Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Fettgewebes von Ratten zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen

Mesenchymale Stammzellen (MSCs), auch mesenchymale Stromazellen genannt, gehören zu den am häufigsten verwendeten Zelltypen für die regenerative Medizin ^1,2. Sie werden als adulte Stammzellen klassifiziert und zeichnen sich durch Multilineage-Differenzierungspotenzial und Selbsterneuerungskapazität^{aus 3}. MSCs können isoliert und aus verschiedenen Quellen gewonnen werden, einschließlich Fettgewebe, Knochenmark, peripherem Blut, Nabelschnurgewebe und Blut, Haarfollikeln und Zähnen ^4,5.

Die Isolierung von Stammzellen aus Fettgewebe wird aufgrund ihres einfachen Zugangs, ihrer schnellen Expansion in vitro und ihrer hohen Ausbeute als attraktiv und vielversprechend angesehen⁶. Aus Fettgewebe gewonnene mesenchymale Stammzellen (Ad-MSCs) können aus verschiedenen Arten wie Menschen, Rindern, Mäusen, Ratten und in jüngster Zeit auch aus Ziegen^{isoliert werden 7}. Es wurde nachgewiesen, dass Ad-MSCs jetzt potenzielle Kandidaten für Tissue Engineering und Gen-/Zelltherapie sind, die sogar verwendet werden können, um eine autologe Alternative für die langfristige Reparatur von Weichteilverletzungen oder -defekten zu entwickeln ^7,8.

Die International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) hat drei Mindestkriterien definiert, die von MSCs für eine vollständige Charakterisierung nachgewiesen werden müssen⁹. Erstens müssen sie plastikhaltig sein. Zweitens sollten MSCs mesenchymale Stammzelloberflächenmarker wie CD73, CD90 und CD105 exprimieren und die hämatopoetischen Marker CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79α oder CD19 und HLA-DR nicht exprimieren. Schließlich sollten MSCs die Fähigkeit aufweisen, sich in die drei mesenchymalen Linien zu differenzieren: Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten. Interessanterweise können MSCs auch in andere Linien wie neuronale Zellen, Kardiomyozyten, Hepatozyten und Epithelzellen^{differenzieren 10,11}.

Tatsächlich besitzen MSCs einzigartige Eigenschaften, die es ermöglichen, sie als potenzielle Therapeutika in der regenerativen Therapie für verschiedene Krankheiten einzusetzen. MSCs können lösliche Faktoren absondern, um eine immunmodulatorische Umgebung zu induzieren, die therapeutische Vorteile bietet¹². Darüber hinaus können MSCs zu Verletzungsstellen und Tumormikroumgebungen migrieren, um eine zielgerichtete Therapie durchzuführen. Die Mechanismen sind jedoch nicht vollständig aufgeklärt¹³. Darüber hinaus haben MSCs die Fähigkeit, Exosomen abzusondern, extrazelluläre Vesikel im Nanobereich, die eine Ladung nicht-kodierender RNAs, Proteine und löslicher Faktoren tragen, die sich in letzter Zeit als neuartiger Mechanismus des therapeutischen Potenzials der MSCs bei verschiedenen Krankheiten herausgestellt^{haben 14}.

Noch wichtiger ist, dass MSCs deutliche Aufmerksamkeit für ihr Potenzial zur Differenzierung in insulinproduzierende Zellen (IPCs) erzeugt haben, entweder durch genetische Veränderung ^15,16 oder durch die Verwendung verschiedener extrinsisch induzierender Faktoren innerhalb der Kulturmedien in vitro¹⁷. Die IPC-Induktionsperiode variiert stark, da sie vom verwendeten Induktionsprotokoll und den verwendeten extrinsischen Faktoren abhängt. Der Prozess der Differenzierung kann von Tagen bis zu Monaten dauern und erfordert eine Kombination von exogen induzierenden Faktoren, die in verschiedenen Stadien hinzugefügt und / oder zurückgezogen werden müssen. Viele dieser Faktoren, die für die endokrine Pankreasdifferenzierung verwendet wurden, sind biologisch aktive Verbindungen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Proliferation oder Differenzierung / Neogenese von insulinsezernierenden ^β-Zellen fördern und / oder den Insulingehalt von IPCs 18,19,20,21 erhöhen. Es ist hier bemerkenswert, dass MSCs auch therapeutische Wirkungen bei Diabetes und seinen Komplikationen über mehrere Mechanismen, einschließlich ihres Sekrets, sowie eine breite Palette von immunmodulatorischen Wirkungen haben^22,23,24.

In diesem Protokoll stellen wir ein detailliertes Stufenprotokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs aus Eileiterfett von Ratten vor, gefolgt von einem einfachen, relativ kurzen Protokoll zur Generierung von IPCs aus Ad-MSCs.

Alle Experimente wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt, und alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Fakultät für Pharmazie der British University in Egypt (BUE), Kairo, Ägypten, genehmigt. Das Ad-MSC-Isolationsprotokoll wurde von Lopez und Spencer übernommen, mit Modifikationen¹⁵.

1. Isolierung von Ad-MSCs aus epididymalen Fettpölstigen von Ratten

1. Verwenden Sie männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 250-300 g, die nicht älter als 1 Monat sind (zwei pro Isolation). Betäuben Sie die Tiere und euthanasieren Sie sie dann durch Zervixdislokation. Besprühen Sie das eingeschläferte Tier mit 70% Ethanol. Schneiden Sie die Haut und den Muskel am unteren Teil des Bauches aus und ziehen Sie dann die beiden Hoden heraus, um die Nebenhodenfettpolster freizulegen.
2. Schneiden Sie vorsichtig die Nebenhoden-Fettpolster ab und achten Sie darauf, die Blutgefäße nicht zu schneiden.
3. Isolieren Sie das Fettgewebe, das den Nebenhoden umgibt, und geben Sie es dann in eine Petrischale, die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) enthält.
4. Schneiden Sie diese Fettpolster in der Biosicherheitskabine mit Pinzette und Skalpell in kleine Stücke. Übertragen Sie diese geschnittenen Fettgewebestücke in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10 ml steriles PBS enthält.
5. Waschen Sie das gehackte Fettgewebe 5 Mal mit 10 ml PBS jedes Mal, um das kontaminierende Blut zu entfernen. Die folgenden Waschvorgänge müssen sorgfältig durchgeführt werden.
   1. Fügen Sie 10 ml PBS zum Gewebe hinzu und mischen Sie gründlich für 45 s. Lassen Sie dann das Gewebe durch die Schwerkraft absetzen, indem Sie das Rohr 5 Minuten lang stehen lassen, um es in zwei Schichten zu trennen.
   2. Saugen Sie das PBS mit einer 10-ml-Spritze aus dem Infranatant ab und ersetzen Sie es durch frische 10 ml PBS für eine weitere Wäsche.
   3. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 4-5 Mal, bis das PBS blutfrei ist. Dies deutet darauf hin, dass der meiste, wenn nicht sogar das gesamte Blut entfernt wird.
6. Nach dem Waschen das Fettgewebe in 10 ml Kollagenaselösung (0,1% Kollagenase Typ 1 in PBS) resuspendieren. Verschließen Sie das Rohr fest mit Parafilm und inkubieren Sie es dann in einem schüttelnden Wasserbad (37 ° C, 80 U / min, für 45 min), bis das Gewebe fast homogen ist.
   HINWEIS: Vermeiden Sie die vollständige Verdauung des Gewebes (wenn die Lösung vollständig homogen wird und alle Gewebereste / -stücke vollständig verschwinden), da dies die anschließende Kultivierung der Zellen beeinträchtigt. Normalerweise dauert die Verdauung 30-45 min.
7. Sobald die Kollagenase-Verdauung abgeschlossen ist, wirbeln Sie das Röhrchen für 15 s und zentrifugieren Sie dann für 5 Minuten bei 300 x g. Wirbeln Sie das Rohr erneut für 10 s, gefolgt von einer weiteren 5-minütigen Zentrifugation. Es werden dann drei Schichten beobachtet. Entsorgen Sie vorsichtig die Ölschicht, gefolgt von der wässrigen Schicht, ohne das Pellet der stromalen Gefäßfraktion (SVF) zu stören.
   HINWEIS: Entfernen Sie den Überstand, der Adipozyten enthält, und die Kollagenaselösung. Entfernen Sie zuerst die Adipozyten und die begleitende Ölschicht mit einer 10 ml Pipette, um eine vollständige Entfernung der Öltröpfchen zu gewährleisten, und entfernen Sie dann die darunter liegende wässrige Schicht.
8. Resuspendiert das SVF-Pellet am Boden des Röhrchens in 10 ml steriler BSA-Lösung (1% Albumin, Rinderserum Fraction V-Lösung in PBS) und zentrifugiert dann das Röhrchen für 5 min bei 300 x g.
9. Nach der Zentrifugation entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das SVF-Pellet in 8,5 ml kompletten Medien für Ad-MSCs (bestehend aus Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin).
10. Kultivieren Sie die Zellen in einem 25 cm 2 Kolben bei 37 °C unter 5% CO² . Überprüfen Sie am folgenden Tag die angehängten Zellen, entfernen Sie die suspendierten Zellen und ersetzen Sie die Medien. Danach wechseln Sie alle zwei Tage die Medien.
11. Passieren Sie die Zellen alle 5-7 Tage, wenn sie zu 80% -90% konfluent sind, mit Trypsin-EDTA. Verwenden Sie Zellen zwischen den Passagen 3-5 für die nachfolgenden Experimente, die in diesem Protokoll beschrieben werden. Eine schematische Darstellung aller Isolationsschritte ist in Abbildung 1 dargestellt.
    HINWEIS: Normalerweise kann die Trypisn-EDTA-Potenz zwischen verschiedenen Lieferanten variieren, also versuchen Sie, die Zeit der Trypsinisierung zu minimieren, um toxische Wirkungen auf die Zellen zu vermeiden.

2. Charakterisierung von Ad-MSCs durch Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie-Analysen

1. Teilen Sie in Passage 3 die Zellen mit Trypsin-EDTA auf. Mit PBS 2 mal waschen und dann die Zellen mit einem Hämozytometer zählen.
2. Inkubieren Sie 100.000 Zellen bei 4 °C im Dunkeln für 20 Minuten mit entweder Maus-Anti-Ratten-CD90 oder CD105 (mesenchymale Marker) oder CD34 (hämatopoetischer Marker) monoklonaler Antikörper, markiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC).
3. Waschen Sie die Zellen und suspendieren Sie sie in 500 μL FACS-Puffer. Analysieren Sie durch Durchflusszytometrie²⁵.

3. Bewertung des Differenzierungspotenzials isolierter Ad-MSCs in verschiedene mesenchymale Linien

1. Adipogene Differenzierung
   1. Resuspendieren Sie die Zellen in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben), dann kultivieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 3,7 x 10 4 Zellen / Well in einer 24-Well-Gewebekulturplatte^. Inkubieren bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂. Als nächstes wechseln Sie das Medium alle 3 Tage, bis die Zellen fast 100% Konfluenz erreichen, was normalerweise 3 Tage dauert.
   2. Wenn die Zellen die gewünschte Konfluenz erreicht haben, ersetzen Sie die Proliferationsmedien durch die adipogenen Differenzierungsmedien (bestehend aus LG-DMEM-Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin mit 1x adipogener Ergänzung, geliefert mit dem Mesenchymal Stem Cells Functional Identification Kit), um die Adipogenese zu induzieren. Wechseln Sie dann alle 3 Tage das Medium (0,5 ml/gut). Achten Sie darauf, den Medienaustausch vorsichtig durchzuführen, um die Lipidvakuolen nicht zu stören.
   3. Nach 21 Tagen beurteilen Sie die adipogene Differenzierung durch mikroskopische Untersuchung des Aussehens der Lipidvakuolen und durch Ölrotfärbung.
   4. Bereiten Sie eine Stammlösung von Oil Red vor, indem Sie 30 mg Oil Red-Fleck in 10 ml Isopropanol auflösen und dann mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren. Bereiten Sie anschließend eine Arbeitslösung vor, indem Sie 3 Teile Stammlösung mit 2 Teilen doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) mischen, gut mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren, dann anschließend mit Filterpapier filtern.
   5. Um die adipogene Differenzierung zu dokumentieren, waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit neutralgepuffertem Formalin 10% (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS mit 1 ml / Well und inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 Minuten. Es ist wichtig, das PBS vollständig zu aspirieren, bevor Sie die Oil Red-Arbeitslösung hinzufügen.
   6. Nach der letzten Wäsche die Oil Red Arbeitslösung zu den Zellen geben und sie für 60 min bei 37 °C inkubieren. Entfernen Sie anschließend die Fleckenlösung und waschen Sie die Zellen vorsichtig 2 Mal mit PBS. Beobachten Sie die gefärbten Lipidtröpfchen unter dem Mikroskop.
2. Osteogene Differenzierung
   1. Samen Sie 7,4 x 10 3 Zellen/Well (0,5 mL medium/Well) in einer 24-Well-Platte aus und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für³ Tage, um eine Konfluenz von fast 70_% zu erreichen.
   2. Induzieren Sie die Zellen mit dem osteogenen Supplement (im Lieferumfang des Kits enthalten) in LG-DMEM-Medien, ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin.
   3. Setzen Sie die osteogene Induktion für 21 Tage fort und wechseln Sie alle 3 Tage das Differenzierungsmedium.
   4. Bereiten Sie eine Arbeitslösung von Alizarin Red S-Fleck vor, indem Sie 200 mg Alizarin Red S-Fleck in 9 ml ddH₂O auflösen und dann den pH-Wert mit Ammoniumhydroxid und HCl auf 4,1-4,3 einstellen. Als nächstes erhöhen Sie die Lautstärke auf 10 ml von ddH₂O. Entfernen Sie anschließend alle Ausscheidungen durch Filtration mit Filterpapier.
   5. Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit 10% gepuffertem Formalin (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS (1 ml / Well). Inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 min.
   6. Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit der vorbereiteten 2%igen Alizarin-Red S-Lösung für 30 min in einem 37 °C Inkubator.
   7. Danach entfernen Sie die Fleckenlösung, waschen Sie die Zellen 2 Mal mit ddH₂O und einmal mit PBS und beobachten Sie dann die gefärbte kalziumreiche extrazelluläre Matrix, um die osteogene Differenzierung unter dem Mikroskop zu beurteilen.
3. Chondrogene Differenzierung
   1. Samen Sie 7,4 x 10 3 Zellen/Well (0,5 mL medium/Well) in einer 24-Well-Platte aus und inkubieren Sie diese bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5_{% CO 2} in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für³ Tage, um eine Konfluenz von fast 70% zu erreichen.
   2. Wenn die gewünschte Konfluenz erreicht ist, induzieren Sie die chongene Differenzierung der Zellen mit serumfreiem DMEM / F12, das Insulin-Transferrin-Selen (ITS), chondrogenes Supplement (im Lieferumfang des Kits enthalten), 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 0,25 μg / ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin²¹.
   3. Inkubieren Sie die Zellen mit den chondrogenen Medien für 21 Tage, während Sie die chondrogenen Differenzierungsmedien alle 3 Tage wechseln.
   4. Bereiten Sie eine Arbeitslösung aus Alcian Blue 8GX-Färbung wie folgt vor: Zunächst wird eine 3%ige Eisessigsäurelösung in ddH2O hergestellt, indem 3 ml Eisessigsäure zu 97 ml ddH₂O zugegeben werden. Bereiten Sie dann eine Arbeitslösung aus Alcian Blue 8GX-Fleck vor, indem Sie 0,1 g in 100 ml 3% ige Gletschersäurelösung mischen und alle Ausscheidungen durch Filtration mit Filterpapier entfernen.
   5. Waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS und fixieren Sie sie dann mit 10% gepuffertem Formalin (0,75 ml / Well) für 15 min. Danach waschen Sie die Zellen 2 Mal mit PBS (1 ml / Well). Inkubieren Sie die Zellen jedes Mal für 5 min.
   6. Der nächste Schritt besteht darin, die Zellen in der vorbereiteten 0,1% Alcian Blue 8GX-Färbung in 3% Eisessigsäure für 60 min bei 37 °C zu inkubieren. Waschen Sie die gefärbten Zellen 2 Mal mit ddH₂O und einmal mit PBS und beobachten Sie dann die gefärbten sulfatierten Proteoglykane unter dem Mikroskop.

4. Differenzierung von Ad-MSCs in IPCs

1. Teilen Sie in Passage 3 die Ad-MSCs mit Trypsin-EDTA auf. Entfernen Sie zuerst die Medien und waschen Sie dann die Zellen, während sie noch im Kulturkolben mit 5 ml PBS befestigt sind. Als nächstes 5 ml Trypsin-EDTA in den 75 cm² Kolben geben und bei 37 °C für 3-10 min inkubieren.
   HINWEIS: Versuchen Sie, die Zellen in frühen Passagen zu induzieren, normalerweise zwischen P3-P5, da späte Passagen die Eigenschaften und Differenzierungsfähigkeiten der Zellen beeinträchtigen^17,24.
2. Anschließend untersuchen Sie die Zellen auf Ablösung und darauf, dass es sich um eine Einzelzellsuspension handelt. Fügen Sie dem Kolben 5 ml vollständiges DMEM/F12-Medium hinzu, um die Trypsin-Wirkung zu verhindern. Sammeln Sie die Zellsuspension und übertragen Sie sie in eine 15-ml-Röhre und fügen Sie dann weitere 5 ml vollständiges DMEM/F12-Medium in die Röhre ein.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 2 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
4. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, zentrifieren Sie erneut bei 300 x g für 2 min und suspendieren Sie dann das Zellpellet in 3-5 ml kompletten DMEM / F12-Medien.
5. Zählen Sie die Zellen mit trypanblauem Ausschlussfarbstoff und einem Hämozytometer.
6. Dann säen Sie die Zellen in 6-Well-Platten (1 x 10 6 Zellen/Platte) und einer 12-Well-Platte (für GSIS-Assay; 1 x 10⁶ Zellen/Platte) und inkubieren Sie in einem 37 °C, 5% CO_2-Inkubator in vollständigen Medien (wie in Schritt 1.9 beschrieben) für 3 Tage, um fast 90% Konfluenz zu erreichen.
7. Entfernen Sie am Tag der Induktion die Medien, waschen Sie die Zellen mit PBS und induzieren Sie die Zellen dann für 2 Tage mit Vorinduktionsmedien (DMEM/F12 ergänzt mit 10% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM Nicotinamid [NA] und 1mM β-Mercaptoethanol [β-ME]).
8. Induzieren Sie die Zellen für weitere 1 Tag mit hohem Glukose-DMEM (HG-DMEM, 4,5 g / L Glukose), ergänzt mit 2,5% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 μg / ml Streptomycin, 0,25 μg / ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM NA und 1 mM β-Mercaptoethanol. Sammeln Sie Zellpellets am Ende dieser Phase (in diesem Protokoll als D3-Zellen bezeichnet).
9. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 7 Tage in den abschließenden Differenzierungsinduktionsmedien bestehend aus HG-DMEM, ergänzt mit 2,5% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B, 2 mM L-Glutamin, 10 mM NA, 1mM β-Mercaptoethanol und 10 nM Exendin-4.
10. Sammeln Sie am Ende des angegebenen Zeitraums Zellpellets (in diesem Protokoll als Final bezeichnet) und bewerten Sie die erfolgreiche Differenzierung der Zellen durch DTZ-Färbung und GSIS-Assay, wie in diesem Protokoll beschrieben.
11. Bewerten Sie die generierten IPCs, indem Sie die Schritte 5 und 6 unten ausführen.

5. Dithizon-Färbung

1. Dithizon (DTZ) Färbstofflösung wie folgt vorbereiten: 25 mg DTZ in 2,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) vollständig auflösen, in Aliquots teilen und bis zur Verwendung bei −20 °C im Dunkeln lagern.
2. Für die Färbung ist eine Arbeitslösung 1:100 (Volumen/Volumen) vorzubereiten, indem die Stammlösung in vollständigem Kulturmedium verdünnt wird (HG-DMEM ergänzt mit 5% FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 0,25 μg/ml Amphotericin B und 2 mM L-Glutamin). Filtern Sie dann die Arbeitslösung durch einen 0,2 μm Spritzenfilter.
3. Als nächstes waschen Sie die Zellen für die spezifizierten DTZ-Färbekulturzellen in einer 6-Well-Platte und waschen Sie die Zellen nach dem Absaugen der Kulturmedien einmal mit PBS und fügen Sie dann 2 ml DTZ-Arbeitslösung in jede Vertiefung hinzu. Im CO 2 Inkubator mindestens₂ h bei 37 °C inkubieren.
4. Waschen Sie die Zellen vorsichtig 2 mal mit PBS. Nach der letzten Wäsche 2 ml PBS in jedes Bohrloch geben. Beobachten Sie dann die karminrot gefärbten IPCs unter einem inversen Mikroskop. Verwenden Sie uninduzierte Ad-MSCs, die ursprünglich in einem vollständigen Wachstumsmedium (10% FBS - DMEM/F12) kultiviert wurden, als Steuerelement.

6. Genexpression von β-Zell-Markern durch RT-qPCR

1. RNA-Extraktion
   1. Nach der Differenzierung sammeln Sie die Zellpellets und lagern sie bis zur Verwendung bei −80 °C. Susen Sie jedes Zellpellet (abgeleitet aus den sechs Vertiefungen einer 6-Well-Platte gepoolt) in 1 ml Guanidiumthiocyanat-RNA-Extraktionsreagenz in einem 1,5 ml nukleasefreien Röhrchen, zusammen mit mehrmaligem Auf- und Absteigen. Inkubieren Sie die lysierten Proben bei Raumtemperatur für 5 Minuten, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu ermöglichen.
   2. Fügen Sie 200 μL Chloroform pro 1 ml RNA-Extraktionsreagenz hinzu und verschließen Sie die Röhrchen, die 15 s lang von Hand kräftig geschüttelt werden sollen. Als nächstes 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
   3. Die Proben zentrifugieren bei 13.800 x g für 15 min bei 4 °C. Dies führt zu einer Mischungstrennung in eine Phase mit niedrigerer Chloroform, eine Interphase und eine farblose oberwässrige Phase, wobei die RNA in der wässrigen Phase verbleibt.
   4. Legen Sie die obere wässrige Phase in eine neue Röhre, während Sie vorsichtig vermeiden, die Interphase zu berühren.
   5. 600 μL 100% Isopropanol in die wässrige Phase (1:1 Volumen) geben, dann die Proben 25 Mal gründlich durch Inversion mischen und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.
   6. Die Proben zentrifugieren bei 18.800 x g für 30 min bei 4 °C. Die ausgefällte RNA bildet ein kleines gelartiges Pellet auf der Röhrchenseite.
   7. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Pellets mit 1 ml 80% eiskaltem Ethanol. Nach Zugabe des Ethanols führen Sie langsam mehrere Pipettierungen des RNA-Pellets für 10 s durch.
   8. Die Proben werden 5 min bei 9.600 x g bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und lassen Sie die RNA-Pellets 5-10 min an der Luft trocknen.
   9. Nach dem Trocknen lösen Sie die RNA-Pellets in 25-100 μL RNase-freiem Wasser (entsprechend der ursprünglichen Pelletgröße) auf, indem Sie sie mehrmals auf und ab pipettieren, bis sie vollständig in 1,5 ml nukleasefreien Röhrchen vollständig gelöst werden. Vermeiden Sie eine übermäßige Trocknung des RNA-Pellets.
      HINWEIS: Normalerweise wird das Pellet transparent, wenn es trocknet. Sobald es jedoch klar ist, suspendieren Sie es sofort, um eine übermäßige Trockenheit des Pellets zu vermeiden.
   10. Quantifizieren Sie RNA, indem Sie die optischen Dichten (OD) bei 260 nm und 280 nm bestimmen, wobei nukleasefreies Wasser als Leer verwendet wird.
   11. Stellen Sie sicher, dass die Stichproben OD260/OD280 = 1,8-2,0 aufweisen.
2. cDNA-Synthese
   1. Synthetisieren Sie cDNA aus der isolierten Gesamt-RNA mit einem cDNA-Synthesekit.
   2. Führen Sie die cDNA-Synthesereaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers durch. In einem 200-μL-PCR-Röhrchen wird ein Volumen RNA-Lösung, das 0,5 μg Gesamt-RNA enthält, zu dem in Tabelle 1 gezeigten Reaktions-Master-Mix gegeben.
   3. Nach Zugabe der RNA zum Master-Mix geben Sie die Mischung durch ein Zyklusprogramm von 50 °C für 30 min für einen Zyklus ein, gefolgt von einem Inaktivierungszyklus von 95 °C für 2 min mit einem Thermocycler.
   4. Verdünnen Sie die cDNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine Endkonzentration von 2 ng/μL. Bei −20 °C für nachfolgende RT-qPCR lagern.
3. RT-qPCR mit SYBR Green Master Mix
   1. Führen Sie die RT-qPCR-Reaktion für jedes Zielgen unter Verwendung der cDNA-Vorlage gemäß der in Tabelle 2 gezeigten Reaktionsmischung durch. Führen Sie alle Maßnahmen in dreifacher Ausführung durch.
   2. Die verwendeten Primersätze sind in Tabelle 3 dargestellt. Führen Sie alle RT-qPCR-Verfahren auf Eis durch.
   3. Führen Sie die RT-qPCR-Reaktion mit einer real-time PCR-Maschine auf Standardprogrammeinstellungen durch. Die thermischen Zyklusbedingungen umfassten eine anfängliche Denaturierung von 95 °C für 10 min, gefolgt von 45 Denaturierungszyklen (95 °C, 15 s) und kombiniertem Glühen/Verlängern (60 °C, 1 min).
   4. Bestimmen Sie die_CT-Werte und erfassen Sie die Ausdrucksstufen gemäß ^{2-ΔΔCt, mit β-Actin} als interne Kontrolle.

Tabelle 1: cDNA-Synthese-Master-Mix-Volumina.

Tabelle 2: RT-qPCR-Reaktionsgemisch

Tabelle 3: Vorwärts- und Rückwärts-Primersequenzen

7. Glukosestimulierte Insulinsekretion

1. Herstellung des Ringer-Bicarbonat-Puffers (KRB) von Kreb
   1. Bereiten Sie Krebs Ringer-Bicarbonat-Pufferlösung (KRB) mit 2 mM Glukose- (niedrige Glukose) und 20 mM Glukosekonzentration (hohe Glukose) für den GSIS-Assay (Glucose-stimulierte Insulinsekretion) vor. Die für die KRB-Pufferaufbereitung verwendeten Komponenten sind in Tabelle 4 aufgeführt.
   2. Stellen Sie den pH-Wert des Puffers mit 1 N HCl auf etwa 7,25-7,35 ein (d. h. 0,1-0,2 Einheiten unter dem gewünschten pH-Wert 7,4, da er während der Filtration ansteigen kann).
   3. Rinderserumalbumin (BSA) frisch in einer Konzentration von 0,1 % (Gewicht/Volumen) zugeben.
   4. Fügen Sie danach Glukose hinzu (18 mg für 50 ml KRB, um den 2 mM KRB-Puffer mit niedriger Glukose vorzubereiten, und 180 mg für 50 ml KRB, um den 20 mM hohen Glukose-KRB-Puffer vorzubereiten).
   5. Sterilisieren Sie die vorbereiteten LG- und HG KRB-Puffer durch Filtration durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter, um für den GSIS-Assay bereit zu sein.
2. GSIS-Assay
   1. Samen Sie zunächst 1 x 10⁵ Zellen / Well in einer 12-Well-Zellkulturplatte und induzieren Sie diese Zellen unter Verwendung des exakt gleichen Differenzierungsinduktionsprotokolls.
   2. Waschen Sie am Ende des Induktionsprotokolls die erzeugten IPCs (in Platte) vorsichtig 2 Mal mit PBS und einmal mit LG-KRB.
   3. Anschließend inkubieren Sie die IPCs mit 300 μL LG-KRB/Well für 1 h und verwerfen Sie dann diesen Puffer.
   4. Als nächstes inkubieren Sie die IPCs mit 300 μL entweder 2 mM (LG) oder 20 mM (HG) KRB-Puffer für weitere 1 h. Sammeln Sie am Ende der Inkubationszeit den Überstand und lagern Sie ihn bei −80 °C für den anschließenden sezernierten Insulinassay mit einem handelsüblichen ELISA-Kit und unter Beachtung der Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Versuchen Sie, beim Absaugen oder Hinzufügen des PBS- und KRB-Puffers beim Ausführen des GSIS-Assays so vorsichtig wie möglich zu sein.

Tabelle 4: Die für die KRB-Puffervorbereitung verwendeten Komponenten.

8. Statistische Auswertung

1. Drücken Sie alle Daten als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus. Alle Vergleiche wurden mit Hilfe der unidirektionalen Varianzanalyse (ANOVA) und Tukeys Post-hoc-Test mit statistischer Software durchgeführt. Ergebnisse mit p-Werten ** p ≤ 0,01 und *p ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs
Wie in Abbildung 2 gezeigt, zeigten die isolierten Zellen aus Fettgewebe eine heterogene Population von abgerundeten und fibroblastenähnlichen Zellen ab dem nächsten Tag der Isolierung (Abbildung 2A). 4 Tage nach der Isolierung begannen die Fibroblastenzellen in Anzahl und Größe zuzunehmen und als homogene Population durch Passage 1 zu wachsen (Abbildung 2B, C). Diese Zellen wuchsen weiterhin als kunststoffhafte, fibroblastische Zellen, wie gezeigt, bis zur Passage 3 und erfüllten das erste Kriterium der MSC-Eigenschaften (Abbildung 2D). Diese Ad-MSCs zeigten sehr gute Kultureigenschaften, und dieses Protokoll erwies sich als relevantes, einfaches und relativ schnelles Protokoll, um Ad-MSCs von Nebenhoden-Fettpolstern zu isolieren.

Der nächste Schritt bestand darin, die isolierten Ad-MSCs zu charakterisieren. Laut ISCT sollten MSCs die drei Kriterien der plastischen Adhärenz, der Expression mesenchymaler CDs mit einem Mangel an hämatopoetischen Markern und der Fähigkeit, sich in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu differenzieren, befolgen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigte die Durchflusszytometrie-Analyse, dass die meisten dieser Zellen CD90 und CD105 exprimierten (76,4% bzw. 73,6%). Inzwischen waren sie fast negativ für CD34 (0,1%).

Darüber hinaus zeigten sie bei der Induktion der Differenzierung dieser Zellen die Fähigkeit, sich in Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten zu differenzieren. Wie in Abbildung 3B (oberes Feld) gezeigt, zeigten die Adipozyten eine ölrote Färbung von Lipidvakuolen im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen. Die Osteozyten zeigten im Vergleich zu Kontrollzellen eine charakteristische Alizarin-Rot-Färbung (Abbildung 3B, mittleres Panel). Schließlich zeigten Chondrozyten-induzierte Zellen eine blaue Färbung der extrazellulären Matrix im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen (Abbildung 3B, unteres Bild).

Diese Daten zeigen deutlich, dass isolierte Zellen aus Fettgewebe nicht nur gute Kultureigenschaften aufweisen, sondern auch alle für MSCs vorgeschlagenen Kriterien aufweisen.

Differenzierung von Ad-MSCs in insulinproduzierende Zellen (IPCs)
Wie in Abbildung 4A gezeigt, haben wir ein relativ einfaches, kurzes Protokoll verwendet, um Ad-MSCs in IPCs zu unterscheiden. Nach der Induktion der Differenzierung wurden die induzierten IPCs auf verschiedene Arten bewertet. Die induzierten Zellen zeigten deutliche morphologische Veränderungen. Wie in Abbildung 4B (oberes Panel) gezeigt, zeigten die induzierten Zellen eine abgerundete, clusterartige Morphologie im Vergleich zur normalen fibroblastischen Morphologie von Ad-MSCs. Interessanterweise zeigten diese Cluster bei der Färbung mit Dithizon eine karmesinrote Färbung, die eine Eigenschaft von Zinkgranula der β-Zell-Färbung ist (Abbildung 4B, untere Tafel).

Danach wurden die erzeugten IPCs im Vergleich zu den uninduzierten Kontrollzellen genetisch auf die Expression der spezifischen β-Zell-Marker untersucht. Wie in Abbildung 5A-E gezeigt, waren die induzierten Zellen in der Lage, verschiedene spezifische β-Zell-Marker zu exprimieren, was auf ihre Fähigkeit hinweist, IPCs zu erzeugen. Was den definitiven Endodermmarker FOXA2-a (wie in Abbildung 5A gezeigt) betrifft, so wurde er bei der D3-Differenzierung im Vergleich zur Kontrolle stark exprimiert, erreichte fast das 30-fache und verringerte sich dann auf nur das 10-fache der Kontrolle in den endgültigen differenzierten Zellen (D3: 28,37 ± 0,88; Finale: 12.10 ± 1.27; S. < 0,05). Was Pdx-1 (das als früher Marker für β-Zellen gilt) betrifft, so war es sowohl in D3- als auch in endgültigen differenzierten Zellen erhöht und erreichte im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen fast das 20-fache (D3: 22,39 ± 5,14; Finale: 17,13 ± 0,342; S. < 0,05; Abbildung 5B). In Bezug auf die anderen β-Zellmarker, nämlich NKX6.1, MafA und Insulin-1 (Ins1), zeigten sie alle eine Erhöhung von D3 bis zur endgültigen Differenzierung und erreichten fast das 8-fache, 12-fache bzw. 300-fache im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen (NKX6.1: D3: 1,94 ± 0,86, Finale: 7,97 ± 1,34, S<0,05; MafA: D3: 6,59 ± 0,4, Finale: 11,54 ± 2,40, S. < 0,05; und Ins1: D3: 27,29 ± 20,27, Finale: 318,20 ± 76,09, S. < 0,05) (Abbildung 5C-E). Dies deutet darauf hin, dass diese Ad-MSCs in IPCs differenzieren können, die β-Zell-Marker exprimieren.

Schließlich wurden diese Zellen auf die Sekretion von Insulin untersucht, wenn sie mit steigenden Glukosekonzentrationen konfrontiert wurden. Wie in Abbildung 5F gezeigt, war das Insulin, das im Überstand der induzierten IPCs sezerniert wurde, wenn es mit 20 mM Glukose herausgefordert wurde, signifikant höher als das, das sezerniert wurde, wenn die Zellen mit 2 mM Glukose herausgefordert wurden (HG: 390 pg/ml ± 33 pg/ml; LG: 234 pg/ml ± 32 pg/ml, p < 0,05; Abbildung 5F)

Diese Daten bestätigten, dass es dem verwendeten Protokoll gelang, die Ad-MSCs in IPCs zu differenzieren, was genetisch und funktionell bestätigt wurde.

Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der Schritte des Protokolls, das zur Isolierung und Charakterisierung von Ad-MSCs verwendet wird. Generiert von Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Mikrophotographische Aufnahmen, die die isolierten Ad-MSCs zeigen . (A) Isolierte Zellen mit kunststoffhaftender, fibroblastenähnlicher Morphologie beginnen am Tag nach der Isolierung zu erscheinen. (B) Im Laufe der Zeit vermehren sich diese adhärenten Ad-MSCs (mit fibroblastenähnlicher Morphologie) und nehmen an Zahl zu und erreichen eine homogenere fibroblastenähnliche Population in (C) P1 und (D) P3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Charakterisierung von Ad-MSCs. (A) Die durchflusszytometrische Analyse von Ad-MSCs zeigt, dass diese Zellen für CD34 (oberes Panel) fast negativ sind, während die Mehrheit der Zellen CD90 und CD105 exprimiert (unteres Panel). Ad-MSCs können sich in die drei mesenchymalen Linien unterscheiden, nämlich (B) Adipozyten (wo Öltröpfchen durch Öl rot gefärbt sind), (C) Osteozyten, die durch Alizarinrot gefärbt sind, und (D) Chondrozyten, die durch Alcian Blue gefärbt sind (im Vergleich zu uninduzierten Kontrollzellen). Kontrolle: uninduzierte Zellen, Diff: differenzierte Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Differenzierung von Ad-MSCs in IPCs. (A) Schematische Darstellung des Differenzierungsprotokolls, das zur Erzeugung von IPCs aus Ad-MSCs verwendet wird, zusammen mit Mikroaufnahmen für die Zellen in jeder Phase während der Induktion der Differenzierung in Richtung IPCs. Bei der Differenzierung verlieren die Zellen ihre fibroblastische Morphologie und neigen dazu, sich bildende Cluster zu aggregieren, die dazu neigen, sich abzulösen und in Suspensionsmedien zu wachsen. (B) Mikroaufnahmen zeigen Kontroll-Ad-MSCs und IPCs, die durch das obige Protokoll erzeugt wurden, und zeigen runde morphologische Veränderungen (rechtes Feld) im Vergleich zur fibroblastenähnlichen Morphologie der uninduzierten Ad-MSCs (linkes Feld), entweder ungefärbt (oberes Feld) oder DTZ-gefärbt (unteres Panel).
Kontrolle: uninduzierte Zellen; IPCs: insulinproduzierende Zellen; NA: Nicotinamid; β-ME: Beta-Mercaptoethanol; D3: Induzierte Zellen an Tag 3 während der Induktion der Differenzierung in Richtung IPCs; D10: endgültige differenzierte IPCs am Ende des Induktionsprotokolls; Ex-4: exendin-4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Relative Expressionsniveaus von β-Zell-Markern und GSIS für IPCs. Relative Expressionsniveaus nach qRT-PCR für (A) FOXA2, (B) Pdx-1, (C) NKX6.1, (D) MafA und (E) Ins-1. (F) Spiegel von sezerniertem Insulin im Überstand, wenn die erzeugten IPCs mit 2mM Glucose (LG) oder 20mM Glucose (HG) herausgefordert werden. Kontrolle: uninduzierte Ad-MSCs, Tag-3: differenzierte Zellen, die bei D3 gesammelt wurden; Finale: endgültige differenzierte IPCs; LG: wenig Glukose; HG: hohe Glukose. a: Der Mittelwert unterscheidet sich von der Kontrolle bei p < 0,05; b: Mittelwert unterscheidet sich von Tag-3 bei p < 0,05; *: Der Mittelwert von LG unterscheidet sich von HG bei p < 0,05; Der Vergleich wurde mit einem unabhängigen T-Test durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Alle Co-Autoren erklären keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Arbeit.