Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

Brian M. Burkel; David R. Inman; María Virumbrales-Muñoz; Erica J. Hoffmann; Suzanne M. Ponik

doi:10.3791/63413

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Methodenartikel

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

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DOI:

10.3791/63413

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24. Mai 2022

Brian M. Burkel¹ , David R. Inman¹ , María Virumbrales-Muñoz¹^,² , Erica J. Hoffmann¹ , Suzanne M. Ponik¹^,³

¹Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, ²Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, ³Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, komplexe und dynamische physiologische Interaktionen zwischen zahlreichen Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb einer lebenden Tumormikroumgebung zu visualisieren, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Mechanismen, die das Fortschreiten von Tumoren regulieren. Während dies durch aktuelle intravitale Bildgebungsverfahren erreicht werden kann, bleibt es aufgrund der heterogenen Natur der Gewebe und der Notwendigkeit eines räumlichen Kontexts innerhalb der experimentellen Beobachtung eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir einen intravitalen Bildgebungs-Workflow entwickelt, der Kollagen-Bildgebung der zweiten harmonischen Generation, endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD (P) H und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) kombiniert, um die Tumormikroumgebung nicht-invasiv in grundlegende Domänen des Tumornestes, des umgebenden Stromas oder ECM und des Gefäßsystems zu unterteilen. Dieses nicht-invasive Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess, der von der Aufnahme von Zeitrafferbildern von Brusttumormodellen bis hin zur Nachbearbeitungsanalyse und Bildsegmentierung reicht. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er metabolische Signaturen nutzt, um die sich dynamisch verändernde Mikroumgebung von lebenden Tumoren ohne die Verwendung exogener fluoreszierender Markierungen zu kontextualisieren, was ihn für PDX-Modelle (Human Patient-derived Xenograft) und den zukünftigen klinischen Einsatz, bei dem extrinsische Fluorophore nicht ohne weiteres anwendbar sind, vorteilhaft macht.

Einleitung

Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tumormikroumgebung von mehreren Zelltypen dynamisch abgelagert und ummodelliert wird, um das Fortschreiten der Krankheit weiter zu erleichtern ^1,2,3. Diese Matrixveränderungen liefern sowohl mechanische als auch biologische Hinweise, die das Zellverhalten verändern und oft zu einem kontinuierlichen Zyklus der Matrixumgestaltung^{führen 4}. Die Untersuchung des dynamischen, wechselseitigen Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix erfolgt häufig mittels dreidimensionaler (....