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Methodenartikel

Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

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DOI:

10.3791/63361

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21. Januar 2022

 , 
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Gap-Junction-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren und den Sperrschichtstrom zwischen zwei apponierten Eizellen mit einem kommerziellen Verstärker aufzuzeichnen, der für Dual-Eizellen-Spannungs-Clamp-Aufnahmen in einem hohen Seitenstrom-Messmodus entwickelt wurde.

Zusammenfassung

Die heterologe Expression von Connexinen und Innexinen in Xenopus-Eizellen ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von Gap Junctions (GJs). Dieser Ansatz ist jedoch technisch anspruchsvoll, da er eine Differenzspannungsklemme von zwei gegenüberliegenden Eizellen erfordert, die eine gemeinsame Basis haben. Obwohl es einer kleinen Anzahl von Labors gelungen ist, diese Technik durchzuführen, haben im Wesentlichen alle entweder hausgemachte Verstärker oder kommerzielle Verstärker verwendet, die für Einzeleizellaufnahmen entwickelt wurden. Für andere Labore ist es oft eine Herausforderung, diese Technik zu implementieren. Obwohl ein High-Side-Strom-Messmodus in einen kommerziellen Verstärker für Dual-Oozyten-Spannungs-Clamp-Aufnahmen integriert wurde, gab es bis zu unserer jüngsten Studie keinen Bericht über seine Anwendung. Wir haben den Ansatz der Hochstrommessung durch die Einführung mehrerer technischer Modifikationen praktischer und bequemer gemacht, darunter die Konstruktion einer magnetbasierten Aufzeichnungsplattform, die eine präzise Platzierung von Eizellen und verschiedenen Elektroden ermöglicht, die Verwendung der Badlösung als Leiter in spannungsdifferenzierten Elektroden, die Verwendung einer kommerziellen KCl-Elektrode mit geringer Leckage als Referenzelektrode, Herstellung von Strom- und Spannungselektroden aus dünnwandigen Glaskapillaren und Positionierung aller Elektroden mit magnetisch basierten Geräten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht bequeme und robuste Aufnahmen von Sperrschichtströmen (Ij) zwischen zwei gegenüberliegenden Xenopus-Eizellen .

Einleitung

GJs sind interzelluläre Kanäle, die den Stromfluss und den Austausch kleiner zytosolischer Moleküle zwischen benachbarten Zellen ermöglichen können. Sie kommen in vielen Zelltypen vor und erfüllen vielfältige physiologische Funktionen. GJs werden bei Wirbeltieren durch Connexine gebildet, bei Wirbellosen durch Innexine. Jedes GJ besteht aus zwei nebeneinander gestellten Hemikanälen mit entweder 6 oder 8 Untereinheiten pro Hemikanal, je nachdem, ob es sich um Connexine oder Innexine 1,2,3 handelt. Menschen haben 21 Connexin-Gene4, während die häufig verwendeten wirbellosen Modelle C. elegans und Drosophila melanogaster 25 bzw. 8 Innexin-Gene bzw. 5,6 aufweisen. Das alternative Spleißen von Gentranskripten kann die Vielfalt der GJ-Proteine zumindest für Innexine weiter erhöhen 7,8.

GJs können basierend auf molekularen Zusammensetzungen in drei Kategorien unterteilt werden: homotypisch, heterotypisch und heteromerisch. Ein homotypisches GJ hat alle seine Untereinheiten, die identisch sind. Ein heterotypisches GJ hat zwei homomere Hemikanäle, aber die beiden Hemikanäle werden von zwei verschiedenen GJ-Proteinen gebildet. Ein heteromerer GJ enthält mindestens einen heteromeren Hemikanal. Die molekularen Diversitäten von GJs können unterschiedliche biophysikalische Eigenschaften verleihen, die für ihre physiologischen Funktionen wichtig sind. Die biophysikalischen Eigenschaften von GJ werden auch durch regulatorische Proteinemoduliert 9. Um zu verstehen, wie GJs ihre physiologischen Funktionen erfüllen, ist es wichtig, ihre molekulare Zusammensetzung, biophysikalischen Eigenschaften und die Rolle regulatorischer Proteine in ihren Funktionen zu kennen.

Heterologe Expressionssysteme werden häufig verwendet, um biophysikalische Eigenschaften von Ionenkanälen, einschließlich GJs, und die Auswirkungen von regulatorischen Proteinen auf sie zu untersuchen. Da heterologe Expressionssysteme die Expression spezifischer Proteine ermöglichen, sind sie im Allgemeinen anfälliger für die Sezierung von Proteinfunktionen als native Gewebe, in denen Proteine mit redundanten Funktionen die Analyse erschweren können und die Aufzeichnung von Ij unerreichbar sein kann. Leider sind die am häufigsten verwendeten Zelllinien mit Ausnahme der Neuro-2A-Zelle aufgrund von Komplikationen durch endogene Connexine für die Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von GJ ungeeignet. Selbst Neuro-2A-Zellen sind für diese Art der Analyse nicht immer geeignet. Zum Beispiel konnten wir keine I j inNeuro-2A-Zellen nachweisen, die mit den Innexinen UNC-7 und UNC-9 transfiziert wurden, weder in Abwesenheit noch in Anwesenheit von UNC-1 (unveröffentlicht), was für die Funktion von UNC-9 GJs in C. elegans 9,10 erforderlich ist. Auf der anderen Seite sind Xenopus-Eizellen ein nützliches alternatives System für elektrophysiologische Analysen von GJs. Obwohl sie ein endogenes GJ-Protein, Connexin 38 (Cx38)11, exprimieren, können mögliche Komplikationen leicht vermieden werden, indem ein spezifisches Antisense-Oligonukleotid12 injiziert wird. Analysen von GJs mit Xenopus-Eizellen erfordern jedoch eine differenzielle Spannungsklemme von zwei nebeneinander liegenden Zellen, was technisch eine Herausforderung darstellt. Die frühesten Erfolge der Doppelspannungsklemme von Froschblastomeren wurden vor etwa 40 Jahrenberichtet 13,14. Seitdem haben viele Studien diese Technik verwendet, um Ij in gepaarten Xenopus-Eizellen aufzuzeichnen. Im Wesentlichen wurden jedoch alle früheren Studien entweder mit hausgemachten Verstärkern 12,15,16 oder kommerziellen Verstärkern durchgeführt, die für Aufnahmen auf einzelnen Eizellen entwickelt wurden (GeneClamp 500, AxoClamp 2A oder AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Da selbst die kommerziellen Verstärker keine Anweisungen für die doppelte Eizellenspannungsklemme enthalten, ist es für neue oder weniger anspruchsvolle elektrophysiologische Labore oft eine Herausforderung, diese Technik zu implementieren.

Für die doppelte Eizellenspannungsklemme wurde nur ein kommerzieller Verstärker entwickelt, der OC-725C von Warner Instruments (Materialtabelle, Abbildung 1A). Dieser Verstärker kann entweder in einem Standardmodus (für einzelne Eizellen) oder in einem hohen Seitenstrommessmodus (für einzelne oder zwei Eizellen) verwendet werden, je nachdem, ob zwei Steckdosen in seiner Spannungssonde angeschlossen sind (Abbildung 1B, C). Bis zu unserer jüngsten Studie7 gab es jedoch keine einzige Publikation, die den Einsatz dieses Verstärkers in seinem hohen Seitenstrommessmodus beschrieb. Obwohl der Verstärker von einem anderen Labor für Dual-Eizellenaufnahmen verwendet wurde, wurde er eher im Standard- als im High-Side-Modus21,22 verwendet. Dieser Mangel an Berichten, die den Verstärker in seinem High-Side-Strom-Messmodus verwenden, könnte auf technische Schwierigkeiten zurückzuführen sein. Wir waren nicht in der Lage, stabile Dual-Eizellen-Aufnahmen mit dem High-Side-Modus zu erhalten, indem wir den Anweisungen des Herstellers folgten. Im Laufe der Jahre haben wir drei verschiedene Ansätze für duale Eizellenaufnahmen ausprobiert, darunter die Verwendung von zwei OC-725C-Verstärkern im High-Side-Strommessmodus, zwei OC-725C-Verstärkern im Standardmodus und zwei Verstärkern eines anderen Herstellers. Stabile Aufnahmen gelang uns schließlich erst mit dem ersten Ansatz nach ausgiebigem Versuch und Irrtum. Diese Veröffentlichung beschreibt und demonstriert die Verfahren, die wir verwenden, um GJ-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren, Ij mit dem Hochstrom-Messmodus aufzuzeichnen und die elektrophysiologischen Daten mit gängiger kommerzieller Software zu analysieren. Weitere Informationen über die Doppelspannungsklemmtechnik finden sich in anderen Veröffentlichungen19,23.

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Protokoll

Die Operationen werden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom institutionellen Tierpflegeausschuss der University of Connecticut School of Medicine genehmigt wurde.

1. Froschchirurgie und Vorbereitung von defollikuierten Eizellen

  1. Betäuben Sie einen erwachsenen weiblichen afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) (Materialtabelle), indem Sie in eine kühle (mit Eis) Tricainlösung (~ 300 mg / L) eintauchen.
  2. Warten Sie (~ 15 min), bis der Frosch wenig oder keine Reaktion auf das Zusammendrücken seiner Schwimmhäute zeigt. Legen Sie den Frosch mit dem Bauch nach oben auf einen Operationstisch.
  3. Nach einem Längseinschnitt (8-10 mm lang) an der linken oder rechten unteren Bauchregion ziehen Sie vorsichtig ein kleines Stück Eierstockgewebe mit einer Pinzette heraus und schneiden das Eierstockgewebe mit einer kleinen Schere frei.
  4. Tauchen Sie das freie Eierstockgewebe sofort in eine Ca2+-freie ND96-Lösung (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) in einer 60-mm-Petrischale.
  5. Nachdem Sie den Schnitt durch einfache unterbrochene Nähte mit einer 5-0-Seidennaht (Table of Materials) verschlossen haben, geben Sie den Frosch zur Erholung zurück in einen Flachwassertank.
    HINWEIS: Der Schnitt wird in zwei Schritten geschlossen: zuerst die Peritoneal- und Muskelschichten und dann die Hautschicht. Jeder Frosch wird 5 Operationen mit mindestens einem 4-wöchigen Intervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Operationen unterzogen.
  6. Überführen Sie das isolierte Eierstockgewebe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das 10 ml Ca 2+-freie ND96-Lösung mit 20 mg Kollagenase (Materialtabelle) und20 mg Hyaluronidase (Materialtabelle) enthält.
  7. Schütteln Sie die Röhre auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur (RT), bis alle Eizellen isoliert sind (solitär).
  8. Danach 30-50 Eizellen mit einer Pasteur-Pipette aus Glas in eine Petrischale geben und die Eizellen häufig unter einem Stereomikroskop (≥25x höchste Vergrößerungskraft) untersuchen, um festzustellen, ob sie entgiftet sind.
    HINWEIS: Die Pasteur-Pipette sollte mit einem Diamantritzer (Table of Materials) auf eine breitere Spitzenöffnung "geschnitten" und geflammt werden, um die Schneide zu glätten.
  9. Sobald 70%-80% der Eizellen entwirrt sind, destillieren Sie die Enzymlösung, indem Sie die Tube vorsichtig kippen. Waschen Sie die Eizellen 5 Mal, indem Sie das Röhrchen mit ND96-Lösung (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl 2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) füllen und die Lösung dekantieren.
  10. Nach der letzten Wäsche die Eizellen in eine 60-mm-Petrischale mit ND96-Lösung geben. Große und gesund aussehende Eizellen pflücken und in eine 60-mm-Petrischale mit ND96-Lösung, ergänzt mit Natriumpyruvat (2 mM) und Penicillin-Streptomycin (100 E/ml), mit einer Pasteur-Pipette aus sauberem Glas.
    HINWEIS: "große und gesund aussehende Eizellen" sind solche der Stadien V und VI, die keine Anzeichen einer Überverdauung durch die Enzyme zeigen.
  11. Stellen Sie die Petrischale mit den gepflückten Eizellen in eine Umweltkammer (15-18 °C).

2. GJ-Protein-Expression

  1. Synthetisieren Sie komplementäre RNA (cRNA) eines bestimmten Connexins oder Innexins in vitro mit einem RNA-Transkriptionskit (Table of Materials) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
  2. Ausfällen Sie die cRNA mit einer Lithiumchloridmethode, die in der Bedienungsanleitung des RNA-Transkriptionskits beschrieben ist.
  3. Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol, lösen Sie es in 20 μL nukleasefreiemH2Oauf und fügen Sie 1 μL Ribonuklease-Inhibitor hinzu (40 E, Materialtabelle).
  4. Messen Sie die Konzentration der cRNA mit einem Spektralphotometer (Table of Materials).
  5. Mischen Sie die cRNA mit einem Cx38 Antisense-Oligo, so dass die Endkonzentrationen 200-1.000 ng/μL cRNA und 100 ng/μL Oligo betragen.
    HINWEIS: Die Oligosequenz ist 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, was den Nukleotiden von -5 bis +25 in Xenopus laevis Cx38 mRNA entspricht (NCBI Accession: NM_001088018)11. Der Oligo wird als Stammlösung (2,0 mg/ml) aufbewahrt, bevor er mit der cRNA gemischt wird.
  6. Eliminieren Sie Partikel in der cRNA, indem Sie sich in einer Mikrozentrifuge (~ 16.000 x g) für 2 Minuten drehen und den gesamten Überstand schnell durch Pipettieren in ein neues Röhrchen überführen (vermeiden Sie es, den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören).
  7. Teilen Sie die cRNA in Aliquots (2,5 μL/Durchstechflasche) auf und lagern Sie die Aliquots in einem Gefrierschrank von -80 °C.
  8. Bereiten Sie eine Eizellinjektionsschale vor, indem Sie ein kleines Stück (~ 1 cm x 1 cm) Nylonnetz (Table of Materials) mit einem schnell aushärtenden Epoxidkleber auf den Boden einer 35-mm-Petrischale kleben.
    HINWEIS: Die Eizellinjektionsschale ist wiederverwendbar. Waschen Sie es nach jedem Gebrauch mit 70% Ethanol.
  9. Füllen Sie die Eizellinjektionsschale etwa zur Hälfte mit ND96-Lösung (ergänzt mit Pyruvat und Penicillin-Streptomycin).
  10. Legen Sie 25-30 Eizellen in Reihen in die Petrischale.
  11. Bereiten Sie Glasmikropipetten für Eizellinjektionen vor, indem Sie die Anweisungen in der Bedienungsanleitung des automatisierten Nanoliter-Injektors (Materialtabelle) befolgen.
    HINWEIS: Die Verwendung eines Mikroelektroden-Faseners (Table of Materials) kann dazu beitragen, scharfe Injektionsmikropipetten herzustellen, die die Eizellen nur minimal schädigen.
  12. Füllen Sie eine Injektionsmikropipette mit leichtem Mineralöl und setzen Sie sie in den Mikropipettenhalter des Injektors ein.
  13. Übertragen Sie die cRNA von einem der gespeicherten Aliquots durch Pipettieren auf die Innenseite einer Petrischalenabdeckung oder -unterseite.
  14. Saugen Sie das cRNA-Tröpfchen in die Spitze der Mikropipette, indem Sie die FILL-Taste im Injektor-Controller drücken.
  15. Injizieren Sie die cRNA (~50 nL/Eizelle) durch Drücken der INJECT-Taste .
    HINWEIS: Das Einspritzvolumen kann über die DIP-Schalter im Injektorregler eingestellt werden.
  16. Die injizierten Eizellen werden in eine neue Petrischale mit ND96-Lösung (ergänzt mit Pyruvat und Penicillin-Streptomycin) gegeben und 1-3 Tage lang in der Umweltkammer (15-18 °C) aufbewahrt (abhängig von der Geschwindigkeit und dem Niveau der GJ-Proteinexpression). Ersetzen Sie die Lösung täglich, indem Sie die Eizellen in eine neue Petrischale geben.

3. Eizellpaarung

  1. Einige der injizierten Eizellen werden in eine 35-mm-Petrischale mit ND96-Lösung überführt.
  2. Verwenden Sie zwei feine Pinzetten (Table of Materials), um die transparente Vitellinmembran, die die Eizelle umhüllt, vorsichtig abzuziehen.
    HINWEIS: Es kann notwendig sein, die Pinzettenspitzen vor dem ersten Gebrauch und von Zeit zu Zeit mit einem Stück feinem (600 Grit) Schleifpapier zu schärfen.
  3. Legen Sie 2 Eizellen pro Vertiefung in eine Eizellpaarungskammer (Abbildung 1D), die ND96-Lösung (ergänzt mit Pyruvat und Penicillin-Streptomycin) enthält.
    HINWEIS: Die Eizellpaarungskammer besteht darin, ein kleines Stück eines Microwell Minitrays (Table of Materials) mit einem schnell aushärtenden Epoxidkleber auf den Boden einer 35-mm-Petrischale (Table of Materials) zu kleben. Das Minitray wird mit einem Heißdrahtschneider (Table of Materials) in kleine Stücke geschnitten. Die Verwendung des Minitrays zur Eizellpaarung wurde ursprünglich von anderen24 beschrieben. Obwohl sich ein GJ-Protein in Abhängigkeit von den Ladungseigenschaften von Aminosäureresten in seinen zytosolischen Domänen ungleichmäßig in der Eizellmembran verteilen kann25, scheint eine zufällige Paarung (ohne Unterscheidung zwischen dem tierischen und dem pflanzlichen Pol der Eizelle) im Allgemeinen ausreichend zu sein.
  4. Bewahren Sie die Petrischale mit den gepaarten Eizellen bei RT auf dem Isolationstisch auf, um für elektrophysiologische Aufzeichnungen verwendet zu werden.
    HINWEIS: Die Kopplungsdauer kann von einigen Stunden bis zu einem Tag variieren. Eine bequeme Übung ist es, Eizellen am späten Nachmittag zu paaren und am nächsten Tag von ihnen aufzunehmen.

4. Vorbereitung des Erfassungssystems

  1. Konfigurieren Sie zwei OC-725C-Eizellklemmverstärker (Materialverzeichnis) auf den Hochstrommessmodus, indem Sie einen internen DIP-Schalter einstellen (Abbildung 1B).
  2. Erden Sie die Verstärker, indem Sie zuerst die Ground Circuit-Buchsen auf den Rückwänden und dann den Faraday-Käfig und das Faserlicht, das zur Beleuchtung der Aufnahmekammer verwendet wird, anschließen.
  3. Schließen Sie die Verstärker an einen Analog-Digital-Signalwandler (Table of Materials) an und konfigurieren Sie sie im Clampex-Modul der pClamp-Software (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Verstärkerherstellers.
  4. Testen Sie das Erfassungssystem mit der mit dem Verstärker gelieferten Modellzelle.
    1. Schließen Sie die V DIFF-Sonde und die Stromkabel (I) an die Modellzelle an, verbinden Sie die roten und schwarzen Buchsen in der VDIFF-Sonde mit dem mitgelieferten Jumper, schließen Sie eines der beiden Beine des Jumpers an einen der beiden Stifte in der Modellzelle an und verbinden Sie den Erdungsdraht in der Modellzelle mit dem Kabel von der GROUND CIRCUIT-Buchse des Verstärkers (Abbildung 1E).
    2. Nullen Sie die Spannungselektroden- (Vm) und Badelektrodenanzeiger (Im) des Verstärkers, indem Sie die Drehregler Vm OFFSET bzw. Ve OFFSET drehen, schalten Sie die Klemme von AUS auf Schnell oder LANGSAM und drehen Sie das GAIN-Zifferblatt im Uhrzeigersinn auf ein Niveau, das eine ordnungsgemäße Spannungsklemme ermöglicht (Abbildung 1A). Der D.C. GAIN-Schalter kann sich entweder in der Position OUT oder IN befinden.
    3. Führen Sie ein einfaches Erfassungsprotokoll aus, das einige Spannungsschritte enthält, um zu bestätigen, dass sich die im Vm-Meter angezeigte Spannung gemäß dem Erfassungsprotokoll ändert und dass Spannungs- und Stromspuren in Clampex ordnungsgemäß angezeigt werden.
      HINWEIS: Mit diesem Ansatz kann jedes Mal nur ein Verstärker getestet werden.

5. Aufzeichnung Ij zwischen gepaarten Eizellen

  1. Erstellen Sie Erfassungsprotokolle für die Aufzeichnung Ij in der pClamp-Software.
    HINWEIS: Erstellen Sie zwei Erfassungsprotokolle. In einem von ihnen wird Verstärker # 1 verwendet, um eine Reihe von Membranspannungsschritten (V m) zu erzeugen (z. B. -150 bis +90 mV in 10-mV-Intervallen), während Verstärker # 2 verwendet wird, um eine konstante V m (z. B. -30 mV) aufrechtzuerhalten. Im anderen Protokoll wird Verstärker #2 verwendet, um die V m-Schritte zu erzeugen, während Verstärker # 1 verwendet wird, um die konstante V m aufrechtzuerhalten. Die positiven und negativen Vm-Schritte sollten abwechselnd angewendet werden (z. B. -150, +90, -140, +80 ......), die in Clampex mit der Benutzerlistenfunktion im Erfassungsprotokoll programmiert werden können.
  2. Einrichten der Aufnahmebühne
    1. Werfen Sie eine Petrischale mit gepaarten Eizellen in den Petrischalenetuiß in der Aufnahmeplattform (Abbildung 2A)
    2. Wählen Sie ein Paar Eizellen aus und drehen Sie die Petrischale bei Bedarf so, dass sich die beiden Eizellen in linker und rechter Richtung befinden, und verriegeln Sie die Bühne durch ihre magnetische Basis.
    3. Befestigen Sie die Magnetständer, die die Strom- und Spannungssonden an geeigneten Stellen auf dem Isolationstisch halten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich die Strom- und Spannungssonden eines Verstärkers auf der linken Seite befinden, während sich die des anderen Verstärkers auf der rechten Seite befinden und dass sich die Spannungssonde auf jeder Seite vor der Stromsonde befindet (Abbildung 2B, C).
  3. Einrichten der Referenzelektrode
    1. Platzieren Sie eine Referenzelektrode (Materialtabelle) in der Nähe des Randes der Petrischale in Richtung der Benutzerseite (Abbildung 2B, C).
    2. Schließen Sie die Referenzelektrode nur in einer der beiden VDIFF-Sonden an die schwarze Buchse (Circuit Ground) an.
  4. Einrichten der VDIFF-Elektroden
    1. Ziehen Sie ein Paar Glasmikropipetten, brechen Sie mit dem Diamantritzer (Table of Materials) ein wenig von der Spitze ab und glätten Sie die Spitzenkante durch Feuerpolieren.
      HINWEIS: Der Spitzenwiderstand sollte weniger als 150 kΩ betragen (gemessen mit ND96 in der Pipette). Typischerweise werden Mikropipetten mit einem Spitzenwiderstand von 20-150 kΩ verwendet.
    2. Halten Sie die Mikropipette über die Flamme eines Alkoholbrenners, um sie in einem glatten Winkel (~ 130 °) in einer Position ~ 1 cm von der Spitze entfernt zu biegen.
      HINWEIS: Hergestellte Mikropipetten sind wiederverwendbar. Spülen Sie sie nach jedem Gebrauch mit Wasser ab.
    3. Füllen Sie die Glaspipette vollständig mit ND96-Lösung ab, setzen Sie sie in einen vorgefüllten (mit ND96) Mikroelektrodenhalter ein (Tabelle der Materialien, Abbildung 2D) und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im System vorhanden sind.
    4. Setzen Sie den 2-mm-Stift des Mikroelektrodenhalters in die 2-mm-Buchse eines V DIFF-Elektrodenverbindungsdrahtes ein (Abbildung 2D).
    5. Klemmen Sie die 2-mm-Buchse an eine magnetische Klemme (Abbildung 2D), und richten Sie die Spitze der VDIFF-Elektrode auf eine der beiden Eizellen aus (Abbildung 2E).
      HINWEIS: Stellen Sie die Position und den Winkel der Klemme so ein, dass die Spitze der Elektrode sehr nahe an der Eizelle liegt
    6. Stecken Sie den 1-mm-Stift des V DIFF-Elektrodenverbindungsdrahtes in die rote Buchse (V DIFF-Eingang) in der VDIFF-Sonde auf der gleichen Seite.
    7. Bereiten Sie eine VDIFF-Elektrode für die andere Eizelle und den Verstärker nach ähnlichen Verfahren vor und schließen Sie sie an.
      HINWEIS: Eine Nahaufnahme eines Eizellenpaares und aller Elektroden ist in Abbildung 2E dargestellt.
  5. Strom- und Spannungselektroden einrichten
    1. Bereiten Sie Spannungs- und Stromelektroden aus Glaskapillaren vor, füllen Sie sie (etwa zur Hälfte) mit einer KCl-Lösung (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 mit KOH) und setzen Sie sie in die mit den Verstärkern gelieferten Elektrodenhalter ein.
      HINWEIS: Die Elektroden sollten einen Widerstand von ~1 MΩ haben. Geeignete Elektroden können aus einer Art von dünnwandigen Glaskapillaren (Materialverzeichnis) unter Verwendung eines bestimmten Satzes von Zugparametern erhalten werden (Tabelle 1). Solche Spitzen können leicht in die Eizellmembran eindringen, ohne dass entweder die Vm- oder die Ve BUZZ-Taste am Verstärker gedrückt werden muss.
    2. Senken Sie die Elektroden in die Badlösung, senken Sie die Vm- und IM-Messgeräte auf Null, indem Sie die Zifferblätter Vm OFFSET und Ve OFFSET drehen, und überprüfen Sie den Elektrodenwiderstand, indem Sie den Vm-Elektrodentest und den Ve-Elektrodentest drücken.
    3. Führen Sie die Strom- und Spannungselektroden in die Eizellen ein und beobachten Sie negative Membranpotentiale (typischerweise -20 bis -50 mV).
      HINWEIS: Die Vm- und Im-Messgeräte desselben Verstärkers sollten zwei identische oder sehr ähnliche Werte anzeigen.
  6. Datenerfassung
    1. Vergewissern Sie sich im Klemmabschnitt des Verstärkers, dass sich D.C. GAIN in der IN-Position befindet, drehen Sie den GAIN-Regler im Uhrzeigersinn auf ein Niveau, das eine ordnungsgemäße Spannungsklemme ermöglicht (typischerweise ein Drittel bis zur Hälfte des gesamten Bereichs), und drehen Sie den Klemmschalter von AUS auf SCHNELL.
      HINWEIS: Beim Einschalten der Klemme zeigen die Vm- und IM-Messgeräte die Haltespannung bzw. den Haltestrom an. Obwohl der Haltungsstrom je nach Eizellbedingungen etwas variieren kann, ist er im Allgemeinen klein und stabil in der Holding Vm (z. B. -30 mV).
    2. Führen Sie ein Erfassungsprotokoll aus.
      HINWEIS: Vier Spuren werden auf dem Bildschirm angezeigt. Die Spannungs- und Stromspuren eines Verstärkers zeigen die Vm-Schritte an, die an Eizelle #1 angelegt werden, und den Strom, der zur Erzeugung der Vm-Schritte benötigt wird, während die des anderen Verstärkers die konstante Vm (-30 mV) der Eizelle #2 und den Strom anzeigen, der zur Aufrechterhaltung dieser konstanten Vm eingespeist wird. Der Strom, der in die Eizelle #2 injiziert wird, stellt das Ij dar.

6. Datenanalyse

  1. Analyse mit Clampfit.
    1. Öffnen Sie eine aufgezeichnete abf-Datei im Clampfit-Modul von pClamp.
    2. Verwenden Sie die Cursortasten 1 und 2, um ein Segment der Baseline vor den Ij-Spuren einzuschließen.
    3. Klicken Sie auf das Symbol Baseline anpassen, um ein Baseline-Fenster aufzurufen. Wählen Sie Mittelwert von Cursorn subtrahieren 1..2 für Methode und vergewissern Sie sich, dass Alle sichtbaren Signale und Alle sichtbaren Spuren für die Ablaufverfolgungsauswahl ausgewählt sind.
    4. Wenn Sie auf OK klicken, wird das Fenster Baseline geschlossen, die Baselines aller Strom- und Spannungsspuren laufen auf der Nullebene zusammen. Beachten Sie, dass sich die Spannungsschritte auf neue Werte ändern, die der ursprünglichen Spannung abzüglich der Haltespannung entsprechen (z. B. -30 mV).
    5. Um die Beziehung zwischen I j und V j mit den stationären I j darzustellen, schließen Sie ein gewünschtes Segment der I j-Spuren, die den stationären Zustand I j darstellen, mit den Cursorn 1 und 2 ein und platzieren Sie den Cursor 3 an einer beliebigen Stelle innerhalb des Zeitfensters der Spannungsschritte.
    6. Gehen Sie zu Analysieren / Schnelldiagramm / I-V, um ein I-V-Fenster zu öffnen.
    7. Wählen Sie unter X-Achse (Spannung) Cursor 3 aus Signal, geben Sie das Spannungsschrittsignal (z. B. Spannung 1) im Dropdown-Menü an und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Umkehren.
      HINWEIS: Das Kontrollkästchen Invertieren ist aktiviert, um das V m in Werte umzuwandeln, die Vj entsprechen, das als V m der Eizelle #2-V m der Eizelle #1 definiert ist.
    8. Wählen Sie unter Y-Achse (Strom) die Quelle des Ij-Signals (z. B. Strom 0) aus dem Dropdown-Menü neben Signal aus, definieren Sie Region als Cursor 1..2 aus dem Dropdown-Menü und wählen Sie Mittelwert.
      HINWEIS: Um die Beziehungen zwischen Peak I j und V j darzustellen, sollten die Cursor 1 und 2 das Segment der I j-Spuren einschließen, das den Peak I j in Schritt 6.1.5 enthält, und in Schritt 6.1.8 Peak (anstelle von Mean) auswählen.
    9. Wählen Sie unter der Option Ziel entweder Ersetzen oder Anfügen aus.
    10. Wenn Sie im I-V-Fenster auf OK klicken, wird auf dem Bildschirm eine Beziehung zwischen I j und V j angezeigt, und die entsprechenden I j- und V j-Werte können durch Klicken auf Fenster/Ergebnis gefunden werden.
  2. Plotten und passen Sie die G j-Vj-Beziehung in OriginPro (Table of Materials) an
    1. Kopieren Sie die beiden Spalten mit den Werten V j und Ij aus dem Ergebnisfenster von Clampfit (Schritt 6.1.10) in eine neue Arbeitsmappe in Origin. Stellen Sie sicher, dass sich die Werte V j und Ij unter den Spalten X bzw. Y befinden.
    2. Fügen Sie vier neue Spalten in der Arbeitsmappe hinzu, indem Sie auf Spalte / Neue Spalten hinzufügen klicken.
    3. Benennen Sie die erste neue Spalte als G j, füllen Sie sie, indem Sie die Gleichung "Spalte I j/column V j * 1.000" im Fenster Spaltenwerte festlegen eingeben, und erstellen Sie ein Streudiagramm der G j-V j-Beziehung.
      HINWEIS: Die Multiplikation mit 1.000 (optional) soll die Unannehmlichkeit vermeiden, mit sehr kleinen Zahlen in nachfolgenden Schritten umzugehen.
    4. Passen Sie die Gj-Datenpunkte über die negativen und positiven Vj-Bereiche unabhängig voneinander an die Boltzmann-Funktion an. Berechnen Sie G j bei V j = 0 mV, indem Sie die G jmax-, G jmin-, A- und V 0-Werte aus der Anpassung in die Boltzmann-Gleichung eingeben, was in einer Tabelle erfolgen kann. Das so erhaltene G j wird im nächsten Schritt als Gjmax verwendet.
      HINWEIS: Die Gleichung für die Boltzmann-Funktion lautet: G j = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(V j-V 0)]} + G jmin, wobei V 0 das V j ist, bei dem der Leitwert halb maximal ist, G jmax der maximale Leitwert ist, Gjmin das V j-unempfindliche ist Restleitwert23. Um die Anpassung auszuführen, fügen Sie zuerst die Boltzmann-Gleichung als neue Anpassungsfunktion in OriginPro hinzu und wählen Sie dann diese Funktion für die Anpassung aus. Geben Sie ungefähre Ausgangswerte für Gjmax, Gjmin, V0 und A ein, bevor Sie die Anpassungsfunktion ausführen. Stellen Sie sicher, dass der Gjmax-Parameter für diese Formstück nicht festgelegt ist.
    5. Benennen Sie die zweite und dritte neue Spalte als nGj-L und nGj-R ("n" für "normalisiert") und füllen Sie sie, indem Sie die G j-Spalte durch die G jmax-Werte dividieren, die von der linken bzw. rechten G j- Vj-Kurve abgeleitet werden (Schritt 6.2.4).
    6. Nennen Sie die vierte neue Spalte nGj-LR, und füllen Sie sie, indem Sie Werte aus den negativen und positiven Vj-Bereichen der nGj-L- bzw. nGj-R-Spalten kopieren.
    7. Erstellen Sie ein Streudiagramm für nGj-LR über V j, und passen Sie die Datenpunkte über den negativen und positiven Vj-Bereichen unabhängig voneinander an die Boltzmann-Funktion an. Stellen Sie sicher, dass der Gjmax-Parameter für die Formstück auf 1,0 festgelegt ist.
    8. Führen Sie Aufzeichnungen über die Formstückergebnisse (z. B. den angepassten Graphen und die Gjmin-, V 0- undA-Werte).

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Ergebnisse

UNC-7 und UNC-9 sind Innexine von C. elegans. Während UNC-9 nur eine Isoform hat, hat UNC-7 mehrere Isoformen, die sich hauptsächlich in der Länge und Aminosäuresequenz ihrer Aminoterminals 7,8 unterscheiden. Diese Innexine können homotypische sowie heterotypische (von UNC-7 und UNC-9) GJs bilden, wenn sie in Xenopus-Eizellen 7,8 exprimiert werden. Repräsentative I-j-Spuren

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Diskussion

Eine Systemoptimierung scheint für Dual-Eizellen-Spannungs-Klemm-Experimente notwendig zu sein. Ohne sie können Aufnahmen sehr instabil sein, und die Verstärker müssen möglicherweise eine übermäßige Menge an Strom injizieren, um die Zielvm zu erreichen, was zu Eizellschäden und Aufzeichnungsfehlern führt. Mehrere Faktoren sind entscheidend, um stabile duale Eizellenaufzeichnungen mit der High-Side-Current-Messmethode zu erhalten. Erstens müssen die Strom- und Spannungselektroden einen angemessenen Widerstand (~ ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Wir danken Haiying Zhan, Qian Ge für ihre Beteiligung an der Anfangsphase der technischen Entwicklung, Kiranmayi Vedantham für die Hilfe bei den Figuren und Dr. Camillo Peracchia für die Beratung zur Eizellpaarungskammer.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agar-Brücken-MagnethalterALA Scientific InstrumentsMPSALT-HStabiler als der Narishige Röhrenklemmer aufgrund seines größeren Magnetfußes, erfordert jedoch eine Modifikation, um eine 2-mm-Buchse aufzunehmen.
Auto-Nanoliter-InjektorDrummond Scientific Company, Broomall, PA, USANanoject IIAutomatisierter Nanoliter-Injektor
Kollagenase, Typ IIGibco-USA, Langley, OK, USA17101-015
Diamond ScriberElektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA62108-ST
DifferenzspannungssondeWarner Instruments, Hamden, CT, USA7255DI
Analog-Digital-SignalwandlerMolecular Devices, San Jose, CA, USADigidata 1440A
Dumont #5 PinzetteWorld Precision Instruments, Sarasota, FL, USA500341
GlaskapillarenDrummond Scientific Company, Broomall, PA, USA3-000-203-G/X
HeißdrahtschneiderAmazon.comProxxon 37080Eine Alternative ist der Hercules 8500 DHWT, der über ein Fußpedal verfügt.
Hyaluronidase, Typ I-SMilliporeSigma, Burlington, MA, USAH3506
Magnetische Halterung BasisKanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USAMB-L-45
Mikroelektrode BevelerSutter Instrument, Novato, CA, USABV-10
MikroelektrodenhalterWorld Precision Instruments, , Sarasota, FL, USAMEH1S15
MikropipettenabzieherSutter Instrument, , Novato, CA, USAP-97
mMESSAGE mMACHINETM T3Invitrogen-FisherScientificAM1348
Nunc MicroWell MiniTrayNalge Nunc International, Rochester, NY, USA438733Microwell Minitray
Nylon MeshComponent Supply Company, Sparta, TN, USAU-CMN-1000
EizellklemmenverstärkerWarner Instrumente, , Hamden, CT, USAOC-725C
OriginProOriginLab Corporation, Northampton, MA, USA2020b
pClampMolecular Devices, , San Jose, CA, USAVersion 10
ReferenzelektrodeWorld Precision Instruments, Sarasota, FL, USADRIREF-2SHSpezifikationen: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (Ribonuklease-Inhibitor)Invitrogen-FisherScientific10777-019
Seidennaht 5-0Covidien, North Haven, CT, USAVS890
Spektralphotometer NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Dünnwandige GlaskapallariesWorld Precision Instruments,Sarasota, FL, USATW150F-4
RohrklemmeNarishige International USA, Amityville, NY, USACAT-1Sofort einsatzbereit, aber seine Position kann sich aufgrund des kleinen Magnetfußes verschieben.
Xenopus laevisXenopus Express, Brooksville, FL, USAIMP-XL-FM

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Dual-Voltage-ClampConnexin-ExpressionInnexin-Expressionjunktionale LeitfähigkeitDifferenzvoltagelektrodeOozyten-PaarungGlaselektrodenMembranpotenzial
Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen
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