Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

משלוח תרופות מבוסס משאבה אוסמוטי למחקר רמיאלינציה In Vivo על מערכת העצבים המרכזית

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/63343
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Histology and Embryology, Chongqing Key Laboratory of Neurobiology, Brain, and Intelligence Research Key Laboratory of Chongqing Education Commission, Third Military Medical University, 2Research Centre, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3School of Medicine, Chongqing University

Summary

Demyelination מתרחשת במחלות מרובות של מערכת העצבים המרכזית. טכניקה אמינה של אספקת תרופות vivo נחוצה לבדיקות רמיאלין של תרופות. פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת משאבה אוסמוטית המאפשרת אספקת תרופות לטווח ארוך ישירות לתוך parenchyma המוח ומשפר את הזמינות הביולוגית של התרופה, עם יישום רחב במחקר רמיאלינציה.

Abstract

Demyelination זוהה לא רק טרשת נפוצה (טרשת נפוצה), אלא גם מחלות אחרות של מערכת העצבים המרכזית כגון מחלת אלצהיימר ואוטיזם. כמו ראיות עולה כי remyelination יכול ביעילות לשפר את תסמיני המחלה, יש התמקדות גוברת בפיתוח תרופות כדי לקדם את תהליך התחדשות המיאלין. לכן, טכניקת אספקת תרופות הניתנת לבחירה ותוצאה אמינה באזור נדרשת כדי לבדוק את היעילות והספציפיות של תרופות אלה ב vivo. פרוטוקול זה מציג את שתל המשאבה האוסמוטי כגישה חדשה להעברת תרופות במודל העכבר demyelination המושרה lysolecithin. המשאבה האוסמוטית היא מכשיר מושתל קטן שיכול לעקוף את מחסום הדם - מוח (BBB) ולספק תרופות בהתמדה וישירות לאזורים ספציפיים של מוח העכבר. זה יכול גם לשפר ביעילות את הזמינות הביולוגית של תרופות כגון פפטידים וחלבונים עם זמן מחצית חיים קצר. לכן, שיטה זו היא בעלת ערך רב לתחום של מערכת העצבים המרכזית מיאלין התחדשות המחקר.

Introduction

המשאבה האוסמוטית היא מכשיר קטן ומושתל לשחרור פתרונות. זה יכול לשמש למסירה מערכתית כאשר מושתל תת עורית או בחלל הבטן. פני השטח של המשאבה האוסמוטית הם קרום חדיר למחצה, והצד הפנימי שלה הוא שכבה חדירה. המשאבה האוסמוטית פועלת באמצעות הפרש הלחץ האוסמוטי בין השכבה האוסמוטית לסביבת הרקמה שבה המשאבה מושתלת. האוסמולליות הגבוהה של השכבה האוסמוטית גורמת למים ברקמה לזרום לשכבה האוסמוטית דרך הממברנה החדירה למחצה על משטח המשאבה. השכבה האוסמוטית מרחיבה ודוחסת את המאגר הגמיש בתוך המשאבה, ובכך מוציאה את הפתרון מהמאגר הגמיש בקצב מסוים למשך זמן ארוך1. המשאבה כוללת שלושה נפחי מאגר שונים, 100 μL, 200 μL, ו 2 מ"ל, עם שיעורי המסירה שלהם משתנים מ 0.11 μL / h ל 10 μL / h. בהתאם לסוג המשאבה שנבחר, ההתקן יכול לפעול מיום אחד עד 6 שבועות2. בפרוטוקול זה, משאבה אוסמוטית 100 μL עם קצב העברה של 0.25 μL / h שיכול לפעול במשך 14 ימים משמש.

בשנות ה-70, המשאבה האוסמוטית שימשה במחקר מדעי המוח 3,4. לדוגמה, וויי ואח ' אימץ את גישת המשאבה האוסמוטית להזריק פפטידים אופיואידים לחדר במחקר של התמכרות לסמים3. לאחר שיפור מתמשך, המשאבה האוסמוטית שימשה כעת במחקר של משלוח מבוקר של אלפי תרופות, כולל פפטידים, גורמי גדילה, תרופות ממכרות, הורמונים, סטרואידים, נוגדנים, וכן הלאה. בנוסף, עם צנתרים מיוחדים (ערכות עירוי המוח) מחוברים, זה יכול לשמש עירוי ממוקד לרקמות או איברים ספציפיים, כולל חוט השדרה, המוח, הטחול, הכבד 5,6,7.

במחקר של רמיאלינציה, תרופות רבות הוכחו לקדם התחדשות מיאלין במבחנה, אבל רובם לא השיגו השפעות משמעותיות vivo, אולי בשל היעדר שיטת ניהול מתאימה. שיטות ניהול מסורתיות כגון הזרקה תוך-פריטונית, הזרקה תת עורית, וניהול תוך-גסטרי יש מגבלות הזמינות הביולוגית של התרופות. בנוסף, כמה תרופות יש חדירות מחסום דם - מוח לקוי, אשר מערער את הגישה שלהם parenchyma המוח. יחד, מגבלות אלה דורשות שיטת אספקה יעילה חדשנית. בשילוב עם ערכות עירוי המוח, משאבות אוסמוטיות יכולות לעקוף את מחסום הדם - מוח ולספק תרופות ישירות לקורפוס קאלוזום, אשר משפר ביעילות את הזמינות הביולוגית של תרופות, במיוחד עבור כמה תרופות פוליפפטיד וחלבון עם מחצית חיים קצרה. לכן, המשאבה האוסמוטית כטכניקת אספקת תרופות חדשה היא בעלת ערך רב לתחום של מערכת העצבים המרכזית מיאלין התחדשות המחקר. היישום של טכניקה זו יוצג בפירוט להלן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בבעלי החיים נערכו תחת הנחיות ופרוטוקולים מוסדיים שאושרו על ידי ועדת הרווחה והאתיקה של בעלי החיים של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה.

1. הקמת מודל העכבר demyelination המושרה על ידי ליזולציתין

  1. הכן 1% lysolecithin (נקרא גם L-α-Lysophosphatidylcholine) פתרון עם PBS סטרילי.
  2. לחטא מספריים, מלקחיים, hemostat מעוקל, ומכשירים כירורגיים אחרים על ידי עיקור autoclave. לחטא את האזור הכירורגי ולהניח סדינים סטריליים. כל החומרים והריאגנטים המשמשים לניתוח צריכים להיות מוכנים בצורה אספטית. חשוב לשמור על האזור הכירורגי סטרילי לאורך כל ההליך.
  3. מרדים עכבר C57BL6 של יום לאחר הלידה 56 (P56) (P56) כדלקמן.
    1. מניחים את העכבר בתא האיזופלוריין של מכונת ההרדמה הקטנה לבעלי חיים. התאם את זרימת O2 ל-300-500 מ"ל/דקה ואיזופלוראן ל-3%-4%. לאחר הרדמה מספקת, כאשר העכבר הופך להיות חסר תנועה עם נשימה איטית ויציבה, להעביר את העכבר למנגנון סטריאוטקסי עם כרית חימום.
    2. מעבירים את תפוקת הגז מהתא למסכת ההרדמה ומתאימים איזופלוריין ל-1% עד 1.5% כדי לשמור על העכבר במצב ההרדמה. חכה עד העכבר הוא מרדים לחלוטין, להזריק ketoprofen (3 – 5 מ"ג /ק"ג) תוך-פעילות כדי להקל על הכאב. לפני הניתוח, לצבוט את הבהונות של העכבר ולבדוק את התגובה שלה כדי לאשר הרדמה מוצלחת8.
    3. כאשר העכבר מורדם, הוא אינו יכול לווסת את טמפרטורת הגוף שלו. לכן, לפקח ולווסת את טמפרטורת הגוף של העכבר במהלך הניתוח. כדי לשמור על העיניים של העכבר לחות בזמן הרדמה, לכסות את פני השטח של גלגלי העיניים עם משחת עיניים אריתרומיצין.
  4. אבטחו את ראש העכבר במנגנון הסטריאוטקסי עם מוט שיניים וחטיפי אוזניים. (איור 1א).
  5. השתמש תער כדי להסיר שיער מהחלק העליון של הראש. לחטא את עור הראש עם שלושה מחזורים של בטדין ו 75% אתנול. עבור חששות אתיים, לכסות את גוף החיה למעט אתר הניתוח. בעזרת אזמל, יוצרים חתך ארוך של 1 ס"מ באמצע הסגיטלי של העור מבסיס הצוואר ועד בין העיניים כדי לחשוף את הגולגולת (איור 1B).
  6. נגב בעדינות את פני השטח של הגולגולת עם צמר גפן סטרילי המכיל 30% מי חמצן כדי לדמיין את התפרים הגולגולתיים (איור 1C). התאם את הגובה של מוט השיניים וחטיפי האוזן כדי למקם את נקודת למבדה ואת נקודת bregma באותו גובה (כלומר, עם קואורדינטות ציר z זהה כאשר קצה המחט נוגע בנקודות), כך התפר קשתי הוא אופקי.
  7. הניחו בעדינות את קצה מחט המזרק המיקרוליטר (10 μL, 33 G) בנקודת הברגמה ואיפסו את הקואורדינטות x, y ו- z ל- 0 (איור 1D). העבר את המזרק לאתר ההזרקה (x: 1.04; y: 1.0, כלומר, 1.04 מ"מ לרוחב לקו האמצע ו-1.0 מ"מ אחורי לנקודת הברגמה) בהתאם לבקשת הקריאה הדיגיטלית (איור 1E).
  8. לקדוח לאט חור בר קטן דרך הגולגולת באתר ההזרקה מבלי לחדור את הדורה עם מחט מזרק 1 מ"ל (26 G, 0.45 מ"מ) (איור 1F). הכנס באיטיות את מחט המזרק המיקרוליטר לרקמת המוח דרך החור עד להגעה לעומק מסוים (z = -1.62 מ"מ עבור רוב עכברי P56) (איור 1G).
    הערה: מבחינה אמפירית, עומק ההחדרה של -1.62 מ"מ מאפשר לקצה המחט להגיע לאמצע הקורפוס קאלוסום של רוב עכברי P56, כך שהליזולציתין יכול להיות מועבר ישירות לתוך קורפוס קאלוזום כדי לגרום לדמיאלינציה.
  9. להזריק 1.5 μL של 1% lysolecithin במהירות של 0.3 μL / min. לאחר הזריקה, לחכות 5 דקות לפני לאט לשלוף את מזרק microliter כדי למנוע את דליפת נוזל לאורך נתיב מחט ההזרקה.
  10. תפרו את העור עם 5-0 תפרים כירורגיים (איור 1H).
  11. מניחים את העכבר על כרית חימום כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. תן זריקה תת עורית של 5 מ"ג / קילוגרם carprofen כל 24 שעות כדי להקל על הכאב. החל משחה אריתרומיצין על החתך כל יום כדי להבטיח כי הפצע מרפא כראוי. מניחים את העכבר שעבר ניתוח בכלוב לבד ולהאכיל אותו עם מזון לח עד התאושש לחלוטין. נטר את העכבר מדי יום לאחר הניתוח.

Figure 1
איור 1: הקמת מודל העכבר המושרה על-ידי ליזולציתין. (A) אבטח את העכבר במנגנון הסטריאוטקסי. (B) פתח חתך בגודל 1 ס"מ באמצע קשת כדי לחשוף את הגולגולת. (ג) דמיין את התפרים הגולגולתיים. (D) אפס את הקואורדינטות x, y ו- z ל- 0 בנקודת Bregma. (ה) העבר את המזרק לאתר ההזרקה. (ו) לקדוח חור בגולגולת באתר ההזרקה. (ז) הכנס את המחט לרקמת המוח לאט והזריק ליזולציתין. (ח) תפר את העור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. הכנת המשאבה האוסמוטית

הערה: רכיבי המפתח של המשאבה מוצגים באיור 2A.

  1. לקבוע את עומק החדרת צינורית עירוי המוח לתוך המוח. ודא כי המחט של צינורית עירוי המוח בשימוש הוא 3 מ"מ ארוך וכל מרווח התאמת עומק הוא 0.5 מ"מ. כדי להשיג עומק הזרקה של 1.5 מ"מ (קרוב לקאלוזום), חברו שלושה מרווחי כוונון עומק למחט של צינורית עירוי המוח עם דבק רקמות (איור 2B, C).
  2. כדי למלא את המשאבה האוסמוטית, חבר את מחט המזרק שמגיעה עם חבילת המשאבה למזרק של 1 מ"ל ושאף את התרופה. החזק את המשאבה זקופה, הכנס את המזרק לפתח בחלק העליון של המשאבה, והזריק לאט את התרופה, נזהר שלא ליצור בועות9 (ראה איור 2D). כאשר הנוזל זורם מתוך הפתח, לשלוף לאט את המזרק.
  3. הסר את האוגן הלבן מווסת הזרימה עם מספריים או צבת להיזהר לא לכופף או למחוץ את מנחה הזרימה. לאחר מכן, הכנס את מנחה הזרימה למשאבה (איור 2E). כדי לקבוע אם יש בועות במשאבה האוסמוטית, לשקול את המשאבה האוסמוטית בנפרד לפני ואחרי המילוי.
  4. חותכים את הצנתר לאורך מסוים בהתאם לגודל החיה (20-25 מ"מ קטטרים לעכברי P56 השוקלים כ -25 גרם). חבר את הצנתר לשלולית עירוי המוח.
  5. מלאו את הצנתר בסמים באמצעות המזרק מבלי להכניס אוויר (איור 2F).
  6. חבר את הצנתר למנחה הזרימה. לאחר ההחזקה, ודאו שהצנתר מכסה כ-4 מ"מ של מנחה הזרימה החשוף (איור 2G).
  7. כדי להבטיח שהמשאבה האוסמוטית תוכל לפעול באופן מיידי לאחר ההשתלה, טבול את המשאבות הממולאות בתמיסת מלח סטרילית של 0.9% או PBS בטמפרטורה של 37 °C (לפחות 4 עד 6 שעות (רצוי להאריך עד הלילה) כדי להרטיב מראש את הממברנה החדירה למחצה על פני המשאבה עם פתרונות בעלי לחץ אוסמוטי זהה לסביבת הרקמה (איור 2H).
  8. כל הפתרונות שנטענו למשאבות צריכים להיות סטריליים. משאבות ALZET מסופקות סטריליות, לאחר שנחשפו למינון עיקור של 60Co. עם זאת, אם מתרחש זיהום חיצוני, ניתן לנקות את פני השטח של המשאבה על ידי ניגובו עם אלכוהול איזופרופיל (70% במים).

Figure 2
איור 2: הכנת המשאבה האוסמוטית. (א) רכיבי מפתח במשאבה האוסמוטית. (ב,ג) חבר מרווחי כוונון עומק למחט של צינורית עירוי המוח. (D) מלא את המשאבה האוסמוטית באמצעות מזרק 1 מ"ל. (ה) הכנס את מנחה הזרימה למשאבה. (ו) מלאו את הצנתר באמצעות המזרק. (ז) חבר את הצנתר למנחה הזרימה. (H) לטבול את המשאבות הממולאות סטרילי 0.9% מלוחים או PBS ב 37 °C (50 °F) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. השתלת המשאבה האוסמוטית

  1. המתן 3 ימים לאחר הקמת מודל corpus callosum demyelination. הפעל את מערכת ההרדמה הקטנה לבעלי חיים. לחטא מספריים, פינצטה, צבת hemostatic ולשרות אותם בתמיסת אלכוהול 75%. הנח סדינים סטריליים באזור הניתוח.
  2. להרדים ולאבטח את העכברים על המנגנון הסטריאוטקסי שוב. לכסות את פני השטח של גלגלי העיניים עם משחת עיניים כדי למנוע יובש.
  3. לחטא את הפצע המקורי עם 75% אלכוהול. פתחו את החתך הכירורגי שנתפר בעבר (איור 3A) והרחיבו את החתך לשכמות (איור 3B).
  4. הפרד את העור מרקמת החיבור התת עורית באמצעות צבת המוסטטית או פינצטה בעצם השכם כדי לפתוח חלל (איור 3C). הכניסו את המשאבה האוסמוטית לחלל (איור 3D,E).
  5. עם צמר גפן, לנגב בעדינות ולחשוף את חור הסיכה על פני השטח של הגולגולת שנוצר בעת הקמת מודל demyelination (ראה שלב 1.8). הכנס את צינורית עירוי המוח דרך חור הסיכה הזה בניצב ואבטח אותה על הגולגולת במהירות באמצעות דבק רקמות (איור 3F).
  6. הסירו את הכרטיסייה הנשלפת מעל צינורית עירוי המוח עם זוג מספריים (איור 3G, H). לחלופין, הסר את הכרטיסיה תחילה לפני הוספת הצינורית כדי למנוע רעד בתהליך זה.
  7. תפרו את החתך או חברו אותו לדבק ברקמות (איור 3I).
  8. לאחר הניתוח, מניחים את העכבר על כרית חימום כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף. תן זריקה תת עורית של 5 מ"ג / קילוגרם carprofen כל 24 שעות כדי להקל על הכאב. החל משחה אריתרומיצין על החתך כל יום כדי להבטיח כי הפצע מרפא כראוי. מניחים את החיה בכלוב לבד ולהאכיל עם מזון לח עד התאושש לחלוטין. נטר את העכברים כל יום ובדוק אם צינורית עירוי המוח הייתה מחוברת היטב.
  9. המתת חסד העכבר 11 ימים לאחר הניתוח על ידי הזרקת 150-200 מ"ג / קילוגרם נתרן פנטוברביטל תוך-אפריטוני באופן תוך-אפריטוני ואחריו זלוף transfusing transcardially עם 4% פורמלדהיד.
  10. כדי לוודא שהפתרון מועבר כרגיל, הסר בזהירות את המשאבה האוסמוטית ומדוד את שאריות הנפח במאגר המשאבה לפני ניתוח המוח.
    1. כדי למדוד את נפח השיורי, להסיר את צינורית עירוי המוח, לצרף מזרק 1 מ"ל לצנתר, ולאחר מכן לשאוף את הפתרון הנותר כדי לקבוע את נפחו. השווה את הנפח השיורי בפועל לנפח השיורי התיאורטי (נפח ראשוני - ממוצע קצב שאיבה * משך עירוי).
      הערה: נפח שיורית מופרז מציין עירוי לא מוצלח, אשר עשוי להיות עקב חסימת קטטר או תקלה במשאבה.

Figure 3
איור 3: השתלת המשאבה האוסמוטית. (א) פתח את החתך הכירורגי. (ב) להרחיב את החתך לשכמות הכתפיים. (ג) הפרד את העור מרקמת חיבור תת עורית כדי ליצור חלל. (ד, ה) מניחים את המשאבה האוסמוטית לתוך החלל. (F) הכנס את צינורית עירוי המוח לחור הסיכה על פני השטח של הגולגולת ואבטח אותה בחוזקה על הגולגולת. (ז, ח) הסר את הכרטיסיה הנשלפת מהצינורית. (I) לתפור את החתך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי לאמת את ההשפעה של המשאבה האוסמוטית במחקר התחדשות המיאלין, מודל demyelination המושרה lysolecithin נוצר בעכברים P56, ואחריו השתלה של משאבות אוסמוטיות המכילות UM206 (1 מ"ג ב 1.5 מ"ל 0.9% מלוחים), פפטיד עם מחצית חיים קצרה וחדירות BBB עניים שדווח לאחרונה כדי לקדם רמיאלינציה10 . 0.9% תמיסת מלח שימשה כבקרה. 14 ימים לאחר הקמת המודל, עכברים היו transcardially עם 4% פורמלדהיד כדי לבודד את המוח עבור חתך, ואחריו במקום הכלאה מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי להעריך את רמת remyelination.

הכתמת DAPI חשפה את חור הסיכה ברקמת המוח ממש מעל החומר הלבן, מה שמצביע על השתלה מוצלחת של צינורית עירוי המוח של המשאבה האוסמוטית (איור 4A). בניסוי ההכלאה in-situ, סמן oligodendrocyte בוגר בדיקה MAG שימש לתיוג אוליגודנדרוציטים מובחנים חדש כפי שמוצג במחקרים קודמים 10,11,12. התוצאות הראו כי הטיפול UM206 הניב יותר תאים MAG חיוביים באזור demyelinated מאשר קבוצת הביקורת (איור 4B). מיקרוסקופ אלקטרוני שידור של האזור demyelinated גם הראה כי מספר האקסונים myelinated גדל בקבוצת הטיפול UM206 בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4C), מה שמרמז כי UM206 גרם לרמה גבוהה יותר של רמיאלינציה. תוצאות אלה מראות כי המשאבה האוסמוטית יכולה לספק ביעילות תרופות לקורפוס קאלוסום במחקר הרמיאלינציה.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות. (א) תמונה מייצגת של פרוסה מוכתמת ב-DAPI המציגה את חור הסיכה ברקמת המוח. סרגל קנה מידה: 1,000 מיקרומטר. (B) תמונות מייצגות המציגות בהכלאה במקום של MAG באזור demyelinated כפי שמוצג על ידי כתמי DAPI. טיפול UM206 הגדיל את מספר האוליגודנדרוציטים המסומנים ב- MAG. סרגל קנה מידה: 100 מיקרוסקופיה אלקטרונים שידור מייצג של האזור demyelinated. (ג) תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים שידור מייצג של האזור demyelinated. טיפול UM206 הגדיל את מספר האקסונים שעברו מיאלין. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את המשאבה האוסמוטית כטכניקת אספקת תרופות חדשנית למחקר התחדשות מיאלין, אשר יכול לספק תרופות ישירות לאתר הטיפול ולאפשר אספקת תרופות עקבית לתקופה ממושכת, יצירת ריכוז תרופות יציב בסביבה מיקרו של מערכת העצבים המרכזית בכל משך הניסוי. בהשוואה לשיטות אחרות להעברת תרופות, המשאבה האוסמוטית תורמת יותר לשמירה על ריכוז הסמים בנגע demyelination13. לדוגמה, עבור גורמים נוירוטרופיים מסוימים, תרופות מערכתיות לא יכול להשיג שום השפעה בגלל הריכוז הנמוך של התרופה באתר הנגע. אבל אם המינון הוא גדל, תופעות הלוואי יהיה משמעותי יותר14. במקרים כאלה, ניהול לאתר מסוים באמצעות משאבה אוסמוטית יכול להפחית את תופעות הלוואי ההיקפיות ביעילות15. בנוסף, תרופות רבות הקשורות התחדשות מיאלין יש מחסום דם - מוח לקוי (BBB) חדירות או להציג קצר במחצית החיים vivo עקב רגישות השפלה פרוטאוליטית. בעיות אלה יכולות להיות מטופלות היטב על ידי משאבות אוסמוטיות.

עם זאת, שיטת המשאבה האוסמוטית אינה נטולת אזהרות ומגבלות. ראשית, בהיותה מערכת פולשנית להעברת תרופות, היא גורמת באופן בלתי נמנע לנזק לרקמת המוח ולתדלוק עצבי באתר החדרת צינורית עירוי המוח, מה שעלול לטשטש את השפעת התרופות. לפיכך, יש להגדיר קבוצת בקרה מתאימה של ממס בלבד. שנית, תרופות מסוימות דורשות ממסים כמו דימתיל סולפוקסיד (DMSO), N-מתיל-2-פירולידון (NMP) להתמוסס, אבל ממסים אלה אינם עולים בקנה אחד עם חומר המאגר והוא יכול לגרום לכישלון משמעותי של המשאבות. לדוגמה, ריכוזים גבוהים של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו PEG400 הוכחו כמשפיעים לרעה על שחרור המשאבה וייתכן שאינם מתאימים לשימוש במשאבות אוסמוטיות 16,17,18. שלישית, תרופות שאינן יציבות בטמפרטורה של 37 °C (50 °F) עשויות שלא להתאים לעירוי לטווח ארוך באמצעות המשאבה האוסמוטית. כל הנושאים האלה ראויים לתשומת לב אם מתכננים ליישם את המשאבה האוסמוטית.

מספר שלבים בפרוטוקול זה דורשים תשומת לב נוספת במהלך הניסויים. עבור הפעולה הרגילה של משאבות osmotic, החוקרים חייבים להבטיח כי המשאבה האוסמוטית מורכב כראוי וכי אין בועה מוכנס לתוך המשאבה, אשר אחרת לערער מאוד את יעילות העירוי. בנוסף, חסימת קטטר או תקלה במשאבה אוסמוטית עלולה לגרום לכשל עירוי19, אשר יכול להיקבע על ידי מדידת נפח השיורי במאגר המשאבה לאחר הניסוי. ליישום המשאבה האוסמוטית בעכברים צעירים יותר עם גדלי מוח קטנים יותר, מומלץ ניסוי כדי להבטיח עומק מתאים של החדרה. יתר על כן, צינורית עירוי המוח חייב להיות מאובטח היטב על הגולגולת כדי למזער את התנועה שלה במהלך עירוי.

נכון לעכשיו, מחקרים רבים במבחנה מצאו מגוון רחב של תרופות שיכולות לקדם התחדשות מיאלין, אבל בשל חדירות BBB עניים, זמן מחצית חיים קצר, ובעיות אחרות, תרופות אלה קשה להיות מאומת בהצלחה vivo. לכן, המשאבה האוסמוטית היא בעלת ערך רב לתחום של מערכת העצבים המרכזית מיאלין התחדשות המחקר, רלוונטי במיוחד עבור תרופות אלה עם זמן מחצית חיים קצר, חדירות BBB עניים, ותופעות לוואי היקפיות ברורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 32070964, 31871045) ל- J.N. ולקרן המחקר הבסיסית של שנזן (JCYJ20210324121214039) ל- Y.S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthesia Air Pump RWD R510-29 E05818-006
Brain Infusion kit 3 ALZET 0008851 1-3 mm
Carprofen Macklin C830557-1g 5 mg/kg every 24 h
Erythromycin eye ointment Along technology YCKJ-RJ-024780 Cover the surface of the eyeballs during anesthesia
Erythromycin ointment pythonbio RG180
Gas Evacuation Apparatus RWD R546W E05518-002
L-α-Lysophosphatidylcholine Sigma L0906 Dissolve at 1% with sterile PBS
Microliter Syringe Hamilton 65460-05 Syringe Series:1700, 10 µL, 33 gauge
Micro-smotic pump model 1002 ALZET 0004317 0.25 µL per hour, 14 days
PBS (pH = 7.3) ORIGENE ZLI-9061
Pentobarbital sodium Shanghai Civi CAS NO: 57-33-0 150-200 mg/kg intraperitoneal injection for euthanasia
Small Animal Anesthesia Machine RWD R520IE E05807-006 M
Stereotaxic Equipment RWD E06382
STERI 250 sterilizer Keller 31101 Rapid sterilization of surgical instruments
Surgical sutures Shanghai jinhuan F504 5-0
Syringe needle (1 mL) Shanghai KDL 6930197811018 26 gauge (0.45 mm x 16 mm)
Testing drug and solvent Experiment dependent N/A
ThermoStar Homeothermic Monitoring System RWD 69026 Maintain body temperature during anesthesia
Vetbond Tissue adhesive 3M 1469SB Secure the brain infusion cannula , Adhere the skin incision

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Theeuwes, F., Yum, S. I. Principles of the design and operation of generic osmotic pumps for the delivery of semisolid or liquid drug formulations. Annals of Biomedical Engineering. 4 (4), 343-353 (1976).
  2. Herrlich, S., Spieth, S., Messner, S., Zengerle, R. Osmotic micropumps for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (14), 1617-1627 (2012).
  3. Wei, E., Loh, H. Physical dependence of opiate-like peptides. Science. 193 (4259), 1262-1263 (1976).
  4. Pettigrew, J. D., Kasamatsu, T. Local perfusion of noradrenaline maintains visual cortical plasticity. Nature. 271 (5647), 761-763 (1978).
  5. Wang, Y., et al. Reduced oligodendrocyte precursor cell impairs astrocytic development in early life stress. Advanced Science (Weinheim). 8 (16), 2101181 (2021).
  6. Tang, C., et al. Neural stem cells behave as a functional niche for the maturation of newborn neurons through the secretion of PTN. Neuron. 101 (1), 32-44 (2019).
  7. Watanabe, S., Komine, O., Endo, F., Wakasugi, K., Yamanaka, K. Intracerebroventricular administration of Cystatin C ameliorates disease in SOD1-linked amyotrophic lateral sclerosis mice. Journal of Neurochemistry. 145 (1), 80-89 (2018).
  8. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50326 (2013).
  9. Tang, C., Guo, W. Implantation of a mini-osmotic pump plus stereotactical injection of retrovirus to study newborn neuron development in adult mouse hippocampus. STAR Protocols. 2 (1), 100374 (2021).
  10. Niu, J., et al. Oligodendroglial ring finger protein Rnf43 is an essential injury-specific regulator of oligodendrocyte maturation. Neuron. 109 (19), 3104-3118 (2021).
  11. Breitschopf, H., Suchanek, G., Gould, R. M., Colman, D. R., Lassmann, H. In situ hybridization with digoxigenin-labeled probes: sensitive and reliable detection method applied to myelinating rat brain. Acta Neuropathologica. 84 (6), 581-587 (1992).
  12. Cree, B. A. C., et al. Clemastine rescues myelination defects and promotes functional recovery in hypoxic brain injury. Brain. 141 (1), 85-98 (2018).
  13. Eckenhoff, B., Yum, S. I. The osmotic pump: novel research tool for optimizing drug regimens. Biomaterials. 2 (2), 89-97 (1981).
  14. Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature Neuroscience. 5, 1046-1050 (2002).
  15. Hagg, T. Intracerebral infusion of neurotrophic factors. Methods in Molecular Biology. 399, 167-180 (2007).
  16. Bittner, B., Thelly, T., Isel, H., Mountfield, R. J. The impact of co-solvents and the composition of experimental formulations on the pump rate of the ALZET osmotic pump. International Journal of Pharmaceutics. 205 (1-2), 195-198 (2000).
  17. Arnot, M. I., Bateson, A. N., Martin, I. L. Dimethyl sulfoxide/propylene glycol is a suitable solvent for the delivery of diazepam from osmotic minipumps. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36 (1), 29-31 (1996).
  18. Gullapalli, R., et al. Development of ALZET osmotic pump compatible solvent compositions to solubilize poorly soluble compounds for preclinical studies. Drug Delivery. 19 (5), 239-246 (2012).
  19. White, J. D., Schwartz, M. W. Using osmotic minipumps for intracranial delivery of amino acids and peptides. Methods in Neurosciences. 21, 187-200 (1994).

Tags

מדעי המוח גיליון 178
משלוח תרופות מבוסס משאבה אוסמוטי למחקר <em>רמיאלינציה In Vivo</em> על מערכת העצבים המרכזית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, X., Su, Y., Hu, X., Niu, J.… More

Wang, X., Su, Y., Hu, X., Niu, J. Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (178), e63343, doi:10.3791/63343 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter