Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Quail Chorioallantoic Membrane - Et verktøy for fotodynamisk diagnose og terapi

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63422
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Centre of Biosciences SAS, IABG, Bratislava, Slovakia, 2Center for Interdisciplinary Biosciences, University of Pavol Jozef Šafárik, Košice, Slovakia

Summary

Den chorioallantoiske membranen (CAM) til fugleembryoet er et svært nyttig og anvendelig verktøy for ulike forskningsområder. En spesiell ex ovo-modell av japansk vaktel CAM er egnet for fotodynamisk behandlingsundersøkelse.

Abstract

Den chorioallantoiske membranen (CAM) til et aviært embryo er en tynn, ekstraembryonisk membran som fungerer som et primært respiratorisk organ. Egenskapene gjør den til en utmerket in vivo eksperimentell modell for å studere angiogenese, tumorvekst, legemiddelleveringssystemer eller fotodynamisk diagnose (PDD) og fotodynamisk terapi (PDT). Samtidig adresserer denne modellen kravet om erstatning av forsøksdyr med et egnet alternativ. Ex ovo dyrket embryo tillater enkel stoffpåføring, tilgang, overvåking og dokumentasjon. Den mest brukte er chick CAM; Denne artikkelen beskriver imidlertid fordelene med den japanske vaktelen CAM som en lavpris- og høykapasitetsmodell. En annen fordel er den kortere embryonale utviklingen, noe som gir høyere eksperimentell omsetning. Egnetheten av vaktel CAM for PDD og PDT av kreft og mikrobielle infeksjoner er utforsket her. Som et eksempel beskrives bruken av fotosensibilisatorhypericin i kombinasjon med lipoproteiner eller nanopartikler som et leveringssystem. Skadeskår fra bilder i hvitt lys og endringer i fluorescensintensitet i CAM-vevet under fiolett lys (405 nm) ble fastslått, sammen med analyse av histologiske snitt. Vaktelen CAM viste tydelig effekten av PDT på vaskulatur og vev. Videre kunne endringer som kapillærblødning, trombose, lysis av små kar og blødning av større kar observeres. Japansk vaktel CAM er en lovende in vivo modell for fotodynamisk diagnose og terapiforskning, med anvendelser i studier av tumorangiogenese, samt antivaskulær og antimikrobiell terapi.

Introduction

Kylling chorioallantoic membran (CAM) modellen er kjent og mye brukt i ulike forskningsområder. Det er et rikt vaskularisert ekstraembryonisk organ som gir gassutveksling og mineraltransport1. På grunn av gjennomsiktigheten og tilgjengeligheten til denne membranen, kan individuelle blodkar og deres strukturelle endringer observeres i sanntid2. Til tross for fordelene har kylling CAM også noen begrensninger (f.eks. Større avlsanlegg, eggproduksjon og fôrforbruk) som kan unngås ved å bruke andre fuglearter. I denne protokollen beskrives en alternativ ex ovo CAM-modell ved bruk av japansk vaktel (Coturnix japonica) embryo. På grunn av sin lille størrelse tillater det bruk av et mye større antall eksperimentelle individer enn kylling CAM. Videre er den kortere 16-dagers embryonale utviklingen av vaktelembryoer en annen fordel. De første større fartøyene på vaktel CAM vises på embryonal dag (ED) 7. Dette kan sammenlignes direkte med kyllingembryoutvikling (trinn 4-35); Imidlertid er de senere utviklingsstadiene ikke lenger sammenlignbare og krever mindre tid for vaktelembryoet3. Av interesse er den vanlige forekomsten av mikrovaskulær forgrening som ligner på kylling CAMs 4,5,6. Rask kjønnsmodning, høy eggproduksjon og lavprisavl er andre eksempler som favoriserer bruken av denne eksperimentelle modellen7.

En aviær CAM-modell brukes ofte i fotodynamisk terapi (PDT) studier8. PDT brukes til å behandle flere former for kreft (små lokaliserte svulster) og andre ikke-onkologiske sykdommer. Dens prinsipp er i levering av et fluorescerende stoff, en fotosensibilisator (PS), til det skadede vevet og dets aktivering med lys av riktig bølgelengde. En prospektiv PS som brukes i forskning er hypericin, opprinnelig isolert fra den medisinske planten St. John's wort (Hypericum perforatum)9. De sterke fotosensibiliserende effektene av denne forbindelsen er basert på dens fotokjemiske og fotofysiske egenskaper. Disse er preget av flere fluorescenseksitasjonstopper i området 400-600 nm, noe som induserer utslipp av fluorescens ved ca. 600 nm. Absorpsjonsmaksimumet for hypericin i spektralbåndet er i området 540-590 nm, og fluorescensmaksima er i området 590-640 nm9. For å oppnå disse fotosensibiliserende effektene, blir hypericin begeistret av laserlys ved en bølgelengde på 405 nm etter lokal administrasjon10. I nærvær av lys kan hypericin utvise virucidale, antiproliferative og cytotoksiske effekter11, mens det ikke er systemisk toksisitet, og det frigjøres raskt fra organismen. Hypericin er et lipofilt stoff som danner vannuoppløselige, ikke-fluorescerende aggregater, og derfor brukes flere typer nanobærere, for eksempel polymere nanopartikler 12,13 eller lipoproteiner med høy og lav tetthet (HDL, LDL) 14,15, for å hjelpe levering og penetrasjon i cellene. Siden CAM er et naturlig immunsviktende system, kan tumorceller implanteres direkte på membranoverflaten. Modellen er også godt egnet til å registrere omfanget av PDT-indusert vaskulær skade i henhold til en definert skår16,17. Lys med lavere intensitet sammenlignet med PDT kan brukes til fotodynamisk diagnose (PDD). Overvåking av vevet under fiolett eksitasjon LED-lys fører også til fotoaktivering av fotosensibilisatorer18,19,20 som resulterer i utslipp av fluorescerende lys, men det gir ikke nok energi til å starte en PDT-reaksjon og skade cellene. Det gjør det til et godt verktøy for tumorvisualisering og diagnose eller overvåking av farmakokinetikken til brukt PSs14,15.

Denne artikkelen beskriver utarbeidelsen av vaktelen ex ovo CAM-analysen med overlevelsesrater over 80%. Denne ex ovo-kulturen ble vellykket brukt i et stort antall eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskningen ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer. Alt utstyr og reagenser må autoklaveres eller steriliseres med 70% etanol eller UV-lys.

1. Egg inkubasjon

  1. Oppbevar befruktede vaktelegg ved 10-15 °C i maksimalt 4-5 dager før inkubasjonen starter. Bruk bare rene og uskadede egg.
  2. Inkuber eggene i en tvungen trekkinkubator i ~ 53-54 timer. Legg eggene horisontalt med eggrotasjonen slått av, ved 50% -60% fuktighet og 37,5 ° C inkubasjonstemperatur.

2. Ex ovo kultur forberedelse

MERK: Etter første inkubasjon er eggene egnet for å starte ex ovo-dyrking .

  1. Desinfiser eggoverflaten med 70% etanol, uten å rotere egget.
  2. I et sterilt laminarisk strømningsskap åpner du eggeskallet ved hjelp av liten steril kirurgisk saks og overfører innholdet til en 6-brønns kulturplate. Hvis det gjøres riktig, vil embryoet ligge på toppen av en uskadet eggeplomme. Etter hvert egg desinfiserer du saksen med 70% etanol.
  3. Tilsett ca. 5 ml sterilt vann i hullene i 6-brønnsplaten, da fuktighet er viktig for å forhindre at CAM tørker ut.
  4. Plasser embryoene i en inkubator inntil videre forsøk, samtidig som du opprettholder en temperatur på 37 °C og 80%-90% fuktighet.
  5. Når CAM er fullt utviklet (fra ED7), plasser en sterilisert silikonring (6 mm i diameter og ca. 1,5 mm i tykkelse) på CAM-overflaten, langs de små kapillærene. Unngå store blodårer når du plasserer ringen.
    MERK: Ringen definerer arbeidsområdet, bidrar til å markere påføringsstedet for stoffet og forhindrer at det flytende innholdet lekker ut.
  6. Avslutt dyrking av embryoene i henhold til landets lovgivning.
  7. Det er viktig å bruke hansker eller holde hendene desinfisert med 70% etanol under arbeidet. Aspirate feilaktig tippet embryoer eller unfertilized egg med en vakuum aspirator.

Figure 1
Figur 1: Ex ovo kultur forberedelse. (A) Japanske vaktelegg når de lagres og ruges. (B) Desinfeksjon av eggoverflaten med etanol. (C) Eggeskall er kuttet med saks. (D) Innholdet i egget tømmes i brønnen. (E) Riktig forberedt 3 dager gammelt embryo, med utvikling av CAM-vaskulatur. (F) Kulturplater lagret i en inkubator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: 6-brønns kulturplate med embryoer og silikonringer plassert på toppen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Inokulering av tumorceller

MERK: Alle prosedyrer krever bruk av et sterilt laminært strømningsskap.

  1. Kultur forskjellige typer adherente celler i kolber i henhold til respektive kulturprotokoller.
    1. Fjern det gamle mediet fra kolbene og skyll cellelaget med steril fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne spor av mediet.
    2. Etter trypsinisering, hemmer trypsinet ved å tilsette kulturmediet og høste cellene i sentrifugerør. Sentrifuge cellene og resuspendere cellepelleten i et friskt kulturmedium. Tell cellene og resuspender dem i et cellekulturmedium ved ønsket konsentrasjon.
      MERK: Det er også mulig å produsere 3D-cellekulturer, dvs. sfæroider ved hjelp av for eksempel hengende dråpemetode21.
  2. Implanter 1 x 10 5-1 x 106 tumorceller eller5-15 sfæroider (per CAM) i 30 μL cellemediumoppløsning i silikonringen på toppen av CAM.
    MERK: Volumet avhenger av størrelsen på silikonringen som brukes. Hvis en silikonring med større diameter brukes, er det nødvendig med et større volum for å dekke hele området. Avhengig av celletype, eller for ulike typer eksperimenter, kan ulike cellekonsentrasjoner brukes. Noen ganger brukes fin skraping av CAM for å forbedre adhesjonen av de innebygde cellene.
  3. Returner CAMs med inokulerte celler til inkubatoren (37 ° C og 80% -90% fuktighet).

Figure 3
Figur 3: Inokulering av CAM med svulster . (A) Aspirasjon av sfæroider med pipette og (B) implantasjon på CAM-overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

4. Påføring av fotosensibilisator

  1. Påføring av hypericin
    1. Under svak belysning, lag en 2 mM lagerløsning av hypericin ved å oppløse den i 100% dimetylsulfoksid (DMSO). Forbered en 79 μM arbeidsløsning av hypericin kort tid før eksperimentet med steril PBS eller saltoppløsning. Sørg for at den endelige konsentrasjonen av DMSO i alle løsninger alltid er under 0,2%, noe som ikke påvirker utviklingen av embryoet.
    2. Under sterile forhold, bruk et passende volum hypericinoppløsning på silikonringen. Et volum på 30 μL er tilstrekkelig til å fylle en ring med en diameter på 6 mm.
    3. Hold embryoer i en inkubator ved 37 ° C og 80% -90% fuktighet. Hypericin i en vandig løsning er fotoaktiv etter monomerisering i vevet, ca. 3 timer etter påføring på CAM.
  2. Anvendelse av hypericin med LDL, HDL eller nanopartikler som transportsystemer
    MERK: Disse transportsystemene brukes til å forbedre penetrasjonen av hypericin i celler og cellestrukturer.
    1. På grunn av lysfølsomheten, utfør alle trinnene, inkludert utarbeidelse av løsninger, under svak belysning og lagre løsningene i mørket.
    2. Forbered formuleringene hypericin-LDL og hypericin-HDL ved å blande passende mengder lipoproteiner og hypericin-stamløsninger i PBS i henhold til referanse15. Konsentrasjonen av LDL eller HDL til hypericin er 20: 115.
    3. Syntetisere polymer nanopartikler ved levende kationisk ringåpningspolymerisasjon i henhold til referanser12,13. Juster konsentrasjonen av hypericin i polymer nanopartikler med PBS til 10 μM12,13.

5. PDD og PDT

  1. Gjennomføre PDD
    1. Under sterile forhold, bruk fotosensibilisator (hypericin, hypericin-loaded polymere nanopartikler eller hypericin med lipoproteinbærer) på CAM-overflaten, med eller uten tumorceller (ED 7-9).
    2. Belys CAM ved hjelp av fiolett eksitasjonslys (skreddersydd sirkulært LED-lys på 405 nm bølgelengde) og registrer fluorescensen av hypericin i CAM-vev og tumorceller med et digitalt kamera med tidsintervaller på 0, 1, 3, 5, 24 og 48 timer etter hypericinadministrasjon.
    3. Hvis forskningen krever et bilde av CAM i hvitt lys, ta opp CAM før hypericinadministrasjon og ved slutten av forsøket, kort tid før vevfiksering, da lyset påvirker fotoaktiveringen av hypericin.
    4. Evaluer fluorescensintensiteten ved hjelp av et bildebehandlings- og analyseprogram (f.eks. ImageJ22).
      1. Del RGB-bildekanaler i separate røde, grønne og blå bilder. Analyser bildet med rød intensitet i 8-biters form. Evaluer den røde intensiteten fra området inne i ringen og tilnærm den som hypericinfluorescensen. Hent hele bildeprofilplott (ved hjelp av ImageJs Profile Plot-plugin) med forskjellige tidsintervaller etter hypericinadministrasjon (dvs. fra 0 timer, rett etter administrering, opptil 48 timer).
  2. Gjennomføre PDT
    1. Utfør PDT minst 3 timer etter påføring av hypericin.
    2. Plasser den optiske fiberen over overflaten av CAM for at laserstrålen skal dekke hele området i silikonringen.
    3. Utfør in vivo bestråling (1-2 min) med et 405 nm laserlys med en strømningshastighet på 285 mW /cm2.
    4. Ta opp CAM ved hjelp av hvitt lys og 405 nm fluorescerende lys før og etter fotodynamisk behandling (24 timer og 48 timer).
    5. Oppdag fotoskade 24 timer og 48 timer etter PDT fra bildene tatt i hvitt lys. Evaluer vaskulær skade ved en semikvantitativ score16: 1 - ingen ødeleggelse; 2 - delvis lukking av kapillærene (diameter ≤10 μm) uten ødeleggelse av middels eller større (diameter ≥50 μm) og mindre kar (diameter 10-50 μm); 3 - delvis nedleggelse av mindre fartøy med kapillærer forsvinner; 4 - delvis nedleggelse av større fartøy med mindre fartøy og kapillærer forsvinner; og 5 - total fototrombose med de fleste karene forsvinner.

Figure 4
Figur 4: Behandling av alternativ behandling med laserlys. Dette bildet ble tatt for illustrasjonsformål. For PDD eller PDT må rommet være mørkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

6. Forberedelse av CAM for videre evaluering

  1. Parafin innebygging
    1. Fest CAM-vevet i en dyrkingsplate med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS i minst 2 timer og maksimalt over natten.
    2. Fjern PFA og kutt forsiktig ut fra CAM en del av vevet i silikonringen.
    3. Dehydrer umiddelbart CAM-vevet i stigende alkoholserier som følger. Plasser CAM-vevet i 70% etanol i 3 minutter, eosinoppløsning i 2 minutter (for enklere plassering av vevet i parafinblokken), 96% etanol i 3 x 5 minutter (alltid i en ny petriskål) og 100% etanol i 5 minutter og xylen i 2 x 10 min.
    4. Bruk en slikkepott eller tynn børste til å overføre prøvene så raskt som mulig til oppløst parafin i petriskåler (59 °C). Etter 24 timer, legg vevet i histologisk form, fyll det med parafininnleggingsmedium, og la det stivne i kjøleskapet. Klipp den størknede CAM fra innebyggingsmediet, vri den 90 ° i skuffen, fyll den igjen med innebyggingsmediet og la den stivne.
    5. Forbered 5-10 μm seksjoner på en mikrotom for histopatologisk analyse for å bestemme PDT-indusert skade.
  2. Fremstilling av frosne CAM-seksjoner for histologi
    MERK: For noen metoder, inkludert histologi, er frosne seksjoner tilberedt på kryostatmikrotom mer egnet. Følg trinnene nedenfor for å klargjøre de frosne CAM-delene.
    1. Monter forsiktig innfødt eller 4% paraformaldehydfast CAM på glassglasset.
    2. Fyll innebyggingsformen til halvparten med optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) og frys i flytende nitrogen eller en blanding av tørris og etanol.
    3. Etter frysing, vipp forsiktig og skyv CAM fra glassglasset på toppen av det frosne OCT-mediet. Plasser igjen i formen, dekk til med OCT-medium og frys som i trinn 6.2.2.
  3. Fraktal analyse av vaktel CAM
    MERK: Vaskulaturendringer forårsaket av PDT kan vurderes ved å beregne fraktaldimensjonskoeffisienten19.
    1. I det laminære strømningsskapet, overløp CAM i en dyrkingsplate med en forvarmet (37 ° C) fikseringsløsning av 4% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i PBS.
    2. Fjern fikseringsløsningen etter 48 timer. Skill CAM forsiktig fra embryoet med mikrosaks og en fin børste og vask den i PBS.
    3. Monter den vasket CAM på en glasssklie og la den tørke sakte.
    4. Fotografer lysbildet ved hjelp av et digitalt kamera og en transilluminator som en kilde til homogent hvitt lys.
    5. Behandle digitale bilder ved hjelp av ImageJ-programvare22. For analysen velger du et kvadratisk område (512 × 512 piksler) fra området med distale arterielle grener. Binarisere og skeletonisere bildene og beregne fraktaldimensjonskoeffisienten (Df) etter prosedyrene beskrevet i referanse31.
  4. Molekylær analyse av CAM-vev
    1. For molekylær analyse, separer forsiktig innfødt CAM, frys i flytende nitrogen og lagre ved -80 ° C.
    2. Bestem genuttrykk i henhold til standardprotokoller for RNA-isolasjon23, revers transkripsjon til cDNA og kvantitativ PCR24.

Figure 5
Figur 5: CAM-vev for fraktalanalyse. Etter PDT er CAM festet, montert på et lysbilde og tørket for fraktalanalyse. Bildet ble tatt i hvitt lys ved hjelp av en transilluminator. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lokaliseringen av svulsten på CAM-overflaten er vanskelig i hvitt lys. Fotosensibilisator (her, hypericin) som brukes i PDD forventes å bli tatt opp selektivt av svulsten og bidrar til å visualisere svulsten. Tillegg av hypericin og bruk av fluorescerende lys (f.eks. 405 nm) viste tumorens (plateepitelkarsinom TE1) posisjon svært godt (figur 6A). Histologisk analyse viste vitale tumorceller som invaderte sunt vev. Konsentriske strukturer av unormale plateepitelceller, ofte beskrevet i plateepitelkarsinomvev (keratinperler), var synlige (figur 6B). Veksten av svulsten ble ledsaget av ødem og membrantykkelse.

Figure 6
Figur 6: Plateepitelkarsinom TE1-tumor som vokser på CAM-overflate . (A) Bildet ble tatt med hvitt lys (venstre) og 405 nm LED-lys (høyre) med tillegg av hypericin. Omfanget av tumorvekst er bedre visualisert og definert. (B) Tverrsnitt av svulsten som vokser på CAM-overflaten, med metastaser (M, keratinperler) i CAM-vevet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En fotosensibilisator og lengre eksponering av vevet med fokusert lys med høy intensitet brukes i PDT. Slik behandling påvirker CAM-vaskulatur, gir trombose, lukking av større kar og forsvinning av mindre kar og kapillærer (figur 7). Området der behandlingen ble påført (innsiden av silikonringen) ble påvirket, og det var en klar forskjell i fartøyets tetthet inne i ringen og i området rundt.

Figure 7
Figur 7: Eksempel på endringer i CAM-vaskulatur 24 timer etter PDT. Behandling med laser førte til at de fleste kapillærene forsvant, og sammenlignet fartøyets tetthet i og utenfor behandlingsområdet i silikonringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Laserlyset som ble brukt i PDT uten tilstedeværelse av fotosensibilisator, forårsaket ingen skade (figur 8, midtlinje, "kun bestråling"), sammenlignbar med kontrollen uten behandling (figur 8, topplinje, "kontroll"). Bunnlinjen på bildene viser endringer i hypericinfluorescens i tide, forårsaket av monomerisering av aggregert hypericin10. PDT ble påført etter 3 timers inkubasjon med hypericin og 2 timer senere var det allerede synlige forandringer. Det hvite lysbildet tatt 24 timer etter behandling viser omfattende skader på vaskulaturen.

Figure 8
Figur 8: Endringer i fluorescensintensitet og CAM-vaskulaturtetthet etter hypericinadministrasjon og laserbestråling (PDT). Bilder ble tatt ved 0, 1, 3, 5 og 24 timer med 405 nm lys og hvitt lys. Den øverste linjen med bilder tilsvarer kontroll uten behandling. Midtlinjen av bilder tilsvarer bare laserbestråling (dvs. uten hypericin); laserbestråling (2 min, 405 nm laserlys, fluenshastighet 285 mW/cm2) ble påført 3 timer etter hypericinadministrasjon. Bunnlinjen av bilder tilsvarer behandling med hypericin og laserbestråling (PDT); Laserbestråling ble påført etter 3 timers inkubasjon med hypericin. Bildene viser tydelig skade på CAM-vaskulaturen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

PDT påvirket CAM-vevsstrukturen negativt. Histologisk analyse (figur 9) viste at ubehandlet kontroll-alternativ behandling hadde relativt jevn tykkelse; PDT-behandling førte imidlertid til at CAM ble tynnere og mer skjøre.

Figure 9
Figur 9: Histologisk analyse av kontroll- og PDT-behandlet CAM-vev . (A) Tverrsnitt av ubehandlet kontroll-CAM. Tykkelsen på CAM er relativt jevn. (B) Tverrsnitt av alternativ behandling etter PDT-behandling. Sammenlignet med kontrollen er CAM tynnere og mer skjøre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For vellykket ex ovo-dyrking er det viktig å følge protokollen ovenfor. Videre, hvis eggene ikke åpnes forsiktig nok eller det ikke er tilstrekkelig fuktighet under dyrking, stikker eggeplommesekken til skallet og brister ofte. Starten på en ex ovo-dyrking på tidspunktet for ca. 60 timers egginkubasjon sikrer den høye overlevelsesgraden til embryoene, da de allerede er store nok til å overleve håndteringen. I de senere utviklingsstadiene blir CAM tynnere og fester seg til eggeskallet, noe som fører til membranbrudd.

Fra inkubasjonsdag 7 og utover er embryoene mindre følsomme for agitasjon; CAM-sonen dekker nesten hele overflaten av brønnen og er klar for videre eksperimenter. Selv om de døde embryoene kan representere en risiko for infeksjon, med de riktige arbeidsmetodene i minst semi-sterile forhold, påvirker de ikke de andre embryoene som lever i 6-brønnsplaten. Overlevelsesraten for vaktelen ex ovo-embryoet i de nåværende forsøkene var omtrent 80%, noe som er relativt bedre enn i kylling ex ovo-eksperimenter 25,26,27.

I de nåværende eksperimentene ble en silikonring brukt til å avgrense arbeidsområdet. Hittil er det ingen bevis tilgjengelig for at ringene alene har noen effekt på utvikling, vekst eller angiogenese av CAM-vevet28. Kohli og medarbeidere testet bruken av biomaterialer av forskjellige strukturer og sammensetninger i en kylling-CAM-modell , og blodkar ble observert i alle de testede stillasene unntatt silikon, hvor ingen blodkar ble observert å infiltrere det29. Bare uforsiktig håndtering av ringen kan forårsake blødning av CAM og redusere overlevelsen av embryoene.

På grunn av egenskapene representerer denne CAM-modellen et levedyktig, økonomisk fordelaktig alternativ til laboratoriedyr, som mus, rotter eller kaniner, spesielt for å observere vaskulaturendring under PDT30. Det er også egnet for overvåking av genuttrykksendringer og vevsendringer på histologisk nivå24. Denne naturlig immunsviktende modellen har et rikt og lett synlig vaskulært nettverk som tillater sanntidsvisualisering av analysene13,31.

Vaktelegg eggeskall er lett å åpne, og ex ovo dyrking er enkel og krever mindre plass til lagring30. Utviklingen av et vaktelembryo er kort og tillater en høy omsetning av eksperimenter. Denne raske utviklingen kan imidlertid være en ulempe i eksperimenter som krever mer tid (for eksempel for tumorutvikling og vekst), siden det eksperimentelle vinduet er maksimalt 7 dager. Blant andre ulemper ved bruk av vaktel er den mer delikate konstitusjonen av embryoet og dets følsomhet for forurensning. Den lille størrelsen på vaktel CAM begrenser anvendelsen av flere eksperimentelle stoffer10.

Hvite lysbilder kan vise større og veldefinerte svulster ganske bra, men fluorescensavbildning er et veldig attraktivt verktøy for sykdomsdeteksjon, spesielt for svært små svulster eller tumorcelleklynger32, muligens for å visualisere kantene på lesjonen. En høyere akkumulering av fotosensibilisatorer observeres i tumorområdet, så fotodynamisk diagnostikk er svært nyttig ved tidlig lokalisering eller under kirurgisk fjerning. Optiske filtre brukes også til å skaffe bildet riktig32; I det foreliggende tilfellet ble bildene imidlertid tatt uten spesielle filtre. Bruken av slik avbildning (uten blokksystem) er for eksempel i endoskopi og PDD av urinblæretumorer og gliomer, så den har en egnet klinisk anvendelse.

Til tross for noen ulemper er den japanske vaktelen CAM-analysen et flott verktøy for ny narkotikatesting og utvikling av nye biofotoniske teknikker, samt fotodynamisk diagnose og terapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Arbeidet ble støttet av VEGA 2/0042/21 og APVV 20-0129. Bidraget fra V. Huntošová er resultatet av prosjektgjennomføringen: Åpent vitenskapelig samfunn for moderne tverrfaglig forskning i medisin (Akronym: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 støttet av Operational Program Integrated Infrastructure, finansiert av ERDF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-Well Cell Culture Plate Sarstedt 83.392 Transparent polystyrene, sterile
CO2 Incubator ESCO CCL-0508 ESCO, Singapore CCL-050B-8 CO2 cell culture incubator
cryocut Leica CM 1800 Reichert-Jung, USA
digital camera Canon EOS 6D II Canon, Japan
diode laser 405 nm Ocean Optics, USA
DMSO Sigma-Aldrich 67-68-5 dimethyl sulfoxid
eosin Sigma-Aldrich 15086-94-9
ethanol Sigma-Aldrich 64-17-5
fine brush size 2 Faber-Castell 281802 brush for CAM separation and manipulation
glutaraldehyde Sigma-Aldrich 111-30-8
hematoxylin Sigma-Aldrich 517-28-2
hypericin Sigma-Aldrich 84082-80-4
incubator Bios Midi Bios SedlEquation 1any, Czech Republic Forced draught incubator for initial incubation
incubator Memmert IF160 Memmert, Germany Forced air circulation incubator for CAM incubation
Kaiser slimlite plano, LED light box Kaiser, Germany 2453 Transilluminator
LED light 405 nm custom made circular LED light
macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 Canon, Japan
microscope Kapa 2000 Kvant, Slovakia optical microscope
microtome Auxilab 508 Auxilab, Spain manual rotary microtome
paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 parafin medium for tissue embedding
PBS Sigma-Aldrich P4417 Phosphate saline buffer
scissors Castroviejo Orimed  OR66-108 micro scissors for CAM separation
software ImageJ 1.53 public domain image processing and analysis program
stock solution HDL Sigma-Aldrich 437641-10MG high density lipoproteins
stock solution LDL Sigma-Aldrich 437644-10MG low density lipoproteins
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek 4583 Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
  2. van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
  3. Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
  4. De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
  5. Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
  6. Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
  7. Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
  8. Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
  9. Miškovský, P. Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
  10. Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
  11. Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
  12. Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
  13. Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
  14. Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
  15. Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
  16. Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
  17. Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
  18. Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
  19. Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
  20. Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
  21. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
  22. Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
  24. Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
  25. Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
  26. Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
  27. Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
  28. Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
  29. Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
  30. Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
  31. Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
  32. Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).

Tags

Kreftforskning utgave 182
Quail Chorioallantoic Membrane - Et verktøy for fotodynamisk diagnose og terapi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Máčajová, M.,… More

Máčajová, M., Huntošová, V., Meta, M., Kundeková, B., Čavarga, I., Bilčík, B. Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy. J. Vis. Exp. (182), e63422, doi:10.3791/63422 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter