Strukturbasierte Simulation und Probenahme von Transkriptionsfaktor-Proteinbewegungen entlang der DNA vom atomaren Schritt bis zur grobkörnigen Diffusion

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die strukturelle Dynamik der eindimensionalen Diffusion von Protein entlang der DNA unter Verwendung eines pflanzlichen Transkriptionsfaktors WRKY-Domänenprotein als beispielhaftes System aufzudecken. Zu diesem Zweck wurden sowohl atomistische als auch grobkörnige Molekulardynamiksimulationen zusammen mit umfangreichen computergestützten Stichproben implementiert.

Abstract

Das eindimensionale (1-D) Gleiten des Transkriptionsfaktors (TF)-Proteins entlang der DNA ist essentiell für die erleichterte Diffusion der TF, um die Ziel-DNA-Stelle für die genetische Regulation zu lokalisieren. Der Nachweis der Base-Pair-Auflösung (bp) des TF-Gleitens oder -Tretens auf der DNA ist immer noch eine experimentelle Herausforderung. Wir haben kürzlich All-Atom-Molekulardynamik-Simulationen (MD) durchgeführt, die spontanes 1-bp-Stepping eines kleinen WRKY-Domänen-TF-Proteins entlang der DNA erfassen. Basierend auf dem 10 μs WRKY-Schrittpfad, der aus solchen Simulationen gewonnen wurde, zeigt das Protokoll hier, wie umfangreichere Konformationsproben der TF-DNA-Systeme durchgeführt werden können, indem das Markov-Zustandsmodell (MSM) für das 1-bp-Protein-Stepping konstruiert wird, wobei verschiedene Mikro- und Makrozustände für die MSM-Konstruktion getestet wurden. Um die prozessive 1-D-Diffusionssuche des TF-Proteins zusammen mit DNA mit struktureller Basis zu untersuchen, zeigt das Protokoll außerdem, wie grobkörnige (CG) MD-Simulationen durchgeführt werden können, um die langfristige Skalendynamik des Systems zu untersuchen. Solche CG-Modellierungen und -Simulationen sind besonders nützlich, um die elektrostatischen Auswirkungen der Protein-DNA auf die prozessiven Diffusionsbewegungen des TF-Proteins über Dutzende von Mikrosekunden aufzudecken, im Vergleich zu Submikrosekunden bis Mikrosekunden Proteinschrittbewegungen, die aus den Allatomsimulationen aufgedeckt wurden.

Introduction

Transkriptionsfaktoren (TF) suchen nach der Ziel-DNA, um die Gentranskription und die damit verbundenen Aktivitäten zu binden und zu regulieren¹. Abgesehen von der dreidimensionalen (3D) Diffusion wurde vorgeschlagen, dass die erleichterte Diffusion von TF für die Ziel-DNA-Suche unerlässlich ist, bei der die Proteine auch entlang eindimensionaler (1D) DNA gleiten oder hüpfen oder mit intersegmentalem Transfer auf die DNA^{springen können} 2,3,4,5,6,7.

Protocol

1. Aufbau des Markov-Zustandsmodells (MSM) aus atomaren MD-Simulationen

1. Spontaner Proteinschrittweg und anfängliche Struktursammlung
   1. Verwenden Sie eine zuvor erhaltene 10-μs-Allatom-MD-Trajektorie^8, um 10000 Frames gleichmäßig aus einem "vorwärts" 1-bp-Schrittpfad (d. h. einem Frame für jede Nanosekunde) zu extrahieren. Die Gesamtzahl der Frames muss ausreichend groß sein, um alle repräsentativen Konformationen einzubeziehen.
   2. Bereiten Sie den Übergangspfad mit 10000 Frames in VMD vor, indem Sie auf Datei > Klicken Sie auf Datei Speichern Sie Koordinaten, geben Sie Protein oder Nukle....

Results

Rotationsgekoppeltes Gleiten oder 1 bp Treten von WRKY aus der MSM-Konstruktion
Alle Proteinkonformationen auf der DNA werden auf die Längsbewegung X und den Rotationswinkel des Proteins COM entlang der DNA abgebildet (siehe Abbildung 3A). Die lineare Kopplung dieser beiden Grade zeigt ein rotationsgekoppeltes Stepping des WRKY-Domänenproteins auf der DNA an. Die Konformationen können im MSM weiter in 3 Makrozustände (S1, S2 und S3) gruppiert werden. Das Vorwärtsstepping .......

Discussion

Diese Arbeit befasst sich mit der Durchführung strukturbasierter Computersimulationen und Probenahmen, um einen Transkriptionsfaktor oder ein TF-Protein aufzudecken, das sich entlang der DNA bewegt, nicht nur im atomaren Detail des Steppens, sondern auch in der prozessiven Diffusion, die für die erleichterte Diffusion von TF in der DNA-Zielsuche unerlässlich ist. Dazu wurde zunächst das Markov-Zustandsmodell oder MSM eines kleinen TF-Domänenproteins WRKY konstruiert, das für 1-bp entlang homogener Poly-A-DNA schritt, so .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CafeMol		Kyoto	grobkörnige (CG) Simulationen
GROMACS	Universität Groningen Königliche Technische Hochschule Uppsala		Software für Molekulardynamik-Simulationen
Matlab	MathWorks		Numerische Berechnungssoftware
MSMbuilder	Stanford Universität		Build MSM
VMD	UNIVERSITÄT VON ILLINOIS IN URBANA-CHAMPAIGN		Programm zur molekularen Visualisierung