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Methodenartikel

Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen

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DOI:

10.3791/63413

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24. Mai 2022

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das hier beschriebene intravitale Bildgebungsverfahren nutzt die zweite harmonische Kollagenerzeugung und die endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD(P)H, um eine nicht markierte Tumormikroumgebung nicht-invasiv in Tumor-, Stroma- und Gefäßkompartimente für eine eingehende Analyse von intravitalen 4D-Bildern zu segmentieren.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit, komplexe und dynamische physiologische Interaktionen zwischen zahlreichen Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb einer lebenden Tumormikroumgebung zu visualisieren, ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis von Mechanismen, die das Fortschreiten von Tumoren regulieren. Während dies durch aktuelle intravitale Bildgebungsverfahren erreicht werden kann, bleibt es aufgrund der heterogenen Natur der Gewebe und der Notwendigkeit eines räumlichen Kontexts innerhalb der experimentellen Beobachtung eine Herausforderung. Zu diesem Zweck haben wir einen intravitalen Bildgebungs-Workflow entwickelt, der Kollagen-Bildgebung der zweiten harmonischen Generation, endogene Fluoreszenz aus dem metabolischen Co-Faktor NAD (P) H und Fluoreszenz-Lifetime-Imaging-Mikroskopie (FLIM) kombiniert, um die Tumormikroumgebung nicht-invasiv in grundlegende Domänen des Tumornestes, des umgebenden Stromas oder ECM und des Gefäßsystems zu unterteilen. Dieses nicht-invasive Protokoll beschreibt den schrittweisen Prozess, der von der Aufnahme von Zeitrafferbildern von Brusttumormodellen bis hin zur Nachbearbeitungsanalyse und Bildsegmentierung reicht. Der Hauptvorteil dieses Workflows besteht darin, dass er metabolische Signaturen nutzt, um die sich dynamisch verändernde Mikroumgebung von lebenden Tumoren ohne die Verwendung exogener fluoreszierender Markierungen zu kontextualisieren, was ihn für PDX-Modelle (Human Patient-derived Xenograft) und den zukünftigen klinischen Einsatz, bei dem extrinsische Fluorophore nicht ohne weiteres anwendbar sind, vorteilhaft macht.

Einleitung

Es ist bekannt, dass die extrazelluläre Matrix (ECM) in der Tumormikroumgebung von mehreren Zelltypen dynamisch abgelagert und ummodelliert wird, um das Fortschreiten der Krankheit weiter zu erleichtern 1,2,3. Diese Matrixveränderungen liefern sowohl mechanische als auch biologische Hinweise, die das Zellverhalten verändern und oft zu einem kontinuierlichen Zyklus der Matrixumgestaltungführen 4. Die Untersuchung des dynamischen, wechselseitigen Zusammenspiels zwischen Tumorzellen und der extrazellulären Matrix erfolgt häufig mittels dreidimensionaler (3D) In-vitro-Kultur oder mikrofluidischer Systeme. Während diese Bottom-up-Ansätze Mechanismen der ECM-Remodellierung 5,6,7, der erhöhten Proliferation 8, des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs 9,10,11,12 und der Tumorzellmigration und -invasion7,13,14,15,16 gezeigt haben lag ihr Fokus in erster Linie auf einigen wenigen Zelltypen (z. B. Tumorzellen oder Fibroblasten) innerhalb einer homogenen 3D-Matrix im Vergleich zur Vielfalt und Heterogenität der Interaktionen innerhalb eines physiologischen Gewebes. Neben In-vitro-Systemen kann auch die Ex-vivo-Tumorhistologie einen Einblick in diese Zell-Zell- und Zell-ECM-Interaktionengeben 17. Die Immunhistochemie hat den Vorteil, dass sie mehrere Zelltypen in Bezug auf die räumlich heterogene Zusammensetzung und Architektur der EZM analysieren kann, aber die statischen Endpunkte von fixiertem Gewebe erfassen nicht die dynamische Natur der Wechselwirkungen zwischen Zellen und der Mikroumgebung. Die intravitale Bildgebung hat die Tür geöffnet, um vielfältige und dynamische Interaktionen im physiologischen Kontext der nativen Tumormikroumgebung zu hinterfragen.

Die Fähigkeiten der intravitalen Tumorbildgebung entwickeln sich rasant weiter. Verbesserungen im Design von Bildgebungsfenstern und chirurgischen Techniken zur Implantation der Fenster haben eine langfristige longitudinale Tumorbildgebung an einer Vielzahl von anatomischen Stellen (d.h. Primärtumor, Lymphknoten, metastasierende Stellen18,19,20) ermöglicht. Darüber hinaus wird die Fähigkeit optischer Instrumente, Daten in mehreren Dimensionen (d. h. spektrale, räumliche Fluoreszenzintensität und Lebensdauer) sowie mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit (Videorate) zu visualisieren und zu sammeln, immer zugänglicher. Die verbesserte Technologie bietet die Möglichkeit, schnelle Veränderungen der Zellsignalisierung und der phänotypischen Dynamik in einer physiologischen Umgebung zu untersuchen. Schließlich ermöglichen die Erweiterung optogenetischer Werkzeuge und die breite Palette genetischer Fluoreszenzkonstrukte die Markierung spezifischer Zelltypen, um die Zellmigration in der Tumormikroumgebung oder die Zelllinienverfolgung während der Entwicklung oder des Krankheitsverlaufs zu erfassen21,22. Der Einsatz dieser Werkzeuge in Kombination mit der CRISPR/Cas9-Technologie bietet Forschern die Möglichkeit, zeitnah einzigartige Tiermodelle zu generieren.

Während all diese Fortschritte die intravitale Bildgebung zu einer immer leistungsfähigeren Methode zur Erforschung dynamischer und physiologischer zellulärer Interaktionen machen, besteht immer noch ein wichtiger Bedarf, Strategien zu entwickeln, die diesen biologischen Interaktionen einen räumlichen, zeitlichen und strukturellen Kontext auf Gewebeebene bieten. Derzeit kompensieren viele intravitale Bildgebungsstudien den Mangel an visuellen Landmarken wie Blutgefäßen, indem sie fluoreszierende Farbstoffe in das Gefäßsystem injizieren oder Mausmodelle verwenden, die exogen fluoreszierende Proteine exogen exprimieren, um physikalische Merkmale abzugrenzen. Injizierbare Farbstoffe und Substrate wie fluoreszierendes Dextrans werden breit eingesetzt, um das Gefäßsystem in intravitalen Sammlungen19, 23, 24 erfolgreich zu beschriften. Dieser Ansatz ist jedoch nicht ohne Einschränkungen. Zum einen erfordert es zusätzliche Mausmanipulationen und sein Nutzen beschränkt sich auf kurzfristige Experimente. Für Längsschnittstudien kann fluoreszierendes Dextran problematisch sein, da wir die Ansammlung von Dextran in phagozytären Zellen oder die Diffusion in das umgebende Gewebe im Laufe der Zeit beobachten25. Die exogene fluoreszierende Proteinintegration in das Mausmodell wurde als Alternative zu fluoreszierendem Dextrans vorgestellt, weist jedoch eigene Einschränkungen auf. Die Verfügbarkeit und Vielfalt exogener Fluorophore in Mausmodellen ist immer noch begrenzt und teuer in der Herstellung. Darüber hinaus sind genetische Manipulationen in bestimmten Modellen, wie z. B. PDX-Modellen, nicht wünschenswert oder möglich. Es wurde auch gezeigt, dass das Vorhandensein von fluoreszierenden oder biolumineszierenden Proteinen in Zellen innerhalb der Maus als fremd erkannt wird, und in immunkompetenten Mausmodellen reduziert dies die Menge an Metastasen aufgrund der Reaktion des Immunsystems des Wirts26,27. Schließlich belegen exogene fluoreszierende Proteine oder fluoreszierende Farbstoffe, die für den räumlichen Kontext oder zur Segmentierung nachfolgender Daten verwendet werden, häufig Primbereiche des Lichtspektrums, die sonst zur Untersuchung der physiologischen Wechselwirkungen von Interesse verwendet werden könnten.

Die Verwendung des intrinsischen Signals aus dem ECM oder der endogenen Fluoreszenz von Zellen innerhalb des Gewebes stellt ein potenzielles universelles markierungsfreies Mittel zur Segmentierung intravitaler Daten für eine eingehendere zelluläre und räumliche Analyse dar. Die zweite harmonische Generation (SHG) wird seit langem zur Visualisierung des ECM28 verwendet. Mit der anschließenden Entwicklung wichtiger Werkzeuge zur Charakterisierung der Faserorganisation 29,30,31 ist es möglich, das Zellverhalten relativ zur lokalen ECM-Struktur zu charakterisieren. Darüber hinaus bietet die Autofluoreszenz des endogenen Metaboliten NAD(P)H ein weiteres markierungsfreies Werkzeug, um die Tumormikroumgebung in vivo zu kompartimentieren. NAD(P)H fluoresziert hell in Tumorzellen und kann verwendet werden, um die Grenzen des wachsenden Tumornestes von seinem umgebenden Stroma21,32 zu unterscheiden. Schließlich ist das Gefäßsystem eine wichtige physiologische Struktur in der Tumormikroumgebung und der Ort der wichtigsten zelltypspezifischen Interaktionen33,34,35. Die Anregung von roten Blutkörperchen (RBC) oder Blutplasma wurde verwendet, um das Tumorgefäßsystem sichtbar zu machen, und unter Verwendung der Zwei- oder Drei-Photonen-Anregung (2P; 3P) hat sich die Messung der Blutflussraten als möglicherwiesen 36. Während größere Blutgefäße jedoch leicht durch ihre endogenen Fluoreszenzsignaturen identifizierbar sind, erfordert die Identifizierung subtiler, variabler und weniger fluoreszierender kleiner Blutgefäße mehr Fachwissen. Diese inhärenten Schwierigkeiten behindern eine optimale Bildsegmentierung. Glücklicherweise können diese Quellen der endogenen Fluoreszenz (d. H. Rote Blutkörperchen und Blutplasma) auch durch Fluoreszenzlebensdauerbildgebung37 gemessen werden, die die einzigartigen photophysikalischen Eigenschaften des Gefäßsystems nutzt und eine nützliche Ergänzung der wachsenden intravitalen Toolbox darstellt.

In diesem Protokoll wird ein Workflow zur Segmentierung der vierdimensionalen (4D) intravitalen Bildgebung beschrieben, der explizit intrinsische Signale wie endogene Fluoreszenz und SHG von der Erfassung bis zur Analyse verwendet. Dieses Protokoll ist besonders relevant für Längsschnittstudien durch ein Brustbildgebungsfenster, in dem exogene Fluoreszenz möglicherweise nicht praktikabel oder möglich ist, wie dies bei PDX-Modellen der Fall ist. Die hier beschriebenen Segmentierungsprinzipien sind jedoch weitgehend auf intravitale Anwender anwendbar, die Tumorbiologie, Gewebeentwicklung oder sogar normale Gewebephysiologie untersuchen. Die berichtete Suite von Analyseansätzen wird es den Benutzern ermöglichen, das zelluläre Verhalten zwischen Regionen ausgerichteter oder zufälliger Kollagenfaserkonfigurationen zu unterscheiden, die Anzahl oder das Verhalten von Zellen zu vergleichen, die sich in bestimmten Regionen der Tumormikroumgebung befinden, und das Gefäßsystem der Tumormikroumgebung zuzuordnen, wobei nur markierungsfreie oder intrinsische Signale verwendet werden. Zusammen schaffen diese Methoden einen operativen Rahmen für die Maximierung der Informationstiefe aus der intravitalen 4D-Bildgebung der Brustdrüse bei gleichzeitiger Minimierung des Bedarfs an zusätzlichen exogenen Markierungen.

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Protokoll

Alle beschriebenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Wisconsin-Madison genehmigt. Das Wohlbefinden und die Schmerztherapie in allen Tierversuchen stehen im Vordergrund. Daher werden alle Anstrengungen unternommen, um sicherzustellen, dass sich das Tier bei jedem Schritt des Eingriffs wohl fühlt und gut versorgt ist.

1. Generierung des Mammary Imaging Window (MIW)

  1. Um das Brustbildgebungsfenster zu konstruieren, fertigen Sie einen 14-mm-Ring aus chirurgischem Edelstahl.
  2. Reinigen Sie den bearbeiteten Fensterrahmen mit einer heißen Lösung von 5% Reinigungsmittel, spülen Sie ihn 10 min unter fließendem deionisiertem Wasser (DI) ab, tränken Sie 100% Ethanol für 10 Minuten ein und trocknen Sie ihn dann unter einer Wärmelampe. Autoklavieren Sie den getrockneten MIW-Rahmen und lagern Sie ihn für den späteren Gebrauch.
  3. Bereiten Sie das MIW-Deckglas wie folgt vor: Das #1.5 12 mm runde Deckglas 10 min in 100% Ethanol einweichen, unter einer Wärmelampe trocknen und dann mit Cyanacrylat-Klebstoff am Metallrahmen befestigen. Härten Sie den Klebstoff über Nacht aus.
  4. Reinigen Sie den zusammengesetzten MIW mit einem mit Aceton getränkten Tupfer von überschüssigem Klebstoff und reinigen Sie ihn, indem Sie ihn 10 Minuten lang in 70% Ethanol tauchen. Lassen Sie das gereinigte Fenster trocknen. Bereiten Sie die MIW im Voraus vor und bewahren Sie sie vor der chirurgischen Implantation in einer sterilen Petrischale auf.

2. Chirurgische Implantation des MIW

  1. Autoklavieren Sie chirurgische Werkzeuge und desinfizieren Sie Oberflächen mit 70% Ethanol, bevor Sie mit der Operation für die Fensterimplantation beginnen.
  2. Führen Sie eine Operation auf einer desinfizierten Tischplatte mit einer wärmenden Decke durch, die mit einem sterilen Feld bedeckt ist. Stellen Sie die Wärmedecke so ein, dass die Temperatur, die oben auf dem sterilen Feld gemessen wird, 40 °C beträgt.
  3. Verwenden Sie zusätzliche Kaltbeleuchtung, um das Austrocknen von Gewebe zu verhindern. Verwenden Sie Lupen, um den chirurgischen Eingriff zu erleichtern. Tragen Sie PSA, bestehend aus einem sterilen Einweg-Laborkittel, chirurgischen Hüllen, Handschuhen, Augenschutz und Gesichtsmaske, wie von den chirurgischen Best Practices empfohlen.
  4. Betäuben Sie die Maus mit einer Anästhesie-Vaporizer-Maschine mit einer Isofluran-Einstellung von 2,0% und einer Sauerstoffdurchflussrate von 2,0 L / min. Analgetikum (10 mg/kg Meloxicam) durch subkutane Injektion verabreichen.
    HINWEIS: Geben Sie zusätzliche Dosen innerhalb der ersten 24 h an, vorzugsweise alle 8-12 h für die ersten 2 Tage nach der Operation.
  5. Nach der Betäubung (bestätigt durch keine Reaktion auf Zehenklemme), tragen Sie ein feuchtigkeitsspendendes Augengel auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern. Verwenden Sie eine Enthaarungscreme, um Fell an der Operationsstelle (4. Leistenbrustdrüse) zu entfernen, gefolgt von Spülen mit steriler wassergetränkter Gaze.
  6. Bereiten Sie die enthaarte Operationsstelle für die Operation vor, indem Sie die Hautoberfläche mit 3 abwechselnden Betadin- und Ethanolpeelings desinfizieren.
  7. Um die Operation zu beginnen, heben Sie die Haut sanft über die 4. Brustdrüse Nummer 4 mit einer Pinzette. Sobald die Haut von der Körperwand weggezogen ist, entfernen Sie einen ~ 1 mm großen Abschnitt der Hautschicht an der Spitze der Pinzette mit einer chirurgischen Mikroschere. Wenn Blutungen auftreten, üben Sie sanften Druck mit steriler Gaze aus, bis die Blutung aufhört.
    HINWEIS: Im Allgemeinen haben größere Tumore ein größeres Blutungspotenzial als kleinere Tumore oder normales Gewebe.
  8. Lösen Sie die Brustdrüse von der Hautschicht mit sanften Bewegungen der Pinzette an der chirurgischen Öffnung, um zu vermeiden, dass die darunter liegende Drüse durchtrennt wird.
  9. Erstellen Sie einen 10-mm-Schnitt und lösen Sie die Brustdrüse von der Hautschicht an der Peripherie, so dass Nähte platziert werden können, ohne in die Brustdrüse einzudringen. Fügen Sie PBS hinzu, um die exponierte Drüse / den freiliegenden Tumor abzudecken und das Austrocknen zu verhindern.
  10. Erstellen Sie eine Handtuch-String-Naht entlang der Peripherie der Öffnung mit 5-0 Seidengeflechtnaht. Setzen Sie eine Kante des MIW ein, so dass die Hautschicht in die Empfangskerbe des MIW einrastet.
  11. Dehnen Sie vorsichtig das Epithel auf der gegenüberliegenden Seite des MIW und drücken Sie das Metall-MIW so an seinen Platz, dass die dermale Schicht die Empfangskerbe um den gesamten MIW-Umfang vollständig eingreift. Ziehen Sie die Geldbörsenschnur fest, um die Hautschicht in die Kerbe zu ziehen und sie abzubinden, um die MIW vollständig zu sichern.
  12. Fügen Sie ein topisches Antibiotikum zur Hautschicht am MIW hinzu und überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liegefähigkeit aufrechtzuerhalten. Unterbringen Sie die MIW-implantierte Maus separat auf weicher Bettwäsche mit einem Iglu im Käfig und lassen Sie die Maus sich vor der Bildgebung 48 Stunden lang erholen.

3. Positionieren und Warten der Maus auf der Mikroskopstufe für die Bildgebung

  1. Stellen Sie die Heizkammer auf der Mikroskopstufe auf. Verwenden Sie ein auf 30 °C eingestelltes Zwangsluftsystem oder ein anderes ähnliches System. Verwenden Sie eine Objektivheizung, um Drift im Z-Fokus zu vermeiden. Lassen Sie das System vor der Bildgebung mindestens 1 Stunde lang ins Gleichgewicht kommen.
    HINWEIS: Anästhesierte Mäuse sind nicht in der Lage, ihre Körpertemperatur richtig aufrechtzuerhalten, und daher ist es notwendig, eine beheizte Umgebung für Zeitrafferaufnahmen zu haben. Die Objektivheizung hilft, die Auswirkungen der Wärmeausdehnung zu bekämpfen, ein Phänomen, das eine Drift im Z-Fokus verursacht, wenn die Objektivlinse und das abgebildete Gewebe zum thermischen Gleichgewicht kommen.
  2. Sobald sich die Heizkammer auf dem Mikroskop bei 30 °C stabilisiert hat, betäuben Sie die Empfängermaus mit Anästhesiegeräteeinstellungen von 2% Isofluran und Sauerstoffdurchfluss von 2 L/min.
  3. Nachdem die Maus sediert wurde (bestätigt durch Nicht-Reaktion auf Zehenklemme), reinigen Sie die Außenseite des MIW-Glases mit einem Baumwollapplikator und Glasreiniger, fügen Sie Augensalbe hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern, und führen Sie bei Bedarf einen Schwanzvenenkatheter ein.
  4. Um die richtige Hydratation aufrechtzuerhalten, geben Sie eine erste Injektion von 0,5 ml PBS subkutan oder 100 μL durch den Schwanzvenenkatheter. Wiederholen Sie dies alle 2 Stunden für die Dauer der Bildgebungssitzung.
  5. Sobald die Maus richtig vorbereitet wurde, richten Sie das Mikroskop für die Bildgebung ein. Um die Verdunstung während der Zeitraffermessungen zu reduzieren, verwenden Sie ein Gel auf Wasserbasis anstelle von Wasser für die Tauchmedien. Dies sollte getan werden, bevor Sie die Maus auf die Bühne stellen. Einzelheiten zu den optischen Komponenten entnehmen Sie bitte der Materialtabelle.
  6. Legen Sie die Maus auf die Mikroskopstufe, montieren Sie den Isofluranschlauch und drücken Sie den Kragen des MIW in ein 14 mm Aufnahmeloch im Bühneneinsatz, um die Bilder zu stabilisieren. Bringen Sie das Bildgebungsfeld mit dem Mikroskop Okularen in den Fokus und verwenden Sie Hellfeldbeleuchtung, um das Gefäßsystem mit Blutfluss zu beobachten.
  7. Überprüfen Sie die Stabilität des Sichtfelds. Wenn Atembewegungsartefakte vorhanden sind, tragen Sie eine sanfte Kompression auf die Rückseite der Drüse mit einem kleinen Schaumstoffblock und einem cinkturartigen Stück Klebeband auf. Überprüfen Sie nach der Komprimierung, ob der Blutfluss im gesamten Sichtfeld aufrechterhalten wird.
  8. Passen Sie die Isofluranspiegel während der Bildgebungssitzung regelmäßig in Schritten von 0,25% an, um ein angemessenes Maß an Sedierung aufrechtzuerhalten, indem Sie die Tieratmung manuell zählen.
  9. Halten Sie eine Rate von 36-40 Atmungen pro Minute (U/min) aufrecht, um die Langlebigkeit der Tiere und die optische Bildgebung zu verbessern. Niedrigere Atemfrequenzen können dazu führen, dass die Maus das Experiment nicht überlebt, während Atemfrequenzen über 60 U / min zu einer schlechten Sedierung führen können, was die Atem- und Bewegungsartefakte in den Bilddaten erhöhen kann.

4. Einrichtung für 4D, intensitätsbasierte, markierungsfreie intravitale Bildgebung des dynamischen Zellverhaltens

  1. Sobald die Maus sediert und sicher auf der invertierten Mikroskopstufe positioniert ist, beginnen Sie mit der Suche nach interessanten Regionen.
  2. Verwenden Sie mit einer Lichtquelle, die auf das MIW gerichtet ist, das Okular des Mikroskops, um potenzielle Bereiche für die Untersuchung zu identifizieren. Fügen Sie die x-, y-Positionen in der Software hinzu und speichern Sie sie, um zu diesen Positionen zurückzukehren.
    HINWEIS: Die feinen Details des Tumors sind bei dieser Art der Beleuchtung nicht ohne weiteres sichtbar. Das Ziel ist einfach, Regionen für weitere Untersuchungen zu identifizieren. Der Fokus liegt auf der Beobachtung von Gefäßsystem und Blutfluss.
  3. Nachdem mehrere Positionen in der Software gespeichert wurden, zeigen Sie eine Vorschau der ausgewählten Sichtfelder mit 890 nm Anregung und dem FAD/SHG-Filterwürfel an. Verwenden Sie eine maximale Verweilzeit von 4 μs mit geringerer Leistung und hoher PMT-Einstellung. Ziel ist es, eine Vorschau der Sichtfelder anzuzeigen, ohne das Gewebe übermäßigem Laserlicht auszusetzen.
  4. Sobald die entsprechenden Leistungsstufen eingestellt wurden, richten Sie die Z-Stacks ein. Beobachten Sie das Auftreten von reichlich vorhandenen Kollagenfasern (SHG) bei 20-50 μm unter der Glasoberfläche des MIW. Kollagen wird weniger verbreitet, wenn das Mikroskop tiefer in den Tumor eindringt (Abbildung 1B). Hohlräume im SHG zeigen die Lage von Tumormassen.
  5. Setzen Sie die obere Z-Schicht unter die Schicht der Einzelzellen, wo die ersten Kollagenfasern bei ~ 50-100 μm erscheinen. Stellen Sie die untere Z-Scheibe auf ~ 250 μm ein, wo die Fasern ausblenden und das schlechte Signal dominiert. Wiederholen Sie dies für alle gespeicherten x-y-Positionen.
  6. Sobald der Z-Stack-Bereich eingestellt ist, erhöhen Sie die Verweilzeit (bis zu 8 μs) und optimieren Sie die Leistungs- und Detektoreinstellungen. Optimieren Sie die Leistungsstufen nach Bedarf, um das Gewebe für jedes Experiment anzuregen. Die Verwendung von Leistungen bis zu 90 mW bei 750 nm oder 70 mW bei 890 nm an der hinteren Blende des Objektivs liegt in einem akzeptablen Bereich.
    HINWEIS: Die Abbildungstiefe, die Menge an Streuung innerhalb des Gewebes, die objektiven Eigenschaften und die Empfindlichkeit des Detektors wirken sich erheblich auf die Menge an Leistung aus, die zum Abrufen eines Bildes erforderlich ist.
  7. Passen Sie die Zeitintervalle entsprechend den experimentellen Zielen an. Beginnen Sie mit 10-minütigen Intervallen zwischen den Sammelstellen für die meisten intravitalen Migrationsfilme.
  8. Auch wenn die 2P-Anregung sanft zu Zellen und Geweben ist, sollten Sie sich der Anzeichen von Phototoxizität bewusst sein, wie Zellblebbing oder schnell zunehmende Autofluoreszenz und übermäßiges Photobleichen. Reduzieren Sie die Laserleistung oder erhöhen Sie die Zeitrafferintervalle, wenn die Bedingungen dies erfordern.

5. Fluoreszenz-Lifetime-Bildgebung (FLIM) von NAD (P) H

  1. Während Sie die x-y-Positionen aus den Zeitrafferaufnahmen beibehalten, richten Sie das Mikroskop ein, um einen FLIM-Stapel zu sammeln. Setzen Sie einen 440/80-Filter in einen Filterhalter vor dem GaAsP-Detektor ein und stellen Sie die GaAsP-Detektorspannung in der Software auf 800 ein. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, wenn die Detektoren eingeschaltet sind.
  2. Wechseln Sie in der Software von der galvanometerbasierten Intensitätsbildgebung in einen FLIM-Bildgebungsmodus.
  3. Um das Gefäßsystem zu identifizieren und zu maskieren, stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel ein. Um komplementäre Stoffwechselinformationen zu sammeln, stellen Sie die Auflösung auf 256 x 256 Pixel ein, um die zeitliche Auflösung der Lebensdauersignatur zu erhöhen. Stellen Sie die Verweilzeit auf 4 μs ein und stimmen Sie den Laser auf 750 nm ab.
  4. Starten Sie das Vorschauscannen und beginnen Sie mit der Einstellung der Laserleistung. Stellen Sie die Laserleistung so lange ein, bis die Anzeige für den Diskriminator mit konstantem Anteil (CFD) zwischen 1 x 105 und 1 x 106 liegt. Überschreiten Sie nicht 1 x 106, da dies zu Photonenstapelung und schlechten Gesamtergebnissen führt.
  5. Sobald die Leistungsstufe eingestellt ist, stellen Sie die Integrationszeit zwischen 90 s und 120 s ein und starten Sie die FLIM-Sammlung. Es wird Photonen aus dem Sichtfeld für die vorgesehene Zeit aufnehmen.
  6. Optional: Nachdem alle notwendigen Sammlungen vorgenommen wurden und die Maus von der Bühne entfernt wurde, sammeln Sie eine Instrumentenantwortfunktion (IRF). Messen Sie den IRF, indem Sie die Oberfläche kommerziell erhältlicher Harnstoffkristalle in einer Glasbodenschale mit den gleichen Parametern abbilden und für die Abbildung des Gewebes einrichten.
    HINWEIS: Das IRF berücksichtigt Verzögerungen oder Reflexionen aufgrund des elektronischen oder optischen Setups. Der IRF ist bei allen FLIM-Akquisitionen involviert, und seine Entflechtung von den Daten kann die Genauigkeit berechneter Fluoreszenzzerfallskurven verbessern. Vor diesem Hintergrund können die berechneten IRFs oft die Qualität der Fluoreszenzzerfallskurven aus gemessenen IRF replizieren. Es ist eine gute Praxis, den IRF zu messen, bis festgestellt wurde, dass der berechnete IRF äquivalente Übereinstimmungen der Zerfallskurven liefert und die Ergebnisse des gemessenen IRF angemessen annähert.

6. Analyse von NADH Lifetime-Bildern

  1. Öffnen Sie die FLIM-Software und importieren Sie das NAD(P)H-Lebensdauerbild aus dem Datensatz. Weitere Informationen zur ordnungsgemäßen Verwendung der Software finden Sie in den Handbüchern zur fluoreszierenden Lebensdauer (siehe Materialtabelle).
  2. Definieren Sie zunächst die Modellparameter in der Software. Klicken Sie in der Menüleiste auf Optionen > Modell. Wählen Sie die folgenden Kontrollkästchen aus: Einstellungen > Multiexponentieller Zerfall, Anpassungsmethode > MLE, Spatial Binning > Square, Schwellenwert > Peak und aktivieren Sie Fix Shift vor der Berechnung des Bildes.
  3. Klicken Sie in der Menüleiste im Dropdown-Menü auf Farbe >A 1%. Definieren Sie es auf der rechten Seite des Fensters als Drei-Komponenten-Passform. Legen Sie die Behältergröße auf > 3 fest.
  4. Stellen Sie den Schwellenwert > ~10 ein. Bewerten Sie die Schwellenwertgenauigkeit neu, nachdem die Zerfallsmatrix zum ersten Mal berechnet wurde.
  5. Fixieren Sie τ1 auf 200 ps. Dies stellt die kurze Lebensdauer der roten Blutkörperchen dar. Versuchen Sie, den Wert zu finden, der am besten zu mehreren Stellen im größeren Blutgefäß passt, was im Intensitätsbild zu sehen ist. Fixieren Sie τ2 auf 1200 ps. Dies stellt die lange Lebensdauer der roten Blutkörperchen dar.
    HINWEIS: Die eingestellten Werte sind nur der Ausgangspunkt. Die Werte müssen optimiert werden, um das Gefäßsystem mehr hervorzubringen. In den meisten Fällen, aber nicht immer, werden diese Werte abnehmen.
  6. Wählen Sie in der Menüleiste unter Berechnen die Option Zerfallsmatrix aus. Dadurch werden anfängliche A1% Lebensdauerbilder erzeugt, wobei das Gefäßsystem hohe Werte aufweist. Verwenden Sie den Cursor (Fadenkreuz), um mit der Maus über das Gefäßsystem zu fahren. Schweben Sie systematisch und nacheinander die Taste τ1 und τ2 (deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Fix ). Notieren Sie diese Werte, da sie zur Optimierung der festen Parameter beitragen.
    HINWEIS: Das Ziel ist nicht unbedingt, die genauesten Werte im Bild zu erhalten, sondern die Disparität zwischen Gefäßsystem und Gewebe zu maximieren, ohne den als Gefäß identifizierten Bereich dramatisch zu verringern.
  7. Nachdem die entsprechenden Parameter für τ1 und τ2 identifiziert wurden, wählen Sie in der Menüleiste > Stapelverarbeitung berechnen aus. Stellen Sie sicher, dass die meisten Einstellungen zwischen den z-Slices ähnlich sind.
  8. Stellen Sie sicher, dass es keine Einstellung gibt, die sich stark von den anderen unterscheidet. Wenn dies der Fall ist, passen Sie zuerst die Umschalttaste an und versuchen Sie es erneut. Wenn das Problem weiterhin besteht, überprüfen Sie es mit neuen Parametern. Eine falsche Verschiebung kann eine große Ursache für Geräusche in den Fits sein und dieA-1%-Werte in den angrenzenden Tumorregionen erhöhen.
  9. Speichern Sie auf der Menüregisterkarte die Dateien und exportieren Siedann A1%-Dateien. Laden Sie diese Dateien zur Maskierung und Segmentierung in ImageJ hoch.

7. Bildsegmentierung des Gefäßsystems

  1. Öffnen Sie ImageJ und importieren Sie das Bild A1% als Textbild. Wiederholen Sie dies für alle Bilder innerhalb des Stapels.
  2. Wenn alle A1% Bilder geöffnet sind, wählen Sie Bild > Stapel > Z-Projekt. Verwenden Sie die Max Intensity Projection und speichern Sie die Bilder. Ein repräsentatives Bild finden Sie unter Ergänzende Daten 1.
  3. Gehen Sie zu Plugins > Segmentierung. Wählen Sie das trainierbare WEKA Segmentierungs-Plugin38 aus.
  4. Sobald das WEKA-Fenster geöffnet wird, verwenden Sie die Standardeinstellungen und beginnen Sie, die Software zu trainieren, indem Sie zwei Klassen und Tracing-Linien über die Gefäße (hohe A 1% Regionen) und Nicht-Vaskulatur (niedrige A1% Regionen) erstellen.
  5. Fügen Sie den beiden Klassen weiterhin neue Spuren hinzu, bis die Software die Bereiche mit hohemA 1% der Gefäße konsistent identifiziert und gleichzeitig höhere Bereiche von Hintergrundgeräuschen eliminiert. Siehe Ergänzendes Modell für repräsentative Klassifikatoren.
  6. Sobald das klassifizierte Bild erstellt wurde, klicken Sie auf Bild > Typ > 8 Bit. Legen Sie einen Schwellenwert für das Bild fest, und erstellen Sie eine Maske. Wenn das Schwellenbild noch weiter bereinigt werden muss, verwenden Sie die Funktion "Partikel analysieren ".
  7. Passen Sie die Größe und Zirkularität an, bis kleinere und kreisförmige Bereiche des Schwellenwertbildes ausgeschlossen sind. Eine saubere Maske mit nur dem Gefäßsystem und sehr wenig Hintergrund wird erhalten.
  8. Klicken Sie auf > Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen. Übertragen Sie die Auswahl an den ROI-Manager, indem Sie auf > Tools analysieren > ROI-Manager klicken.
  9. Duplizieren Sie das klassifizierte Bild. Fahren Sie mit Verarbeiten > Binärdatei fort. Um die Maske zu erweitern und den Abstand von der Vaskulatur zu definieren, die in die Bildsegmentierung einbezogen wird, wählen Sie Dilatieren. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich die Maske auf den gewünschten Bereich erweitert hat. Notieren Sie diese Region of Interest (ROI) im ROI-Manager.
    HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, die Menge oder das Verhalten innerhalb einer bestimmten Nähe des Blutgefäßes zu quantifizieren (z. B. die Anzahl der Zellen, die innerhalb von X μm der Blutgefäße vorhanden sind). Die erforderliche Dilatationsmenge wird vollständig durch die wissenschaftliche Fragestellung bestimmt.
  10. Um die Anzahl der Zellen innerhalb der restriktiven Bereiche zu quantifizieren, wählen Sie das gewünschte Fenster (Bild/Kanal) aus. Dies kann jedes Fenster sein, das das gleiche Sichtfeld wie die Gefäßmaske teilt. Wenden Sie beide ROIs mit der XOR-Funktion aus dem Dropdown-Menü an.
    HINWEIS: Bei diesem Vorgang werden die Elemente innerhalb des gewünschten Abstands vom Gefäßsystem gemessen, mit Ausnahme des Gefäßsystems selbst. Dieser kombinierte ROI-Ansatz kann dann verwendet werden, um eine Vielzahl von Parametern wie Intensität, Zellzahl oder Migration zu messen.

8. Bildsegmentierung des Tumornestes

  1. Öffnen Sie das NADH-Bild entweder aus einem hochauflösenden Intensitätsscan oder aus einer FLIM-Sammlung in ImageJ.
    HINWEIS: Dies kann auf einzelne z-Slices, Full Stacks oder auf z-Projektionen einiger Slices angewendet werden.
  2. Gehen Sie zu Plugins > Segmentierung. Wählen Sie das trainierbare WEKA-Segmentierungs-Plugin aus.
  3. Sobald das WEKA-Fenster geöffnet wird, verwenden Sie die Standardeinstellungen und beginnen Sie, die Software in zwei Klassen von NADH-Hochregionen und NADH-Niedrigregionen zu trainieren. Die NADH-hohen Regionen werden ein sehr erkennbares Muster von Zellen mit Kernen haben und die Software wird es leicht identifizieren.
  4. Schalten Sie mit dem Overlay weiter hin und her, um den Algorithmus mit zusätzlichem Training zu verfeinern, bis er alle Regionen des Tumors erkennt, wie sie durch Auge und Vorwissen der Tumormorphologie bestimmt werden. Dies ist ein iterativer Prozess.
  5. Sobald der Algorithmus alle Bereiche des Tumors erkannt hat, wählen Sie die Schaltfläche Ergebnis erstellen . Dadurch entsteht ein neues Bild. Duplizieren Sie dieses Bild.
  6. Wählen Sie das erste duplizierte Bild aus und konvertieren Sie es in ein 8-Bit-Bild, indem Sie Bild > Typ > 8 Bit auswählen. Legen Sie einen Schwellenwert für dieses Bild fest, um eine binäre Maske zu erstellen. Erstellen Sie dann eine Auswahl und übertragen Sie sie an den ROI-Manager. Diese ROIs definieren den Stroma.
  7. Wählen Sie das zweite des duplizierten Bildes aus und konvertieren Sie es in ein 8-Bit-Bild. Kehren Sie dieses Bild um, indem Sie Bild > Bearbeiten > Umkehren auswählen und dann einen Schwellenwert für dieses Bild festlegen, um eine binäre Maske zu erstellen. Erstellen Sie erneut eine Auswahl und übertragen Sie sie an den ROI-Manager. Dieser ROI definiert das Tumornest.

9. Bildsegmentierung nach Faserorganisation oder -ausrichtung

  1. Öffnen Sie zunächst die SHG-Bilder, bereiten Sie eine beliebige Z-Projektion vor und beurteilen Sie die Notwendigkeit einer Vorverarbeitung. Für gute Ergebnisse sind qualitativ hochwertige Bilder mit erkennbaren Fasern und geringem Rauschen erforderlich.
  2. Optional: Für die Vorverarbeitung in ImageJ, um das Signal-Rauschen (SNR) des SHG-Kanals zu erhöhen, subtrahieren Sie den Hintergrund mit einer rollenden Kugelsubtraktion. Verwenden Sie für die meisten Anwendungen eine rollende Kugelsubtraktion zwischen 20 Pixeln und 50 Pixeln. Glätten Sie dann das Bild und speichern Sie es.
  3. Öffnen Sie das OrientationJ-Plugin und legen Sie die Verarbeitungsparameter fest. Definieren Sie im Fenster OrientationJ die Größe des lokalen Tensorfensters. Für ein 20-faches Bild dieser Faserdichte legen Sie 10 Pixel auf 15 Pixel als Ausgangspunkt fest.
  4. Wählen Sie Kubischer Spline als Verlaufsmodell aus, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Farbvermessung. Definieren Sie die Farbvermessung. Legen Sie sowohl den Farbton als auch die Sättigung als Kohärenz fest und definieren Sie dann die Helligkeit als Originalbild, und klicken Sie auf Ausführen.
  5. Die Ausgabedatei des Plugins ist RGB Colormap. Passen Sie den Wert des lokalen Tensorfensters an, bis ausgerichtete Bereiche, wie vom Auge bestimmt, mit blauen und magentafarbenen Farbtönen richtig hervorgehoben werden.
  6. Sobald das Ausgabebild zufriedenstellend ist, trennen Sie dieses RGB-Bild in 3 Kanäle. Wählen Sie Bild > Farbe > Split-Kanal.
  7. Um das Erscheinungsbild ausgerichteter Bereiche zum Zwecke der Maskierung zu verbessern, verwenden Sie den Bildrechner, indem Sie > Bildrechner verarbeiten auswählen. Subtrahieren Sie mit diesem Operator das grüne Bild vom blauen Bild. Für eine restriktivere Maske subtrahieren Sie das grüne Bild vom roten Bild. Für zufällige Bereiche subtrahieren Sie den blauen Kanal vom grünen Kanal.
  8. Schwellenwert für das resultierende Bild mit dem Moments-Algorithmus . In den meisten Fällen sollte dies keine weiteren Anpassungen erfordern. Passen Sie sie jedoch bei Bedarf an. Dadurch wird ein binäres Bild erzeugt.
  9. Sobald das Binärbild erstellt wurde, füllen Sie die Löcher, indem Sie Verarbeiten > Binär > Löcher zwischen Fasern füllen auswählen und die Grenzen der Maske mit einem Medianfilter abrunden. Ein Medianfilter von 10 ist ein guter Ausgangspunkt, passen Sie ihn an, um eine gute Passform für die Daten zu erhalten. Überprüfen Sie die Maske manuell auf Zustimmung und entfernen Sie fehlerhafte ROIs.
  10. Sobald die Maske zufriedenstellend ist, erstellen Sie eine Auswahl, indem Sie > Auswahl bearbeiten > Auswahl erstellen auswählen. Übertragen Sie diese Auswahl an den ROI-Manager.

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Ergebnisse

Die Installation des MIW und die grundlegende experimentelle Planung sind die ersten Schritte in diesem Prozess. Dieses spezielle MIW-Design und -Protokoll sind für Längsschnittstudienbesser geeignet 19 und wurden sowohl mit aufrechten als auch mit inversen Mikroskopen erfolgreich eingesetzt. In diesem Fall wurde ein inverses Mikroskop verwendet, da dies zu einer größeren Bildstabilität der Brustdrüse mit weniger Atemartefakten geführt hat. In Abbildung 1A stellen wir...

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Diskussion

Die intravitale 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung dynamischer physiologischer Wechselwirkungen im räumlichen und zeitlichen Kontext der nativen Tumormikroumgebung. Dieses Manuskript bietet einen sehr grundlegenden und anpassungsfähigen Betriebsrahmen, um dynamische Zellinteraktionen innerhalb der Tumormasse, des benachbarten Stromas oder in der Nähe des Gefäßnetzwerks zu unterteilen, wobei nur endogene Signale aus der zweiten harmonischen Erzeugung oder der NAD(P)H-Autofluoreszenz verwendet...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten NCI R01 CA216248, CA206458 und CA179556 Zuschüsse für die Finanzierung dieser Arbeit anerkennen. Wir möchten auch Dr. Kevin Eliceiri und seiner Imaging-Gruppe für ihre technische Expertise bei der frühen Entwicklung unseres intravitalen Programms danken. Wir danken auch Dr. Ben Cox und anderen Mitgliedern der Eliceiri Fabrication Group am Morgridge Institute for Research für ihr wesentliches technisches Design während der frühen Phasen des MIW. Dr. Ellen Dobson half mit nützlichen Gesprächen über das trainierbare WEKA-Segmentierungstool ImageJ. Darüber hinaus möchten wir uns bei Dr. Melissa Skala und Dr. Alexa Barres-Heaton für den rechtzeitigen Einsatz ihres Mikroskops bedanken. Abschließend möchten wir uns bei Dr. Brigitte Raabe, D.V.M., für all die nachdenklichen Diskussionen und Ratschläge zu unserem Umgang mit und unserer Pflege der Maus bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
#1.5 12mm rundes DeckglasWarner Instruments# 64-0712MIW Konstruktion
1,0 mL Spritze für SQ InjektionBD309659Spritze
20x ObjektivZeiss421452-988Wasserimmersion
27G Nadel für SQ InjektionCovidien1188827012Nadel
40x ObjektivNikonMRD77410Wasserimmersion
5-0 geflochtenes SeidennahtEthiconK870Naht für MIW-Implantation
Künstliches TränengelAkornNDC 59399-162-35Augengel
Betadin-Lösung, 5%FisherScientificNC1558063Surgery antiseptischer
Applikator mit WattespitzeFisher Scientific23-400-101
Cyanacrylat-KlebstoffLoctite1365882MIW-Konstruktion
Fluoreszenz-DextranSigmaT1287-50mgintravenöse Markierung von
GefäßzangenMckesson.comMiltex #18-782Edelstahl, 4 Zoll, gebogene
GaAsP Photomultiplier-RöhreHamamatsu 
HeizdeckeCARA 72 Heizkissen  038056000729Temperaturwählbare
HeizkammerSelbstgebaute
Leuchtstoffröhren-Lebensdauer-HandbuchBecker und Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
inverse MikroskopbasisNikon
IsofluranAkornNDC 59399-106-01Anästhesie
Liqui-NoxFisher Scientific16-000-125MIW Reinigung
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10Analgetikum
MikroschlauchScientific Commodities INC.  BB31695-PE/1
Multiphotonen-ScankopfBruker Ultima IIMultiphotonen-Scankopf und Bildgebungsplattform
NADH FLIM-FilterChroma284994ET 440/80 m-2P
NairCVS339826Enthaarungscreme
ObjektivheizungTokaiHit STRG-WELSX-SET
SHG/FAD-FilterChroma320740ET450/ 40m-2P
Sparkle GlasreinigerAmazon.comB00814ME24Glasreiniger für implantierte MIW
SPC-150 PhotonenzählplatineBecker und Hickl
OP-LeuchteFAJB06XV1VQVZMagnetische LED-Schwanenhalsleuchte
chirurgische MikroschereExcelta366Edelstahl, 3 Zoll
Dreifache antibiotische SalbeActavis PharmaNDC 0472-0179-34Antibiotischer
TV-KatheterBenutzerdefinierteBD 30G-Nadel: 305106Katheter für TV-Injektion
Zwei-Photonen-FilterChroma320282ET585/65m-2P
Zwei-Photonen-LaserKohärenter CharmeleonAbstimmbares Multiphotonen-Laser-Ultraschallgel
ParkerPKR-03-02Wasser-Immersionsgel
Harnstoff QuarzeSigmaU5128-5GOptional: FLIM IRF

Referenzen

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Ein markierungsfreier Segmentierungsansatz für die intravitale Bildgebung von Brusttumor-Mikroumgebungen
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