Methodenartikel

Vergleich von Methoden zur Isolierung entomopathogener Pilze aus Bodenproben

DOI:

10.3791/63353

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6. Januar 2022

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1Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2Laboratório de Taxonomia Bioquímica e Bioprospecção de Fungos/Coleção de Cultura de Fungos Filamentosos, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Entomopathogene Pilzkolonien werden aus tropischen Bodenproben mit Tenebrio-Ködern, Galleria-Ködern sowie selektivem künstlichem Medium, d. H. Kartoffeldextrose-Agar, das mit Hefeextrakt angereichert ist, das mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium) angereichert ist, isoliert.

Zusammenfassung

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Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben zu vergleichen. Der Boden ist ein reicher Lebensraum für Mikroorganismen, darunter EPF, die insbesondere zu den Gattungen Metarhizium und Beauveria gehören, die Arthropodenschädlinge regulieren können. Biologische Produkte auf der Basis von Pilzen sind auf dem Markt hauptsächlich für die Schädlingsbekämpfung von landwirtschaftlichen Arthropoden erhältlich. Trotz der hohen endemischen Biodiversität werden weltweit nur wenige Stämme in kommerziellen Bioprodukten verwendet. In der vorliegenden Studie wurden 524 Bodenproben auf Kartoffeldextrose-Agar kultiviert, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid (CTC-Medium). Das Wachstum von Pilzkolonien wurde 3 Wochen lang beobachtet. Alle Metarhizium und Beauveria EPF wurden morphologisch auf Gattungsebene identifiziert. Darüber hinaus wurden einige Isolate molekular auf Speziesebene identifiziert. Vierundzwanzig dieser 524 Bodenproben wurden auch mit der Insektenködermethode (Galleria mellonella und Tenebrio molitor) auf EPF-Vorkommen untersucht. Aus den 524 Bodenproben wurden insgesamt 51 EPF-Stämme isoliert (41 Metarhizium spp. und 10 Beauveria spp.). Alle Pilzstämme wurden entweder aus Ackerland oder Grasland isoliert. Von den 24 zum Vergleich ausgewählten Proben waren 91,7% positiv auf EPF mit Galleria-Ködern , 62,5% mit Tenebrio-Köder und 41,7% mit CTC. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Verwendung von Insektenködern zur Isolierung der EPF aus dem Boden effizienter ist als die Verwendung des CTC-Mediums. Der Vergleich von Isolationsmethoden neben der Identifizierung und Konservierung von EPF wirkt sich positiv auf das Wissen über Biodiversität aus. Die Verbesserung der EPF-Sammlung unterstützt die wissenschaftliche Entwicklung und technologische Innovation.

Einleitung

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Der Boden ist die Quelle mehrerer Mikroorganismen, einschließlich entomopathogener Pilze (EPF). Diese besondere Gruppe von Pilzen wird durch ihre Fähigkeit erkannt, Arthropodenwirte, insbesondere Insekten, zu besiedeln und oft zu töten1. Nach Isolierung, Charakterisierung, Auswahl virulenter Stämme und Registrierung werden EPF für die Arthropoden-Schädlingsbekämpfung in Massenproduktion hergestellt, was ihre wirtschaftliche Relevanzunterstützt 2. Dementsprechend gilt die Isolierung von EPF als erster Schritt zur Entwicklung eines Biopestizids. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) und Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) sind die häufigsten Pilze, die zur Arthropoden-Schädlingsbekämpfungeingesetzt werden 3. EPF wurden erfolgreich aus dem Boden, Arthropoden mit sichtbarer Mykose, kolonisierten Pflanzen und der Pflanzenrhizosphäre 4,5 isoliert.

Die Isolierung von EPF kann auch nützlich sein, um die Vielfalt, Verteilung und Ökologie dieser speziellen Gruppe zu untersuchen. Jüngste Literatur berichtete, dass die Verwendung von EPF unterschätzt wird, und zitierte mehrere unkonventionelle Anwendungen von EPF, wie ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu verbessern4, toxische Verunreinigungen aus dem Boden zu entfernen und in der Medizin verwendetzu werden 6. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, die Effizienz der Isolierung von EPF aus dem Boden mit Insektenködern im Vergleich zum künstlichen Kulturmedium 7,8,9 zu vergleichen. Die Verwendung von Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) als Insektenköder im Rahmen der EPF-Isolierung wurde gut angenommen. Diese Larven werden weltweit von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als experimentelles Modell zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionenverwendet 10,11. Die Larve Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) gilt als ein weiteres Insektenmodell für Studien mit Virulenz und zur Isolierung von EPF, da dieses Insekt im Labor zu geringen Kosten leicht bis selten ist 7,12.

Kulturunabhängige Methoden wie die Verwendung einer Vielzahl von PCR-Techniken können angewendet werden, um EPF auf ihren Substraten, einschließlich Boden13,14, nachzuweisen und zu quantifizieren. Um diese Pilzkolonien jedoch richtig zu isolieren, sollte ihr Substrat auf ein selektives künstliches Medium9 kultiviert werden, oder die in den Proben vorhandenen Pilze können mit empfindlichen Insekten15 geködert werden. Auf der einen Seite ist CTC ein dodinfreies künstliches Medium, das aus Kartoffeldextrose-Agar besteht, angereichert mit Hefeextrakt, ergänzt mit Chloramphenicol, Thiabendazol und Cycloheximid. Dieses Medium wurde von Fernandes et al. entwickelt. 9 zur Maximierung der Erholung von natürlich vorkommenden Beauveria spp. und Metarhizium spp. aus dem Boden. Auf der anderen Seite können G. mellonella und T. molitor Larven auch erfolgreich als Köder verwendet werden, um EPF-Isolate aus dem Boden zu gewinnen. Laut Sharma et al.15 berichteten jedoch weniger Studien über die gleichzeitige Verwendung und den Vergleich dieser beiden Köderinsekten. Portugiesische Weinbergsböden zeigten signifikante Gewinnungsraten von Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin mit T. Molitorlarven im Vergleich zu G. mellonella Larven; im Gegensatz dazu Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) Die Vivill-Isolierung war mit der Verwendung von G. mellonella-Ködern 15 verbunden. Daher sollte die Entscheidung, welche EPF-Isolationsmethode verwendet werden soll (d. h. G. mellonella-Köder, T. molitor-köder oder CTC-Medium), entsprechend dem Ziel der Studie und der Laborinfrastruktur berücksichtigt werden. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Wirksamkeit der Verwendung von Insektenködern mit künstlichem selektivem Medium zur Isolierung von EPF aus Bodenproben zu vergleichen.

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Protokoll

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Als die vorliegende Studie auf das brasilianische genetische Erbe zugriff, wurde die Forschung beim National System for the Management of Genetic Heritage and Associated Traditional Knowledge (Sisgen) unter dem Code AA47CB6 registriert.

1. Bodenprobenahme

  1. Sammeln Sie 800 g Erde (mit oder ohne einfallende sekundäre Pflanzenwurzeln) bis zu einer Tiefe von 10 cm mit einer kleinen Schaufel. Lagern Sie sie in Polypropylenbeuteln bei Raumtemperatur bis zum Beginn des Experiments.
    HINWEIS: Kleine Wurzeln können auch gesammelt werden, da EPF über Rhizosphärenkompetenz verfügt. Je schneller die Verarbeitung der Proben ist, desto besser, da die Pilzsporen im Laufe der Zeit möglicherweise weniger lebensfähig sind. In der vorliegenden Studie wurden Proben nicht mehr als 7 Tage nach der Entnahme analysiert.
  2. Verwenden Sie ein GPS, um den Standort der gesammelten Proben in Breiten- und Längengrad zu identifizieren und das gesammelte Gebiet nach der Art des Bodens zu klassifizieren (z. B. Grasland, einheimischer Regenwald, Seeufer oder Ackerland).

2. Isolationsverfahren für entomopathogene Pilze

  1. Isolierung mit CTC-selektivem künstlichem Medium.
    1. Zur Herstellung des CTC-Mediums [Kartoffeldextrose-Agar plus Hefeextrakt (PDAY), ergänzt mit 0,5 g/L Chloramphenicol, 0,001 g/L Thiabendazol und 0,25 g/L Cycloheximid9], wiegen Sie alle Reagenzien einzeln, mischen Sie sie in destilliertem Wasser und sterilisieren Sie das Medium im Autoklaven. In einer Biosicherheitswerkbank werden 23 mL des Mediums in 60 mm x 15 mm Petriplatten geklebt.
      VORSICHT: Verwenden Sie beim Wiegen von CTC-Reagenzien einen Laborkittel, eine Maske, Handschuhe und eine Schutzbrille, da Cycloheximid und Chloramphenicol giftig sind.
    2. Von jeder Bodenprobe (mit oder ohne Wurzeln) werden 0,35 ± 0,05 g gewogen und in ein 1,5 ml Mikroröhrchen gegeben.
    3. In einer Biosicherheitskabine 1 ml sterile 0,01% (vol/vol) Polyoxyethylensorbitanmonooleat-wässrige Suspension für 30 s in das Mikroröhrchen geben, das Boden und Wirbel enthält.
    4. Entfernen Sie 50 μL des Überstands und pipettieren Sie ihn mit CTC-Medium auf die Mitte der Petriplatten. Dispergieren Sie die Suspensionen homogen auf die Oberfläche des Mediums mit einem sterilen Drigalski-Spatel (6 mm Durchmesser).
      HINWEIS: Für jede Bodenprobe sollten mindestens drei Replikate vorbereitet werden.
    5. Inkubieren Sie die Platten in Klimakammern (25 ± 1 °C, relative Luftfeuchtigkeit ≥80%) im Dunkeln und beobachten Sie das Wachstum von Pilzkolonien nach 7, 14 und 21 Tagen Inkubation.
    6. Beobachten Sie die Makromorphologie und Mikromorphologie der Pilzkolonien, die EPF suchen. Die EPF-Kulturen werden auf Kartoffeldextrose-Agar-Medium plus 0,05% Chloramphenicol (PDAC) übertragen, bis Reinkulturen erhalten sind.
      HINWEIS: Verwenden Sie die unten in Schritt 3 dargestellten Beschreibungsschlüssel zur Identifizierung von EPF-Kolonien.
  2. Isolierung mit Insektenködern
    1. Verwenden Sie oberflächendesinfizierte Larven von G. mellonella und T. molitor. Tauchen Sie die Larven für 1 min zur Sterilisation in 0,5% Natriumhypochlorit. Waschen Sie die Larven zweimal mit sterilem Wasser.
      HINWEIS: G. mellonella Larven aus dem vierten Stadium wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Die Larvenstadien von T. molitor waren nicht standardisiert.
    2. Verwenden Sie Plastiktöpfe, um die Köder zusammenzubauen. Geben Sie 250 g gesammelte Erde zu jedem Kunststofftopf (98 mm Breite x 47 mm Höhe x 142 mm Länge). Trennen Sie 15 Larven jeder Art (T. molitor und G. mellonella) und deponieren Sie fünf Larven pro Plastiktopf. Lagern Sie die Töpfe bei 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit ≥ 80% im Dunkeln.
      HINWEIS: Bohren Sie 10 kleine Löcher (2 mm Durchmesser) in die Topfdeckel, um eine Belüftung zu ermöglichen. Ein scharf erhitztes Eisengerät kann verwendet werden, um die Löcher zu bohren.
    3. Homogenisieren Sie den Boden jeden zweiten Tag, um maximalen Kontakt der Larven mit dem Boden zu ermöglichen.
      HINWEIS: Feuchtigkeit ist wichtig, um die Pilzinfektion von Larven zu unterstützen. Um die Feuchtigkeit im Boden zu erhalten, sprühen Sie steriles destilliertes Wasser bei Bedarf auf die Bodenoberfläche. Weichen Sie die Bodenprobe nicht in Wasser ein.
    4. Analysiere die Töpfe täglich auf der Suche nach toten Insekten.
      HINWEIS: Beobachten Sie die verbleibenden Larven in der Kolonie täglich auf pathologische Anzeichen von Wirbellosen, um sicherzustellen, dass die Insekten nicht infiziert sind. Alternativ können Kontrolltöpfe mit steriler Erde in die Studie einbezogen werden, um den Gesundheitszustand der Insektenlarven zu überprüfen.
    5. Entfernen Sie tote Insekten und sterilisieren Sie sie oberflächlich mit 0,5% Natriumhypochlorit für 1 min. Legen Sie die sterilen Insekten 7 Tage lang in eine feuchte Kammer (relative Luftfeuchtigkeit ≥ 80%) bei 25 ± 1 ° C, um die Exteriorisierung entomopathogener Pilze (Mykose) zu begünstigen.
    6. Bei Mykose die Konidien von der Insektenoberfläche ernten. Verwenden Sie eine mikrobiologische Schleife, um die Konidien auf PDAC-Medium unter einem stereoskopischen Mikroskop zu platzieren. Als Alternative legen Sie die gesamte infizierte Larve auf das PDAC-Medium. Inkubieren Sie die Kulturplatten in einer Klimakammer bei 25 ± 1 °C und einer relativen Luftfeuchtigkeit ≥ 80%.
    7. Beobachten Sie die Makromorphologie und Mikromorphologie der Pilzkolonien auf den Platten, um die Identität der EPF zu bestätigen. Wiederholen Sie die Kultivierung auf PDAC, bis reine Pilzkolonien erhalten sind.
      HINWEIS: Verwenden Sie die unten in Schritt 3 dargestellten Beschreibungsschlüssel zur Identifizierung von EPF-Kolonien.

3. Identifizierung von EPF (Metarhizium spp. und Beauveria spp.)

  1. Analysieren Sie die makromorphologischen Eigenschaften der Pilzkulturen auf den Platten (d. H. Oberfläche und Rückseite der Kolonien, ihre Form, Kante, Wachstumsrate, Farbe, Textur, diffusibles Pigment, Exsudate und Luftkonidien) nach 14 Tagen bei 25 ± 1 ° C und relativer Luftfeuchtigkeit ≥ 80%.
  2. Übertragen Sie die Luftkonidien für 3 Tage bei 25 ± 1 °C und relativer Luftfeuchtigkeit ≥ 80% auf Objektträgerkulturen (Mikrokulturtechnik)16 und färben Sie sie mit Lactophenolblau, um die mikroskopischen Merkmale (d. H. Anordnung der Konidien, Konidiophoren, Form und Größe der Konidien) zu beobachten)17,18,19,20.
  3. Beobachten Sie die mikroskopisch kleinen Pilzstrukturen bei 400x mit einem optischen Mikroskop, um die EPF-Identifizierung zu bestätigen.
    HINWEIS: Morphologische Schlüssel für EPF werden in den Berichten von Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. und Humber17,18,19,20 beschrieben. Die Makro- und Mikromorphologie von Pilzkolonien sind die häufigsten Kriterien, um fadenförmige Pilze auf Gattungsebene zu identifizieren. Je nach Gattung der EPF ändern sich diese morphologischen Eigenschaften. Humber20 stellt einen Identifizierungsschlüssel für die wichtigsten Gattungen pilzlicher Entomopathogene dar. Metarhizium spp. Kolonien zum Beispiel sind normalerweise kreisförmig, pudrig, weisen unterschiedliche Grüntöne auf und können Exsudat aufweisen. Mikroskopisch gesehen haben diese Kolonien konidiogene Zellen, die auf breit verzweigten, dicht verflochtenen Konidiophoren, die ein kompaktes Hymenium bilden, apikal sind, und zylindrische bis ellipsoide Konidien in parallelen Ketten, die Säulen oder plattenartige Massen bilden. Beauveria spp. Kolonien sind normalerweise weiß, pudrig oder baumwollartig. Sie zeigen konidiogene Zellen mit einem erweiterten Basalanteil, der sich apikal in Zickzackrichtung erstreckt. Beauveria conidiophores bilden dichte Gruppen von kugelförmigen Konidien. Molekulare Analysen sind für die Identifizierung von EPF auf Speziesebene erforderlich.
  4. Führen Sie molekulare Analysen der Isolate zur taxonomischen Identifizierung auf Artebene durch. Für die in dieser Studie isolierten EPF-Stämme, nämlich Metarhizium spp. und Beauveria spp., führen molekulare Analysen auf der Grundlage der Berichte von Bischoff et al.17 und Rehner et al.18 durch.
  5. Nachdem Sie bestätigt haben, dass die Isolate EPF sind, deponieren Sie die Isolate in einer Sammlung von Pilzkulturen. In der vorliegenden Studie wurden die Isolate in der entomopathogenen Pilzkultursammlung aus dem Labor für mikrobielle Kontrolle (LCM) an der Föderalen Ländlichen Universität von Rio de Janeiro deponiert.

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Ergebnisse

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Insgesamt 524 Bodenproben wurden zwischen 2015 und 2018 aus Grünland entnommen: Viehweideland (165 Proben), einheimischer Tropenwald (90 Proben), Seeland (42 Proben) und Kultur-/Ackerland (227 Proben) im brasilianischen Bundesstaat Rio de Janeiro. Einzelheiten zu den geografischen Koordinaten der für EPF positiven Proben sind der ergänzenden Tabelle 1 zu entnehmen.

Von den 524 Bodenproben wurden 500 Proben nur mit CTC-Medium analysiert, und 24 Proben wurden gleichzeitig mit dr...

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Diskussion

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Natürliche und landwirtschaftliche Bodenlebensräume sind typische Umgebungen für EPF22 und ein ausgezeichnetes natürliches Reservoir. In der vorliegenden Studie wurden zwei Methoden der EPF-Isolierung mit Insektenködern im Vergleich zu selektivem Medium untersucht. Der erste Schritt zur Isolierung ist die Entnahme der Bodenproben. Die ordnungsgemäße Lagerung und Identifizierung von Bodenproben ist von entscheidender Bedeutung. Informationen über Breitengrad, Längengrad, Bodentyp und Biom sind für ...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

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Diese Studie wurde zum Teil vom Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) aus Brasilien, Finanzcode 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (Projektnummer E-26/010.001993/2015) und Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) aus Brasilien finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AutoklavPhoenix Luferco9451
BiosicherheitswerkbankAirstream ESCOAC2-4E3
ChloramphenicolSigma-AldrichC0378
KlimakammernEletrolabEL212/3
DeckglasRBR3871
CycloheximidSigma-AldrichC7698
Drigalski SpatelMarienfeld1800024
GPS AppGeolocation App2.1.2005
Lactophenolblau-LösungSigma-Aldrich61335
MikroskopZeiss Axio star plus1169 149
MikroskopkameraZeiss Axiocam 105 color426555-0000-000
Mikroskop SoftwereZen lite Zeiss 3.0
ObjektträgerOlenk5-7105-1
MikroröhrchenMARKEZ336769-1PAK
PetriplattenKasviK30-6015
PipettenspitzeVattenVT-230-200C/VT-230-1000C
PippetteHTL - LabmateproLMP 200 / LMP 1000
KunststofftöpfePrafesta descartá veis8314
Polypropylen-BeutelExtrusa38034273/5561
Kartoffel-Dextrose-AgarKasviK25-1022
Prismen-Software 9.1.2Graph Pad Shovel
Tramontina77907009
Tenebrio mollitorSafariQP98DLZ36
ThiabendazolSigma-AldrichT8904
Tween 80Vetec60REAVET003662
VortexBiomixerQL-901
HefeextraktKasviK25-1702

Referenzen

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