle Ereignisse in einem Histogramm von FITC angezeigt werden. Verwenden Sie in diesem Fall eine Spannung von 280 V. Klicken Sie im Fenster Akquisitionsdashboard auf Erfassung beenden.
  7. Legen Sie die Röhre "Autofluoreszenzkontrolle" erneut auf den Aspiratorarm. Klicken Sie im Fenster Erfassungsdashboard auf Daten erfassen, dann auf Daten aufzeichnen, und wählen Sie die gewünschten Stoppbedingungen aus (z. B. 50.000 Ereignisse). Zeichnen Sie ein Tor um die Zellen von Interesse, ohne tote Zellen und Ablagerungen.
    HINWEIS: Diese werden als viel kleinere Ereignisse als die Hauptzellpopulation beobachtet und erscheinen unten links im Diagramm.
  8. Wenn die Erfassung beendet ist, entfernen Sie das Rohr vom Aspiratorarm. Die Ausrüstung wird sich selbst waschen. Klicken Sie im Fenster Erfassungs-Dashboard auf Nächste Röhre und führen Sie die Basalkontrolle (nicht stimulierte Zellen) aus. Klicken Sie auf Daten erfassen und dann auf Daten aufzeichnen.
    1. Erstellen Sie aus dem anfänglichen Gate (Gatter, das die toten Zellen und Trümmer ausschließt) ein weiteres Punktdiagramm von FITC (auf der x-Achse) im Vergleich zu APC (auf der y-Achse). Zeichnen Sie ein Quadrantentor und passen Sie die Koordinaten an, um die Ereignisse im unteren linken Quadranten des FITC versus APC-Plots zu visualisieren.
  9. Um die nächsten Proben aufzuzeichnen, entfernen Sie das Röhrchen und klicken Sie auf Nächstes Röhrchen > Daten erfassen > Daten aufzeichnen.
    HINWEIS: Das hier verwendete Durchflusszytometer (siehe Materialtabelle) zeichnet maximal 1 x 106 Ereignisse pro Röhrchen auf.
  10. Wenn die Aufzeichnung aller Röhren beendet ist, exportieren Sie die Daten auf die Festplatte D. Klicken Sie dazu auf Datei > > FCS-Dateien exportieren > Wählen Sie 3.0- oder 3.1-Version aus.
    HINWEIS: Obwohl die Datenerfassung mit einer Software (siehe Materialtabelle) in diesem Protokoll ausführlich beschrieben wird, kann jede andere Durchflusszytometrie-Software verwendet werden. Die Erfassungsparameter (FSC, SSC und FITC) können auf die gleiche Weise eingestellt werden, um die Ergebnisse zu erhalten.

6. Analyse der erfassten Daten

  1. Öffnen Sie die Software und fügen Sie die Beispiele mithilfe der Aktionsschaltfläche Beispiele hinzufügen hinzu. es befindet sich auf der Taskleiste oder im Navigationsband.
    1. Klicken Sie auf Beispiele hinzufügen.
    2. Navigieren Sie im Dateibrowser zum Ordner "Experimental".
    3. Wählen Sie den Ordner "Experimental" aus und klicken Sie auf "Auswählen".
      HINWEIS: Die Beispieldateien werden als Teil der Gruppe "Alle Beispiele" in den Arbeitsbereich geladen.
  2. Doppelklicken Sie im Arbeitsbereich auf das erste Beispiel: Autofluoreszenzkontrolle.
    HINWEIS: Diese Aktion öffnet ein Diagrammfenster, in dem Ereignisse entlang der Vorwärtsstreuung (FSC-A auf der x-Achse) im Gegensatz zu den Parametern der Seitenstreuung (SSC-A auf der y-Achse) dargestellt werden.
  3. Zeichnen Sie ein Polygon-Gate, um die interessierenden Zellen zu isolieren, mit Ausnahme von toten Zellen und Ablagerungen.
    1. Klicken Sie auf das Polygontor-Werkzeug .
    2. Klicken Sie innerhalb des Plots, um das Polygontor zu bilden. Machen Sie so viele Seiten wie nötig.
    3. Doppelklicken Sie auf den letzten Punkt, um das Polygon zu schließen und das gewünschte Tor zu erstellen.
    4. Geben Sie einen Namen für das Gate ein, z. B. "MIO-M1-Zellen", und drücken Sie OK.
      HINWEIS: Ein neues Diagrammdiagrammfenster wird angezeigt, in dem nur die MIO-M1-Ereignisse ohne tote Zellen und Trümmer angezeigt werden.
    5. Wiederholen Sie dies mit allen zu analysierenden Proben.
  4. Ändern Sie das Diagramm in ein Histogramm. Klicken Sie dazu auf die Parameterbeschriftung der X-Achse und wählen Sie FITC-A. Klicken Sie auf die Parameterbeschriftung der Y-Achse und wählen Sie Histogramm aus. Dadurch wird die Handlung in ein eindimensionales Histogramm umgewandelt.
  5. Fügen Sie Statistiken mithilfe des Fensters "Statistik hinzufügen" hinzu.
    1. Klicken Sie unterhalb des Histogrammdiagramms auf Statistiken hinzufügen. Das Programm öffnet ein neues Statistikfenster.
    2. Wählen Sie links im neuen Fenster die Statistik Geometrisches Mittel.
    3. Wählen Sie die Zellen Population MIO-M 1 aus.
    4. Wählen Sie aus der Liste der verfügbaren Parameter FIT-C aus.
    5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen , um sie auf die Analyse anzuwenden.
      HINWEIS: Dadurch wird die neue Statistik "geometrisches Mittel: FITC" im Stichproben-Gating-Baum erstellt, und ihre Werte werden in Ihrem Arbeitsbereich angezeigt.
  6. Legen Sie diese geometrischen Mittelwerte in ein Statistikprogramm und analysieren Sie es.
  7. Klicken Sie auf das L-Symbol, um den Layout-Editor zu öffnen. Dieses Symbol befindet sich auf der Registerkarte Menü im Arbeitsbereich. Positionieren Sie das Arbeitsbereichsfenster und den Layout-Editor nebeneinander.
    HINWEIS: Der Layout-Editor ist ein separates Arbeitsbereichsfenster mit Werkzeugen zum Anzeigen mehrerer Diagrammdiagramme und Statistiken in einem einfachen grafischen Bericht. Dies kann mit der von Ihnen bevorzugten Erweiterungsdatei wie PDF oder JPG exportiert werden.
    1. Ziehen Sie MIO-M 1-Zellen aus der Gating-Struktur eines Beispiels im Arbeitsbereichsfenster in den Layout-Editor.
    2. Stellen Sie sicher, dass im Layout-Editor ein Histogrammdiagramm mit den Ereignissen im Gate angezeigt wird. Weitere grundlegende Informationen werden in einem Textfeld unten aufgeführt.
    3. Ziehen Sie alle Beispiele, um sie im selben Diagramm zu vergleichen. Das Programm wird sie überlappen.
    4. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Histogrammdiagramm, und wählen Sie Eigenschaften aus. Das Programm öffnet ein neues Graph-Definitionsfenster. Dieses Fenster verfügt über vier Registerkarten (Kommentieren, Schriftarten, Legende und Angeben). Klicken Sie auf die Registerkarte Angeben, und ändern Sie die y-Achse von Auto in Modal. Klicken Sie auf Übernehmen.
    5. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Beispiel, und ändern Sie Farbgebung, Linienstil, Linienstärke usw., um das Diagramm zu personalisieren.
    6. Um das Bild zu exportieren, klicken Sie auf die Registerkarte Datei und wählen Sie unmittelbar danach Bild speichern im Dokumentband aus. Wählen Sie den bevorzugten Typ der Bilddatei (z. B. PDF).
      HINWEIS: Ein Dialogfeld zum Speichern wird geöffnet, in dem Sie aufgefordert werden, einen Speicherort auszuwählen. Klicken Sie auf Speichern.
  8. Speichern Sie die Analyse als Arbeitsbereichsdatei (WSP-Datei).
    1. Klicken Sie in der oberen linken Ecke auf das Symbol Zytometrieanalyse , und wählen Sie Speichern unter aus.
    2. Wählen Sie Als Arbeitsbereich speichern (WSP ), um das Dokument mit Daten und Analysen zu speichern.
    3. Geben Sie einen Namen für die Arbeitsbereichsdatei ein.
    4. Klicken Sie auf Speichern.

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Ergebnisse

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Wie im Protokollabschnitt beschrieben, haben wir repräsentative und quantitative Daten gezeigt, die die Durchflusszytometrie-Detektion der ROS-Produktion mit der Fluoreszenzsonde DCFH-DA aus MIO-M1-Zellen demonstrieren, die mit ROS-Induktor, A oder B stimuliert wurden. Wie erwartet, beobachteten wir Veränderungen der FITC-Fluoreszenz in unstimulierten Zellen oberhalb der Autofluoreszenzspiegel (Abbildung 1A, vergleichen Sie "Basalkontrolle" vs. "Autofluoreszenzkontrolle", Punktdiagrammdiagra...

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Diskussion

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Mehrere pathologische Zustände wie Krebs, entzündliche Erkrankungen, Ischämie / Reperfusion, ischämische Herzerkrankungen, Diabetes und Retinopathien sowie physiologische Situationen wie das Altern führen zu einer ROS-Überproduktion 6,7,8,9,10,11. Daher sind der Nachweis, die Messung und das Verständnis des Signalwegs, der an...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken María Pilar Crespo und Paula Alejandra Abadie von CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinien) für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie und Gabriela Furlan und Noelia Maldonado für die Zellkulturunterstützung. Wir danken auch Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication von FCQ) für die Videoproduktion und -bearbeitung.

Dieser Artikel wurde durch Zuschüsse von Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) und Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (alle an M.C.S.) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure (HEPES)Gibco von life technologies15630-080
BD FACSCanto II DurchflusszytometerBDBiosciences FACSCanto
BD FACSDiva softwareBD Biosciences
Zellkulturschalen 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
ZentrifugeThermoSorvall legend micro 17 R
Zentrifugenröhrchen (15 ml)BIOFILCFT011150
Zentrifugenröhrchen (50 ml)BIOFILCFT011500
KryovialCRYO. S - Greiner Bio-One126263
DimethylsulfoxidSigma-AldrichW387520-1KG
Dinatriumhydrogen-phosphat-HeptahydratMerck106575
DMEM ohne PhenolrotGibco von life technologies31053-028
Dulbecco' s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Gibco von life technologies11995065
Ethylendiamin Tetraessigsäure (EDTA), Dinatriumsalz, DihydratMerck324503
Fötales RinderserumInternegocios
FlowJo v10 SoftwareBD Biosciences
GlukoseMerck108337
Hämozytometer, Neubauer-KammerBOECO,Deutschland
Laminar-Flow-HaubeESCOAC2-6E8
L-Glutamin (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RotInvitrogen  M36008
Penicillin/StreptomycinGibco von life technologies15140-122
KaliumchloridMerck104936
KaliumdihydrogenphosphatMerck4878
Runde Polystyrolröhrchen 5 ml (Durchflusszytometrieröhrchen)Falcon - CorningBD-352008
NatriumazidMerck822335
NatriumchloridMerck106404
NatriumhydroxidMerck106462
SPINWIN Mikrozentrifugenröhrchen 1,5 mlTarson500010-N
Gewebekulturplatte 6 WellBIOFILTCP011006
TrypanblauMerck111732
Trypsin-EDTA 0,5% 10XGibco von life technologies15400-054
Vortex-MischerLabnet International, Inc.

Referenzen

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  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43(2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199(2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

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Oxidativer Stressantioxidative AbwehrRedox GleichgewichtFluoreszenzhistogrammzellul re Hom ostaseROS Quantifizierung

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