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Adsorptiver Bioprozess verbessert Ausbeute an Melanin aus Pseudomonas stutzeri

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DOI:

10.3791/63339

⸱

12. Januar 2022

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering, National Institute of Technology, 2Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll über den adsorptiven Bioprozess zur Herstellung eines biologischen Produkts vor, insbesondere eines Pigments, das seine eigene Biosynthese hemmt und das Wachstum des Mikroorganismus, der es produziert, hemmt.

Zusammenfassung

Melanine sind natürliche Pigmente, und das Vorhandensein von Indolring und zahlreichen Funktionsgruppen macht Melanin zu einer idealen Wahl für viele Anwendungen wie UV-Schutzmittel, Hautpflege, Kosmetik usw. Ein mariner Pseudomonas stutzeri produziert Melanin ohne Zusatz von Tyrosin. Die Rückkopplungshemmung wurde durch Melanin in der Kultur eines Melanin-produzierenden Meeresbakteriums, Pseudomonas stutzeri, beobachtet. Melanin zeigte auch eine mikrobielle Wachstumshemmung. Die auf dem Han-Levenspiel-Modell basierende Analyse identifizierte eine nicht kompetitive Produkthemmung von Melanin auf das Zellwachstum. Das Tyrosinase-Enzym, das Melanin produziert, wurde durch Melanin gehemmt. Die doppelte reziproke Darstellung der enzymatischen Reaktion in Gegenwart unterschiedlicher Melaninkonzentrationen zeigte eine nicht kompetitive Produkthemmung. Es wurde ein Adsorptionsmittel-basierter adsorptiver Bioprozess entwickelt, um die Rückkopplungshemmung durch Melanin zu reduzieren. Verschiedene Adsorbentien wurden gescreent, um das beste Adsorptionsmittel für die Melaninadsorption auszuwählen. Dosierungsmenge und -zeit wurden optimiert, um den adsorptiven Bioprozess zu entwickeln, was zu einer 8,8-fachen Steigerung der Melaninproduktion durch das Meeresbakterium Pseudomonas stutzeri (153 mg/L bis 1349 mg/L) ohne Supplementierung von Tyrosin und Hefeextrakt führte.

Einleitung

Melanine sind Polyphenolverbindungen, deren monomere Einheit der Indolring ist. Melanine sind für die meisten schwarzen, braunen und grauen Färbungen von Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen verantwortlich1. Die häufigsten Melanine sind Eumelanine, dunkelbraune oder schwarze Pigmente, die bei Wirbeltieren und Wirbellosen weit verbreitet sind2. Kopffüßer, Pflanzen und Mikroben sind die Hauptquellen für Melanin3. Melanin, das aus Mikroorganismen gewonnen wird, hat mehrere Vorteile gegenüber Melanin aus Kopffüßern und Pflanzen. Sie wachsen schnell und verursachen keine Probleme mit saisonalen Schwankungen. Außerdem modifizieren sie sich je nach Wachstumsmedium und den bereitgestellten Betriebsbedingungen. Unter Berücksichtigung all dieser Tatsachen werden die mikrobiellen Quellen als eine der Hauptquellen für Melanin mit potenziellen kommerziellen Anwendungen genutzt 4,5,6. Guo et al. verwendeten rekombinante Streptomyces kathirae SC-1, um Melanin bis zu 28,8 g/L in einem optimierten Medium zu produzieren7. Lagunas-Muñoz et al. Erhielt etwa 6 g/l Melanin in rekombinanten E. coli8. Wang et al. erhielten nach Mediumoptimierung etwa 4,2 g/l lösliches Melanin9. Die Forscher untersuchten auch Meereskulturen, um Melanin zu produzieren. Kiran et al. produzierten Melanin aus marinen Pseudomonas-Arten 10. Kumar et al. isolierten Pseudomonas stutzeri HMGM-7 aus Meeresalgen, die Melanin in der Nährbrühe produzierten. Alle gemeldeten Melaninproduzenten benötigen Nahrungsergänzungsmittel, Hefeextrakt und/oder Pepton für die Melaninproduktion, was das Scale-up des Bioprozesses behindern könnte. Raman et al. untersuchten die Melaninproduktion aus Aspergillus fumigatus AFGRD105, die ohne teure Zusatzstoffe auskam11.

Ein Meeresbakterium namens Pseudomonas stutzeri, das aus Algen isoliert wurde, wurde für die Melaninproduktion ausgewählt. Dieser Mikroorganismus benötigt keine zusätzliche Supplementierung von Tyrosin und Hefeextrakt für die Produktion von löslichem Melanin und wächst in meerwasserbasierten Medien, wodurch der Fußabdruck des Trinkwassers und die mittleren Kosten reduziert werden. Thaira et al. berichteten in einer früheren Veröffentlichung über einen optimierten Bioprozess unter Verwendung von Kokoskuchenmehl zur Herstellung von Melanin-Nanopigmenten unter Verwendung dieses Meeresbakteriums12. Das produzierte Melanin wurde zur hocheffizienten Entfernung von Schwermetallen aus dem synthetischen Grundwasser verwendet. Bei der Medienoptimierung wurde jedoch eine plausible Rückkopplungshemmung des Melanins auf das Wachstum und die Produktbildung festgestellt. Daher wird in diesem Protokoll die Rückkopplungshemmung von Melanin untersucht und mit Hilfe des verallgemeinerten Han-Levenspiel-Modells quantifiziert. Es wurde ein einfaches und effektives adsorptives Bioprozessprotokoll entwickelt, um die Rückkopplungshemmung so weit wie möglich zu reduzieren.

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Protokoll

1. Wachstum und Erhaltung der Kultur von Pseudomonas stutzeri .

  1. Besorgen Sie sich das Bakterium Pseudomonas stutzeri vom MTCC Chandigarh (Lieferung als gefriergetrocknete Ampulle).
    1. Desinfizieren Sie die Oberfläche der Ampulle mit Alkohol (70%). Markieren Sie die Ampulle in der Nähe der Mitte des Messgeräts und brechen Sie sie an der markierten Stelle.
      HINWEIS: Beim Öffnen der Ampulle ist Vorsicht geboten, da sich der Inhalt im Vakuum befindet. Treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, wenn Sie die Ampulle zerbrechen, da eine Schnappöffnung den Wattestärkel zu einem Ende zieht und eine hastige Öffnung die lyophilisierten feinen Partikel der Mikrobe an die Luft abgibt.
    2. Entfernen Sie den Wattestäpsel vorsichtig mit einer sterilisierten Pinzette und geben Sie 0,3 ml Luria Bertani (LB) Brühe in die Ampulle. 30 min ziehen lassen.
    3. 100 μl der Suspension werden mit 10 mL LB-Bouillon (in einem 100-ml-Konuskolben) beimpft und bei 180 U/min bei 37 °C in den Inkubatorschüttler gegeben. Gleichzeitig werden 100 μl der Suspension in den festen LB-Agar überführt und verteilt, um isolierte Kolonien zu erhalten. Inkubieren Sie es über Nacht bei 37 °C.
  2. Sobald die Kultur gewachsen ist, lagern Sie sie bei 4 °C.
  3. Führen Sie alle 4 Wochen eine Subkultur durch, indem Sie ein Volk auf eine frische LB-Agarplatte streichen und die Platte bei 37 °C über Nacht inkubieren, damit die Völker erscheinen.

2. Hemmungsstudien von Melanin auf das Wachstum und die Enzymaktivität

  1. Bereiten Sie das Nährmedium vor, indem Sie 51,4 g/l Glukose, 49,8 g/l Kokoskuchenmehl, 0,09 g/l, 0,03 g/l und 0,05 g/l CuSO4, FeSO4 bzw. MgSO4 in künstliches Meerwasser geben (Materialtabelle). Alle Experimente werden in einem 250-ml-Schüttelkolben mit einem Füllvolumen von 15 mL bei 200 U/min, 37 °C und einem anfänglichen pH-Wert von 7 durchgeführt.
  2. Geben Sie zu Beginn des Bioprozesses unterschiedliche Konzentrationen von Melanin (100 mg/L, 200 mg/L, 500 mg/L und 1000 mg/L) in jedes Kulturmedium.
  3. Messen Sie die spezifische Wachstumsrate, die Enzymaktivität der Zellen und das Melanin in unterschiedlichen Zeitintervallen des Bioprozesses für jede hinzugefügte Melaninkonzentration (Abschnitt 3.2).

3. Modellierung der Melanin-Hemmungskinetik

  1. Verwenden Sie die folgende verallgemeinerte Gleichung von Han und Levenspiel13, um die Hemmungskinetik der Melaninproduktion zu modellieren:
    figure-protocol-1 (1)
    Wo
    μ = scheinbare spezifische Wachstumsrate (1/h)
    μmax = maximale spezifische Wachstumsrate (1/h)
    p = Produktkonzentration (g/L)
    p *= kritische Produktkonzentration, bei der das Wachstum aufhört (g/L)
    s = Substratkonzentration (g/L)
    m,n = Parameter
    Die obige Gleichung kann umgeschrieben werden als
    figure-protocol-2 (2)
    Wo
    figure-protocol-3 (3)
    und figure-protocol-4 (4)
    Die obige Gleichung kann wie folgt zu einem doppelten reziproken Diagramm von 1/μ gegen 1/s umgeordnet werden
    figure-protocol-5 (5)
  2. Zeichnen Sie eine gerade Linie unter Verwendung der Daten verschiedener spezifischer Wachstumsraten und Substratkonzentrationen unter Verwendung der obigen Gleichung. Der Schnittpunkt auf der Y- bzw. der X-Achse ergibt μmax und Ks, die in Eqution 3 bzw. 4 substituiert werden können, um μobs und Kobs zu erhalten.
    Gleichung (3) kann wie folgt geschrieben werden:
    figure-protocol-6 (6)
  3. Berechnen Sie die spezifische Wachstumsrate der in Schritt 2.2 angebauten Kultur und benennen Sie sie als μ obs.
  4. In Gleichung (6) ist der Wert der spezifischen Wachstumsrate zu verwenden, der in Schritt 3.3 ermittelt wurde. Passen Sie die Daten an eine lineare Gleichung an, und berechnen Sie die Steigung und den Schnittpunkt.
  5. Verwenden Sie Gleichung (3), um die maximale spezifische Wachstumsrate in Abwesenheit von Melanin zu berechnen.

4. Entwicklung des adsorptiven Bioprozesses

  1. Alle Experimente werden in einem 250-ml-Schüttelkolben mit einem Füllvolumen von 15 mL bei 200 U/min, 37 °C und einem anfänglichen pH-Wert von 7 durchgeführt.
  2. Führen Sie den endgültigen optimierten Bioprozess in einem 5-Liter-Rührtank-Bioreaktor mit einem 3-Liter-Feilvolumen durch. Halten Sie den pH-Wert der Kultur zwischen 7 und 7,5 % und den gelösten Sauerstoff zwischen 50 % und 60 % der Sättigung in den Bioreaktorstudien.

5. Auswahl des besten Adsorptionsmittels aus verschiedenen verfügbaren Adsorbentien

  1. Geben Sie verschiedene Adsorptionsmittel wie Aluminiumoxid, Zeolith, Celit, Fullerde und Aktivkohle in verschiedene Kolben, die die Kulturbrühe enthalten.
  2. Jedes Adsorptionsmittel separat in einer Konzentration von 1 g/l zur Kulturbrühe geben und in einem Rotationsschüttler bei 150 U/min für 12 halten.
  3. Die Adsorbentien werden durch Zentrifugation bei 5000 x g für 10 min getrennt und die Extinktion des Überstands bei 400 nm mit einem Spektralphotometer gemessen.
  4. Wählen Sie das Adsorptionsmittel, das die maximale Menge an Melanin aus der Kulturbrühe adsorbiert.

6. Einfluss der Dosierungszeit des Adsorptionsmittels

  1. Starten Sie den Bioprozess und fügen Sie das Adsorptionsmittel hinzu, das die höchste Adsorption von Melanin aus der Kultur erzielt (ausgewählt nach Abschnitt 5). Die im ersten Schritt gewählte Konzentration beträgt 1 g/L.
  2. Messen Sie die maximale Melaninproduktion gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll12.
  3. Wiederholen Sie Schritt 6.1, indem Sie das Adsorptionsmittel 12 Stunden nach Beginn des Bioprozesses hinzufügen und die Melaninproduktion zu verschiedenen Zeitpunkten des Bioprozesses messen.
  4. Wiederholen Sie Schritt 6.3, indem Sie das Adsorptionsmittel nach 24 h, 36 h und 48 h nach Beginn des Bioprozesses hinzufügen.
  5. Vergleichen Sie das in jedem Bioprozesslauf produzierte Melanin und ermitteln Sie die beste Dosierungszeit für die maximale Melaninproduktion und -rückgewinnung.

7. Wirkung der Menge der Adsorptionsmitteldosierung

  1. Geben Sie unterschiedliche Konzentrationen des besten Adsorptionsmittels (0,5, 1, 2, 4, 6, 8 und 10 g/l) zu dem in Abschnitt 6 angegebenen Zeitpunkt in die Kulturen.
  2. Ernten Sie den Bioprozess durch Zentrifugation bei 5000 x g für 10 min.
  3. Sammeln Sie den Überstand und berechnen Sie die Melaninmenge, indem Sie die Extinktion bei 400 nm messen.
  4. Waschen Sie das Pellet, das das Adsorptionsmittel enthält, jeweils zweimal mit destilliertem Wasser und Ethanol, um Zellen und andere Verbindungen zu entfernen, die an das Adsorptionsmittel gebunden sind. Führen Sie den Waschschritt durch Zentrifugieren bei 5000 x g für 10 min durch.
  5. Geben Sie eine 0,1 M NaOH-Lösung in das gewaschene Adsorptionsmittel, um das Melanin zu desorbieren.
  6. Das Gemisch wird bei 5000 x g für 10 min zentrifugiert und die Melaninmenge im Überstand bei 400 nm mit einem Spektralphotometer gemessen.
  7. Wiederholen Sie den Desorptionsvorgang dreimal oder bis das Adsorptionsmittel wieder seine normale Farbe angenommen hat.
  8. Reduzieren Sie den pH-Wert dieser konzentrierten desorbierten Melaninlösung auf 3 oder weniger, indem Sie 1 N HCl mit einem Rührer mit magnetischen Kügelchen hinzufügen, um Melanin auszufällen. Lagern Sie die saure Lösung 1 h im Kühlschrank, um den Niederschlag bei Bedarf zu erhöhen.
  9. Das so gewonnene ausgefällte Melanin wird mit destilliertem Wasser durch Zentrifugation bei 5000 x g 10 min gewaschen, getrocknet und bei 4 °C gelagert.

8. Mathematische Modellierung des Bioprozesses

  1. Kinetik des Biomassewachstums
    1. Quantifizieren Sie die Wachstumsrate der Biomasse unter Verwendung des folgenden modifizierten Verhulset-Modells, das für die Produkthemmung entwickelt wurde, wie in der folgenden Gleichungbeschrieben 14,15,16,17,
      figure-protocol-7 (7)
      Wo
      x = Biomassekonzentration (g/L)
      xm = maximale Biomassekonzentration (g/L)
      μobs = maximale spezifische Wachstumsrate (1/h) gemäß Gleichung (2)
      Vazques et al. (2008) leiteten aus Gleichung (7) die folgende Gleichung für die Biomassekonzentration ab
      figure-protocol-8 (8)
      Wo
      vx = Wachstumsrate der Biomasse (g/L/h) = μobs·x
      μobs       = beobachtete spezifische Wachstumsrate (1/h)
      τx = Verzögerungszeit (h)
      t = Zeit (h)
    2. Verwenden Sie Gleichung (8), um die Biomassekonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten des Bioprozesses zu berechnen und das Wachstumsprofil von Pseudomonas stutzeri zu simulieren.
  2. Kinetik des Substratverbrauchs
    HINWEIS: Das Substrat wird für das Wachstum von Biomasse, die Produktbildung und die Pflege in einem Bioprozess verwendet.
    1. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Substratausnutzung im Bioprozess auszugleichen:
      figure-protocol-9 (9)
      Der Großteil der Glukose wird für die Erzeugung von Biomasse verwendet; Zur Vereinfachung würde daher die Vernachlässigung des Substratverbrauchs für die Produktbildung Gleichung (9) auf Folgendes reduzieren:
      figure-protocol-10 (10)
      Wo
      S = Substratkonzentration (g/L)
      YP/S = Produktausbeuteskoeffizient, d. h. Melanin-Ausbeutekoeffizient (g/g)
      P = Produktkonzentration (g/L), d.h. Melaninkonzentration (g/L)
      YX/S = Ertragskoeffizient aus Biomasse (g/g)
      ms = Erhaltungskoeffizient (g/g/h)
      Integriert man die obige Gleichung von der Zeit t = 0 bis zur Zeit t = t und setzt man den Wert von x aus Gleichung (8) ein, erhält man die folgende Gleichung für das Substratkonzentrationsprofil17:
      figure-protocol-11 (11)
      Dabei ist s0 = anfängliche Substratkonzentration (g/L) und x0 = anfängliche Biomassekonzentration (g/L)
    2. Verwenden Sie Gleichung (11), um die Substratkonzentration in verschiedenen Zeitintervallen des Bioprozesses zu berechnen, oder wenn die Substratkonzentration bekannt ist, verwenden Sie dieselbe Gleichung, um die in der Gleichung angegebenen Parameter zu schätzen.
  3. Kinetik der Melaninproduktion
    1. Verwende die Ludeking-Piraten-Gleichung, um die Melaninproduktion zu simulieren. Melanin ist jedoch wachstumsassoziiert und daher wird der nicht wachstumsassoziierte Produktbildungsterm vernachlässigt, und die vereinfachte Gleichung kann wie folgt geschrieben werden:
      figure-protocol-12 (12)
      Wo
      α = Ludeking-Piraten-Konstante in Verbindung mit wachstumsbedingter Produktbildung (g/g)
      Die Integration der Gleichung (12) vom Zeitpunkt t = 0 bis t = t ergibt die folgende Gleichung für das Produktkonzentrationsprofil:
      figure-protocol-13 (13)
    2. Verwenden Sie Gleichung (13), um α zu berechnen .
  4. Schätzung kinetischer Parameter
    1. Schätzen Sie alle oben genannten Parameter mit der nichtlinearen Methode der kleinsten Quadrate der Parameterschätzung unter Verwendung eines geeigneten Softwaretools (z. B. Microsoft Excel Solver-Tool).
    2. Verwenden Sie Batch-Experimentdaten für die Parameterschätzung und minimieren Sie die Summe des quadrierten Fehlers (SSE) mit dem Solver-Werkzeug, wie in der folgenden Gleichung angegeben:
      Minimieren
      figure-protocol-14 (14)
      Wo
      xsim = simulierter Wert und xexp = experimenteller Wert

9. Analytische Techniken

  1. Melanin-Extraktion
    1. Zentrifugieren Sie die Wachstumskultur bei 5000 x g für 10 min, um die Biomasse zu entfernen.
    2. Geben Sie dem Überstand das gleiche Volumen von 1 M NaOH zu.
    3. Säuern Sie den alkalischen Überstand auf pH 2 an, indem Sie 1 N HCl hinzufügen, um das Melanin auszufällen.
    4. Zentrifugieren Sie den angesäuerten Überstand bei 12000 x g für 20 min, um Melanin zu sammeln.
    5. Das gesammelte Melanin dreimal mit 5 ml destilliertem Wasser waschen, über Nacht bei Raumtemperatur (RT) trocknen und bei 4 °C18 lagern.
  2. Melanin-Quantifizierung
    1. Bereiten Sie verschiedene Konzentrationen von Melaninlösungen (0-500 mg/L) vor, indem Sie die entsprechende Menge Melanin in künstlichem Meerwasser (pH 8) auflösen.
    2. Die Extinktion wird bei 400 nm mit dem Spektralphotometer18 gemessen.
    3. Bereiten Sie die Kalibrierungskurve anhand der obigen Daten vor.
    4. Die Wachstumskultur wird 10 min lang bei 5000 x g zentrifugiert, um die Biomasse zu entfernen und die Absorption des Überstands bei 400 nm zu messen. Berechnen Sie die Melaninkonzentration in der Wachstumskultur unter Verwendung der in Schritt 9.2.3 erstellten Kalibrierkurve
  3. Tyrosinase-Assay
    1. Befolgen Sie das unten angegebene Protokoll für den von Ren et al. (2013)19 entwickelten Tyrosinase-Enzymassay, um die Enzymaktivität von Tyrosinase zu bestimmen, die aus der Kulturbrühe von Pseudomonas stutzeri extrahiert wurde.
    2. Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 5.000 x g , um die Zellen zu sammeln.
    3. Die Zellen werden in kaltem 100 mM Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 beschallt und das Homogenat 15 Minuten lang bei 9000 x g zentrifugiert und der Überstand, eine Quelle des Tyrosinase-Enzyms, aufgefangen.
    4. 0,2 ml der im obigen Schritt erhaltenen Enzymlösung werden zu 2,8 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 1 mM L-Tyrosin (Substrat) hinzugefügt.
    5. Beobachten Sie die Bildung von Dopachrom, indem Sie die Extinktion bei 475 nm messen.
    6. Berechnen Sie die Tyrosinase-Aktivität wie folgt. Eine internationale Einheit (IE) der Tyrosinaseaktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die erforderlich ist, um 1 μmol L-Tyrosin zu Dopachrom pro Minute zu oxidieren. Berechnen Sie dies, indem Sie den molaren Extinktionskoeffizienten von Dopachrom (3600 L·M-1·cm-1) nach der folgenden Gleichung verwenden:
      figure-protocol-15 (15)
  4. Schätzung der Biomasse
    1. Entnehmen Sie 5 ml der Proben im Abstand von 4 Stunden in der Biosicherheitswerkbank unter Beibehaltung der Sterilität. Entflammen Sie den Wattestopfen des Kolbens vor und nach der Probenentnahme, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination zu verringern. Messen Sie die optische Dichte (OD) der Proben bei 660 nm für alle diese Proben.
      HINWEIS: Das unbeimpfte Medium dient als Rohling. Diese Messwerte werden verwendet, um das Wachstum der Mikroorganismen zu untersuchen.
    2. Zentrifugieren Sie die Kulturbrühe bei 5000 x g für 10 min und 4 °C, sammeln Sie das Zellpellet und trocknen Sie das Pellet für 8 h bei 60 °C in einem Heißluftofen, um die trockene Zellmasse zu erhalten.
    3. Erstellung der Kalibrierkurve unter Verwendung des in Schritt 9.4.1 gemessenen Außendurchmessers und der entsprechenden Biomasse in Schritt 9.4.2
    4. Verwenden Sie die Kalibrierkurve (OD = 0.82٠Biomasse (g/L)), um die unbekannte Menge an Biomasse zu messen, indem Sie die optische Dichte der Kulturbrühe zu einem bestimmten Zeitpunkt messen.
  5. Schätzung der DNA
    1. Schätzen Sie die Menge an DNA in der Probe, indem Sie die optische Dichte bei 260 nm messen.
    2. Berechnen Sie die DNA mit der folgenden Formel:
      figure-protocol-16 (16)
      Wo
      A260= Extinktion bei 260 nm
      0,1 = Volumen der Probe
      1 = Extinktion von DNA-Standardlösung mit einer Konzentration von 50 μg/mL, bei 260 nm
  6. Schätzung des Proteins
    1. Schätzen Sie die Proteinmenge in den Proben mit einem Bradford-Proteinschätzungskit (Table of Materials).
    2. Geben Sie 5 mL des Bradford-Reagenzes zu 0,1 mL des Überstands und bewahren Sie es 5 Minuten lang auf. Die im Überstand vorhandenen Proteine reagieren mit dem Bradford-Reagenz und bilden einen farbigen Komplex.
    3. Messen Sie die Extinktion bei 595 nm20 mit dem Spektralphotometer.
  7. Schätzung des Gesamtreduktionszuckers (TRS)
    1. Messen Sie den TRS mit der Dinitrosalicylsäure (DNS)-Methode21.
    2. Bereiten Sie die DNS-Lösung vor, indem Sie 1 g DNS in 50 ml destilliertem Wasser auflösen. Geben Sie 30 g Natriumkaliumtartarat in kleinen Mengen zu dieser Lösung, bis die Farbe der Lösung milchig gelb wird, gefolgt von transparentem orange-gelb unter Zugabe von 20 ml 2 N NaOH. Erhöhen Sie das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 mL und lagern Sie es im Dunkeln.
    3. Bereiten Sie die Glukose-Arbeitslösung (0,01 M) vor, indem 180 mg Glukose in 100 ml destilliertem Wasser in einem Standardkolben gelöst werden.
    4. Pipettieren Sie Standard-Glukoselösung (0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1 ml) in 5 separate Reagenzgläser aus. Verwenden Sie ein Reagenzglas mit destilliertem Wasser (1 ml) als Blindlösung.
    5. Erhöhen Sie das Volumen in jedem Reagenzglas auf bis zu 2 ml, indem Sie destilliertes Wasser verwenden.
    6. Geben Sie 1 ml DNS-Reagenz in jedes Reagenzglas und bedecken Sie es mit Aluminiumfolie.
    7. Die Reagenzgläser in einem kochenden Wasserbad 5 min erhitzen und auf RT abkühlen lassen.
    8. Geben Sie 9 ml destilliertes Wasser in jedes Reagenzglas und mischen Sie es gut. Messen Sie den OD des Inhalts bei 575 nm mit einem Spektralphotometer.
    9. Messen Sie die Konzentration anhand einer Kalibriertabelle, die mit der Glukosemenge auf der X-Achse im Vergleich zur Extinktion bei 575 nm (A575) auf der Y-Achse erstellt wurde.
  8. Analyse der Partikelgröße
    1. Dispergieren Sie das biosynthetisierte Melanin in destilliertem Wasser (1 ml) mit einem Ultraschallgerät.
    2. Geben Sie die dispergierte Probenlösung (1 ml) in den Nanopartikelanalysator und messen Sie die Partikelgröße gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  9. Analyse der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
    1. Das nach der Extraktion gewonnene Melaninpulver wird 8 h lang bei 60 °C getrocknet.
    2. Laden Sie das Melaninpulver in die TEM-Probenmatrix und messen Sie die Größe mit dem Transmissionselektronenmikroskop gemäß dem Bedienerprotokoll.

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Ergebnisse

Abbildung 1A,B zeigt das Wachstum und die Melaninproduktion unter dem Einfluss unterschiedlicher anfänglicher Melaninkonzentrationen. Das Zellwachstum und die Melaninproduktion nahmen mit zunehmender Anfangskonzentration von Melanin deutlich ab. Bei einer anfänglichen Melaninkonzentration von 500 mg/L im Medium reduzierten sich die Biomasse und das Melanin auf fast 50 % des in der Kontrolle erzielten Maximalwerts. Bei 1000 mg/l anfänglicher Melaninkonzentration kam es zu ein...

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Diskussion

Produkthemmungen sind ein großer Engpass in der Bioprozesstechnik, der zu einer verminderten Produktivität führt. Es gibt verschiedene Methoden, um die Produkthemmung zu reduzieren, wie z. B. kontinuierliche Bioprozess- und In-situ-Produktentfernungstechniken. Diese Optionen erfordern jedoch eine vollständige Überholung der bestehenden Bioprozessanlage 23,24,25,26,27,28.

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt

Danksagungen

Wir danken dem indischen Department of Science and Technology (DST/TSG/WP/2014/58) und dem National Institute of Technology Karnataka für die Bereitstellung von Mitteln für die Entwicklung des oben genannten Protokolls.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  Aluminiumoxid+A15A26A3:A13A3:A16A3:A17HiMediaGRM1909
AktivkohleHiMediaPCT1001
künstliches Meerwasser MediumHiMediaM1942
Bradford ReagenzienkitHiMediaML106
CeliteHiMediaGRM226
ZentrifugeREMICM-8
ZentrifugenröhrchenHiMediaPW1207
DinitrosalicylsäureHiMediaGRM1582
ErlenmeyerkolbenBorosil4980021
Fuller's EarthHiMediaGRM232
GlucoseHiMedia MB037
HClHiMediaAS004
L-TyrosinHiMediaRM069
Microsoft ExcelMicrosoft
Nanopartikel-AnalysatorHORIBA ScientificNanopartica SZ-100
Nähr-Agar-MediumHiMediaM001
PetriplatteHiMediaPW054
PhosphatpufferHiMediaM1452
NatriumhydroxidHiMediaMB095
SpektralphotometerThermofisherGenesys 10
Rührkessel-BioreaktorScigenicsBioferm LS
TE PufferHiMediaML060
TransmissionselektronenmikroskopJEOLJEM-2100
ZeolithHiMediaGRM3834

Referenzen

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