Aufzeichnung des Gap-Junction-Stroms von Xenopus-Eizellen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Gap-Junction-Proteine in Xenopus-Eizellen zu exprimieren und den Sperrschichtstrom zwischen zwei apponierten Eizellen mit einem kommerziellen Verstärker aufzuzeichnen, der für Dual-Eizellen-Spannungs-Clamp-Aufnahmen in einem hohen Seitenstrom-Messmodus entwickelt wurde.

Zusammenfassung

Die heterologe Expression von Connexinen und Innexinen in Xenopus-Eizellen ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Untersuchung der biophysikalischen Eigenschaften von Gap Junctions (GJs). Dieser Ansatz ist jedoch technisch anspruchsvoll, da er eine Differenzspannungsklemme von zwei gegenüberliegenden Eizellen erfordert, die eine gemeinsame Basis haben. Obwohl es einer kleinen Anzahl von Labors gelungen ist, diese Technik durchzuführen, haben im Wesentlichen alle entweder hausgemachte Verstärker oder kommerzielle Verstärker verwendet, die für Einzeleizellaufnahmen entwickelt wurden. Für andere Labore ist es oft eine Herausforderung, diese Technik zu implementieren. Obwohl ein High-Side-Strom-Messmodus in einen kommerziellen Verstärker für Dual-Oozyten-Spannungs-Clamp-Aufnahmen integriert wurde, gab es bis zu unserer jüngsten Studie keinen Bericht über seine Anwendung. Wir haben den Ansatz der Hochstrommessung durch die Einführung mehrerer technischer Modifikationen praktischer und bequemer gemacht, darunter die Konstruktion einer magnetbasierten Aufzeichnungsplattform, die eine präzise Platzierung von Eizellen und verschiedenen Elektroden ermöglicht, die Verwendung der Badlösung als Leiter in spannungsdifferenzierten Elektroden, die Verwendung einer kommerziellen KCl-Elektrode mit geringer Leckage als Referenzelektrode, Herstellung von Strom- und Spannungselektroden aus dünnwandigen Glaskapillaren und Positionierung aller Elektroden mit magnetisch basierten Geräten. Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht bequeme und robuste Aufnahmen von Sperrschichtströmen (I_j) zwischen zwei gegenüberliegenden Xenopus-Eizellen .

Einleitung

GJs sind interzelluläre Kanäle, die den Stromfluss und den Austausch kleiner zytosolischer Moleküle zwischen benachbarten Zellen ermöglichen können. Sie kommen in vielen Zelltypen vor und erfüllen vielfältige physiologische Funktionen. GJs werden bei Wirbeltieren durch Connexine gebildet, bei Wirbellosen durch Innexine. Jedes GJ besteht aus zwei nebeneinander gestellten Hemikanälen mit entweder 6 oder 8 Untereinheiten pro Hemikanal, je nachdem, ob es sich um Connexine oder Innexine ^1,2,3 handelt. Menschen haben 21 Connexin-Gene⁴, während die häufig ver....

Protokoll

Die Operationen werden nach einem Protokoll durchgeführt, das vom institutionellen Tierpflegeausschuss der University of Connecticut School of Medicine genehmigt wurde.

1. Froschchirurgie und Vorbereitung von defollikuierten Eizellen

1. Betäuben Sie einen erwachsenen weiblichen afrikanischen Krallenfrosch (Xenopus laevis) (Materialtabelle), indem Sie in eine kühle (mit Eis) Tricainlösung (~ 300 mg / L) eintauchen.
2. Warten Sie (~ 15 min), bis der Frosch wenig oder keine Reaktion auf das Zusammendrücken seiner Schwimmhäute zeigt. Legen Sie den Frosch mit dem Bauch nach oben auf einen ....

Ergebnisse

UNC-7 und UNC-9 sind Innexine von C. elegans. Während UNC-9 nur eine Isoform hat, hat UNC-7 mehrere Isoformen, die sich hauptsächlich in der Länge und Aminosäuresequenz ihrer Aminoterminals ^7,8 unterscheiden. Diese Innexine können homotypische sowie heterotypische (von UNC-7 und UNC-9) GJs bilden, wenn sie in Xenopus-Eizellen ^7,8 exprimiert werden. Repräsentative _I-j-Spuren

Diskussion

Eine Systemoptimierung scheint für Dual-Eizellen-Spannungs-Klemm-Experimente notwendig zu sein. Ohne sie können Aufnahmen sehr instabil sein, und die Verstärker müssen möglicherweise eine übermäßige Menge an Strom injizieren, um die Zielvm zu erreichen, was zu Eizellschäden und Aufzeichnungsfehlern führt. Mehrere Faktoren sind entscheidend, um stabile duale Eizellenaufzeichnungen mit der High-Side-Current-Messmethode zu erhalten. Erstens müssen die Strom- und Spannungselektroden einen angemessenen Widerstand (~ .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agar-Brücken-Magnethalter	ALA Scientific Instruments	MPSALT-H	Stabiler als der Narishige Röhrenklemmer aufgrund seines größeren Magnetfußes, erfordert jedoch eine Modifikation, um eine 2-mm-Buchse aufzunehmen.
Auto-Nanoliter-Injektor	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	Nanoject II	Automatisierter Nanoliter-Injektor
Kollagenase, Typ II	Gibco-USA, Langley, OK, USA	17101-015
Diamond Scriber	Elektronenmikroskopie Sciences, Hatfield, PA, USA	62108-ST
Differenzspannungssonde	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	7255DI
Analog-Digital-Signalwandler	Molecular Devices, San Jose, CA, USA	Digidata 1440A
Dumont #5 Pinzette	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	500341
Glaskapillaren	Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA	3-000-203-G/X
Heißdrahtschneider	Amazon.com	Proxxon 37080	Eine Alternative ist der Hercules 8500 DHWT, der über ein Fußpedal verfügt.
Hyaluronidase, Typ I-S	MilliporeSigma, Burlington, MA, USA	H3506
Magnetische Halterung Basis	Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA	MB-L-45
Mikroelektrode Beveler	Sutter Instrument, Novato, CA, USA	BV-10
Mikroelektrodenhalter	World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA	MEH1S15
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument, , Novato, CA, USA	P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3	Invitrogen-FisherScientific	AM1348
Nunc MicroWell MiniTray	Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA	438733	Microwell Minitray
Nylon Mesh	Component Supply Company, Sparta, TN, USA	U-CMN-1000
Eizellklemmenverstärker	Warner Instrumente, , Hamden, CT, USA	OC-725C
OriginPro	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2020b
pClamp	Molecular Devices, , San Jose, CA, USA	Version 10
Referenzelektrode	World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA	DRIREF-2SH	Spezifikationen: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (Ribonuklease-Inhibitor)	Invitrogen-FisherScientific	10777-019
Seidennaht 5-0	Covidien, North Haven, CT, USA	VS890
Spektralphotometer NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
Dünnwandige Glaskapallaries	World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA	TW150F-4
Rohrklemme	Narishige International USA, Amityville, NY, USA	CAT-1	Sofort einsatzbereit, aber seine Position kann sich aufgrund des kleinen Magnetfußes verschieben.
Xenopus laevis	Xenopus Express, Brooksville, FL, USA	IMP-XL-FM