Method Article

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

DOI:

10.3791/63377

⸱

February 18th, 2022

 ,  , 
1Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 2Department of Genetics, Harvard Medical School

In This Article

Summary

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Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Abstract

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Mikrotubuli sind Polymere von αβ-Tubulin-Heterodimeren, die sich in Zellen zu unterschiedlichen Strukturen organisieren. Mikrotubuli-basierte Architekturen und Netzwerke enthalten häufig Teilmengen von Mikrotubuli-Arrays, die sich in ihren dynamischen Eigenschaften unterscheiden. Zum Beispiel koexistieren in sich teilenden Zellen stabile Bündel vernetzter Mikrotubuli in unmittelbarer Nähe zu dynamischen, nicht vernetzten Mikrotubuli. TIRF-mikroskopiebasierte In-vitro-Rekonstitutionsstudien ermöglichen die gleichzeitige Visualisierung der Dynamik dieser verschiedenen Mikrotubuli-Arrays. Bei diesem Assay wird eine Bildgebungskammer mit oberflächenimmobilisierten Mikrotubuli zusammengesetzt, die entweder als einzelne Filamente vorliegen oder in vernetzten Bündeln organisiert sind. Die Einführung von Tubulin, Nukleotiden und Proteinregulatoren ermöglicht die direkte Visualisierung von assoziierten Proteinen und von dynamischen Eigenschaften einzelner und vernetzter Mikrotubuli. Darüber hinaus können Änderungen, die auftreten, wenn sich dynamische einzelne Mikrotubuli zu Bündeln organisieren, in Echtzeit überwacht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht eine systematische Bewertung der Aktivität und Lokalisation einzelner Proteine sowie synergistischer Effekte von Proteinregulatoren auf zwei verschiedene Mikrotubuli-Untergruppen unter identischen experimentellen Bedingungen und liefert dadurch mechanistische Erkenntnisse, die mit anderen Methoden nicht zugänglich sind.

Introduction

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Mikrotubuli sind Biopolymere, die strukturelle Gerüste bilden, die für mehrere zelluläre Prozesse unerlässlich sind, vom intrazellulären Transport und der Organellenpositionierung bis hin zur Zellteilung und -dehnung. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, sind einzelne Mikrotubuli in mikrometergroße Arrays organisiert, wie z.B. mitotische Spindeln, Ziliaraxoneme, neuronale Bündel, Interphasenarrays und pflanzliche kortikale Arrays. Ein allgegenwärtiges architektonisches Motiv, das in diesen Strukturen zu finden ist, ist ein Bündel von Mikrotubuli, die entlang ihrer Länge miteinander verbunden sind1. Ein faszinierendes Merkmal mehrerer M....

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Protocol

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1. Reagenzien vorbereiten

  1. Bereiten Sie Puffer und Reagenzien gemäß Tabelle 1 und Tabelle 2 vor. Bewahren Sie während des Experiments alle Lösungen auf Eis auf, sofern nicht anders angegeben.
LösungKomponentenEmpfohlene SpeicherdauerNotizen
5X BRB80400 mM K-ROHRE, 5 mM MgCl2, 5 mM EGTA, pH 6,8 mit KOH, Filter....

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Results

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Das oben beschriebene Experiment wurde unter Verwendung von 647 nm fluorophormarkierten biotinylierten Mikrotubuli, 560 nm fluorophormarkierten nicht biotinylierten Mikrotubuli und 560 nm fluorophormarkierten löslichen Tubulinmischungen durchgeführt. Mikrotubuli wurden durch das Vernetzerprotein PRC1 (GFP-markiert) vernetzt. Nachdem oberflächenimmobilisierte Bündel und einzelne Mikrotubuli erzeugt wurden (Schritt 5.11), wurde die Bildgebungskammer auf einem TIRF 100X 1.49 NA Ölobjektiv montiert und in den 560 nm und 647 .......

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Discussion

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Das hier beschriebene Experiment erweitert den Umfang und die Komplexität herkömmlicher Mikrotubuli-Rekonstitutionsassays, die traditionell an einzelnen Mikrotubuli oder an einem Array-Typ durchgeführt werden, erheblich. Der aktuelle Assay bietet eine Methode zur gleichzeitigen Quantifizierung und zum Vergleich der regulatorischen MAP-Aktivität an zwei Populationen, nämlich einzelnen Mikrotubuli und vernetzten Bündeln. Darüber hinaus ermöglicht dieser Assay die Untersuchung von zwei Arten von Bündeln: solchen, die vor de.......

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Disclosures

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Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des NIH (Nr. 1DP2GM126894-01) und durch Mittel der Pew Charitable Trusts und der Smith Family Foundation an R.S. unterstützt. Die Autoren danken Dr. Shuo Jiang für seinen Beitrag zur Entwicklung und Optimierung der Protokolle.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox)Sigma Aldrich238813
1,4-Piperazindiethansulfonsäure (PIPES)Sigma AldrichP6757
18x18 mm #1,5 Deckgläser Elektronenmikroskopie63787
2-Mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichM-6250
24x60 mm #1,5 DeckgläserElektronenmikroskopie63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band ChromaTRF89901-NK
AcetonSigma Aldrich320110
Adenosin 5'-triphosphat Dinatriumsalzhydrat (ATP)Sigma AldrichA7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-bindendes Protein (molekulare Sonden®)Thermo Fischer ScientificA2666
Badbeschallungsgerät: Branson 2800 ReinigerBransonCoulter
Polycarbonat Dickwandrohre, 11 x 34 mmBeckman-Schar
Beckman Coulter Polycarbonat Dickwandrohre, 8 x 34 mmBeckman-Coulter 
Biotin-PEG-SVA, MW 5.000Laysan Bio#Biotin-PEG-SVA-5000
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma Aldrich2905
CatalaseSigma AldrichC40
Corning LSE Mini-Mikrozentrifuge, AC100-240VCorning6670
Zarte ArbeitstücherKimtech34120
Dithiothreitol (DTT)GoldBioDTT10
EmissionsfilterChromaET610/75m
Ethanol (200-proof)Decon Labs2705
Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA)Sigma Aldrich3777
GlukoseoxidaseSigma AldrichG2133
GMPCPPJena Bioscience NU-405
Guanosin-5'-triphosphat-Natriumsalzhydrat (GTP)Sigma AldrichG8877
Hellmanex III Reinigungsmittel Sigma AldrichZ805939
Immersionsöl, Typ AFisher Scientific77010
Kappa-KaseinSigma AldrichC0406
LanolinFisher ScientificS25376
LinsenreinigungstuchThorLabsMC-5
Magnesiumchlorid (MgCl2)Sigma AldrichM9272
MethylcelluloseSigma AldrichM0512
Microfuge 16 TischzentrifugeBeckman-Coulter A46474
Objektträger, Diamond White Glas, 25 x 75 mm, 90°; Geschliffene Kanten, WEISS MattedGlobe Scientific1380-50W
mPEG-Succinimidylvalerat, MW 5.000 Laysan Bio#NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tisch-UltrazentrifugeBeckman-Coulter 
ParaffinFisher ScientificP31-500
PELCO Reverse (selbstschließend), FeinpinzetteTed Pella5377-NM
Vaseline, WeißFisher Scientific18-605-050
Plasmareiniger, 115VHarrick PlasmaPDC-001
Kaliumhydroxid (KOH)Sigma Aldrich221473
NatriumbicarbonatSigma AldrichS6014
SaccharoseSigma AldrichS7903
Thermal-Lok 1-Positionen-TrockenwärmebadUSA Scientific2510-1101
Thermal-Lok Block für 1,5 und 2,0 mL RöhrchenUSA Scientific2520-0000
Thermo Scientific & Trade; Durchstechen & Handeln; Anleihenbrecher & Handel; TCEP-Lösung, neutraler pH-Wert; 500mMThermo Fischer ScientificPI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Öl ObjektivNikonCFI Apochromat TIRF 100XC Öl
TIRF MikroskopNikonEclipse Ti
TLA 120.1Rotor Beckman-Coulter 
TLA 120.2 RotorBeckman-Coulter 
Tubulin-Protein (>99 % rein): SchweinehirnZytoskelettT240
Tubulin-Protein (Biotin): SchweinehirnZytoskelettT333P
(fluoreszierend HiLyte 647): SchweinehirnZytoskelettTL670M
Tubulin-Protein (X-Rhodamin): RinderhirnZytoskelettTL620M
VECTABOND® Reagenz, Adhäsionsvektor für GewebeschnitteBiolabsSP-1800-7
VWR® Inkubator in persönlicher Größe, 120 V, 50/60 Hz, 0,6 AVWR97025-630
CPX2800H Beckman 343778343776393315362224357656 Tubulin-Protein

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal mic....

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TIRF MicroscopyMicrotubule DynamicsCrosslinked MicrotubulesSingle MicrotubulesIn Vitro ReconstitutionFluorescence ImagingMicrotubule BundlesProtein RegulatorsSurface ImmobilizationMicrotubule Organization

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