Nutzung von Mikro-CT-Scans zur Analyse parasitärer Pflanzen-Wirt-Interaktionen

Die hochauflösende Röntgen-Mikro-Computertomographie (Mikro-CT) ist ein bildgebendes Verfahren, bei dem mehrere Röntgenaufnahmen (Projektionen) einer Probe aus unterschiedlichen Blickwinkeln aufgenommen und später zur virtuellen Rekonstruktion der Probe verwendet werden¹. Dieses virtuelle Objekt kann dann analysiert, manipuliert und segmentiert werden, was eine zerstörungsfreie Erkundung in drei Dimensionen^{ermöglicht 2}. Ursprünglich für medizinische Analysen und später für industrielle Anwendungen konzipiert, bietet die Mikro-CT auch den Vorteil, innere Organe und Gewebe ohne invasive Eingriffe sichtbar zu machen³. Wie andere Formen der Bildgebung arbeitet auch die Mikro-CT mit einem Kompromiss zwischen Sichtfeld und Pixelgröße, was bedeutet, dass eine hochauflösende Bildgebung großer Proben nahezu unerreichbar ist⁴. Fortschritte bei der Verwendung von hochenergetischen Röntgenquellen (z. B. Synchrotron) und sekundärer optischer Vergrößerung werden ständig gemacht, so dass die kleinste Auflösung unter 100 nm erreicht^{werden kann 5,6}. Nichtsdestotrotz sind bei großen Proben längere Scanzeiten erforderlich, was die Wahrscheinlichkeit von Artefakten aufgrund von Probenbewegungen oder Verformungen im Inneren des Scanners erhöht. Darüber hinaus ist die Mikro-CT im Allgemeinen durch natürliche Dichteschwankungen innerhalb der Probe und die Art und Weise, wie die Probe mit Röntgenstrahlen interagiert, begrenzt. Während eine höhere Röntgendosis am besten geeignet ist, um dichtere Proben zu durchdringen, ist sie weniger effizient bei der Erfassung von Dichteschwankungen innerhalb und zwischen der Probe und dem umgebenden Medium⁷. Auf der anderen Seite bietet eine geringere Röntgendosis eine geringere Durchdringungsleistung und erfordert oft längere Scanzeiten, aber eine höhere Empfindlichkeit bei der Dichtedetektion⁷.

Diese Einschränkungen haben den Einsatz der Mikrotomographie für die Pflanzenwissenschaften lange Zeit behindert, da die meisten Pflanzengewebe aus leichtem (nicht dichtem) Gewebe mit geringer Röntgenabsorption bestehen⁸. Die ersten Anwendungen der Mikro-CT konzentrierten sich auf die Kartierung von Wurzelnetzwerken innerhalb der Bodenmatrix ^9,10. Später wurden Pflanzenstrukturen mit deutlicheren Unterschieden in der Gewebedichte, wie z. B. Holz, erforscht. Dies ermöglichte Untersuchungen der Xylemfunktionalität^11,12, der Entwicklung komplexer Gewebeorganisationen 13,14 und der Interaktionen zwischen Pflanzen^15,16,17. Die Analyse von weichem und homogenem Gewebe wird durch Kontrastmittel, die heute zum Standardverfahren in Präparaten für die Mikro-CT-Untersuchung von Pflanzenproben gehören, immer weiter verbreitet. Protokolle für die Kontrastmitteleinbringung können jedoch je nach Probenvolumen, strukturellen Eigenschaften und Art der verwendeten Lösung zu unterschiedlichen Ergebnissen führen⁸. Im Idealfall sollte das Kontrastmittel die Unterscheidung zwischen verschiedenen Geweben verbessern, eine Bewertung der Gewebe-/Organfunktionalität ermöglichen und/oder biochemische Informationen über ein Gewebe liefern¹⁸. Daher ist eine angemessene Probenbehandlung, -vorbereitung und -montage vor dem Scannen für jede Mikro-CT-Analyse von entscheidender Bedeutung.

Mikro-CT des parasitären Pflanzenhaustoriums
Parasitäre Blütenpflanzen stellen eine eigene funktionelle Gruppe von Angiospermen dar, die durch ein Organ gekennzeichnet ist, das als Haustorium¹⁹ bekannt ist. Dieses mehrzellige Organ, ein Entwicklungshybrid zwischen einem modifizierten Stamm und einer Wurzel, wirkt auf die Anheftung, das Eindringen und den Kontakt des Wirts durch einen Parasiten²⁰. Aus diesem Grund wird davon ausgegangen, dass das Haustorium "die Idee des Parasitismus unter den Pflanzen verkörpert"²¹. Ein detailliertes Verständnis der Entwicklung, Struktur und Funktionsweise dieses Organs ist entscheidend für die Ökologie, Evolution und Managementstudien parasitärer Pflanzen. Dennoch erschweren die Gesamtkomplexität der parasitären Pflanzen und die stark veränderte Struktur und Haustorien oft eine detaillierte Analyse und einen Vergleich. Auch die Haustoriumverbindungen sind in der Regel umfangreich und in der Gewebe- und Zellverteilung nicht homogen (Abbildung 1). In diesem Zusammenhang ermöglicht die Arbeit mit kleinen Gewebefragmenten zwar eine einfachere Manipulation und höhere Auflösung, kann aber zu falschen Rückschlüssen auf die dreidimensionale Architektur komplexer Strukturen, wie z.B. der parasitären Pflanze Haustorium, führen.

Obwohl es für die meisten parasitären Pflanzenarten eine umfangreiche Literatur über die Anatomie und Ultrastruktur des Haustoriums gibt, ist die dreidimensionale Organisation und die räumliche Beziehung zwischen Parasiten- und Wirtsgewebe noch wenig erforscht¹⁷. In einer kürzlich erschienenen Arbeit von Masumoto et ^al.22 wurden über 300 serielle halbdünne Mikrotomschnitte abgebildet und zu einem dreidimensionalen virtuellen Objekt rekonstruiert, das das Haustorium zweier Parasitenarten darstellt. Der hohe Detaillierungsgrad dieser Methode ermöglicht noch nie dagewesene Einblicke in die zelluläre und anatomische 3D-Struktur des Haustoriums. Eine derart zeitaufwändige Technik würde jedoch eine ähnliche Analyse bei Parasiten mit umfangreicheren Haustoriumverbindungen verbieten. Der Einsatz der Mikro-CT erweist sich als hervorragendes Werkzeug für die dreidimensionale Analyse komplexer und oft sperriger Haustorien parasitärer Pflanzen. Obwohl sie kein Ersatz für detaillierte anatomische Schnitte und andere ergänzende Formen der mikroskopischen Analyse^{sind 17,23}, können die durch Mikro-CT-Scans erhaltenen Ergebnisse, insbesondere bei großen Proben, auch als Leitfaden für die Unterprobenahme kleinerer Segmente dienen^, die dann mit anderen Instrumenten wie Konfokal- und Elektronenmikroskopie analysiert oder mit hochauflösenden Mikro-CT-Systemen erneut analysiert werden können.

Abbildung 1: Parasitische Pflanzen verschiedener funktioneller Gruppen, die in diesem Protokoll verwendet werden. Euphytoide Parasit Pyrularia pubera (A), Endoparasit Viscum minimum (B) mit grünen Früchten (gestrichelter schwarzer Kreis), parasitische Rebe Cuscuta americana (C), Mistel Struthanthus martianus (D), obligater Wurzelparasit Scybalium fungiforme (E). Segmente der Wirtswurzel (Hr) oder des Stammes (Hs) erleichtern die Anwendung von Kontrastmitteln in das Haustorium des Parasiten (P). Das Vorhandensein der Mutterwurzel/des Stammes des Parasiten (Pfeile) in der Probe ermöglicht die Analyse der Organisation der Haustoriumgefäße. Rechtecke kennzeichnen Segmente der Stichprobe, die für die Analyse verwendet werden. Maßstabsleisten = 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Da die Mikro-CT zu einer immer beliebteren Technik in den Pflanzenwissenschaften wird, gibt es Leitfäden, Protokolle und Literatur, die sich mit dem Scannen von Proben, der dreidimensionalen Rekonstruktion, der Segmentierung und der Analyse befassen ^3,10,24. Daher werden diese Schritte hier nicht besprochen. Wie bei jeder bildgebenden Technik ist die angemessene Behandlung und Einbettung von Proben von grundlegender Bedeutung, auch wenn sie oft übersehen wird. Aus diesem Grund konzentriert sich dieses Protokoll auf die Vorbereitung von Haustoriumproben für Mikro-CT-Scans. Genauer gesagt beschreibt dieses Protokoll zwei Ansätze zur Einbringung von Kontrastmitteln in Haustoriumproben, um die Visualisierung verschiedener Gewebe und Zelltypen im Haustorium zu verbessern, die Detektion von parasitärem Gewebe innerhalb der Wirtswurzel/des Stammes zu erleichtern und die Parasit-Wirt-Gefäßverbindungen in drei Dimensionen zu analysieren. Die hier beschriebenen Präparate können auch an die Analyse anderer Pflanzenstrukturen angepasst werden.

Fünf Arten wurden verwendet, um die Zweckmäßigkeit des hier beschriebenen Protokolls besser zu veranschaulichen. Jede Art repräsentiert eine der fünf funktionellen Gruppen parasitärer Blütenpflanzen und spricht damit spezifische Punkte an, die mit der Funktionalität jeder Gruppe zusammenhängen. Pyrularia pubera (Santalaceae) wurde ausgewählt, um euphytoide Parasiten darzustellen, die im Boden keimen und mehrere Haustorien bilden, die den Parasiten mit den Wurzeln seiner Wirte verbinden²⁵. Die von diesen Pflanzen erzeugten Haustorien sind oft dünn und lassen sich leicht vom Wirt²⁶ (Fig. 1A) abreißen, was einen schonenderen Handhabungsprozess erfordert. Endoparasiten werden hier durch Viscum minimum (Viscaceae) repräsentiert. Spezies dieser funktionellen Gruppe sind außerhalb des Körpers ihrer Wirte nur für kurze Zeit sichtbar (Abbildung 1B) und leben den größten Teil ihres Lebenszyklus als deutlich reduzierte und myzelartige Zellstränge, die in Wirtsgewebe eingebettet sind²⁵. Eine dritte funktionelle Gruppe umfasst parasitäre Reben, die am Boden keimen, aber nur rudimentäre Wurzeln bilden und auf mehrere Haustorien angewiesen sind, die an den Stängeln der Wirtspflanzen^{ansetzen 25} (Abbildung 1C). Hier wird diese funktionelle Gruppe durch Cuscuta americana (Convolvulaceae) repräsentiert. Im Gegensatz zu parasitären Reben keimen Misteln direkt an den Zweigen ihrer Wirtspflanzen und entwickeln entweder mehrere oder einzelne Haustorien²⁵. Die Art, die zur Veranschaulichung dieser funktionellen Gruppe ausgewählt wurde, ist Struthanthus martianus (Loranthaceae ), die verschiedene Verbindungen mit dem Wirtszweig eingeht (Abbildung 1D). Die Analyse solitärer Mistelhaustorien mit einer Kombination aus Mikro-CT und Lichtmikroskopie findet sich in Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Zu den obligaten Wurzelparasiten schließlich gehören Arten, die am Boden keimen und in die Wurzeln von Wirtspflanzen eindringen, von denen sie von den frühesten Wachstumsstadien an vollständig abhängig sind²⁵. Diese Pflanzen sind hier durch Scybalium fungiforme (Balanophoraceae) vertreten, die große knollenartige Haustorien bilden (Abbildung 1E).

Alle Pflanzenproben, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden in einem 70%igen Formalinessigsäurealkohol (FAA 70) fixiert. Die Fixierung auf die Probenahme ist entscheidend für die Konservierung von Pflanzengeweben, insbesondere wenn nachträgliche anatomische Analysen erforderlich sind. Auch beim parasitären Pflanzenhaustorium ist eine Fixierung unumgänglich, da dieses Organ oft hauptsächlich aus nicht verholzten Parenchymzellen besteht²⁰. Detaillierte Protokolle für die Fixierung von Pflanzengewebe, einschließlich der Herstellung von Fixierlösungen, finden Sie an anderer Stelle²⁷. Andererseits können Fixiermittel mehr oder weniger zu Veränderungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften einer Probe führen, so dass sie für spezifische biomechanische und histochemische Analysen ungeeignet ist. Somit können mit diesem Protokoll auch frische Proben, d.h. nicht fixiertes Material, das unmittelbar vor der Aufbereitung gesammelt wurde, verwendet werden. Details zum Umgang mit neuen Proben und Vorschläge zur Fehlerbehebung bei fixiertem Material finden Sie im Abschnitt "Diskussion".

1. Auswahl parasitärer Pflanzenproben

1. Sammeln Sie das gesamte parasitäre Pflanzenhaustorium, einschließlich des angehängten Wirtsstamms/der Wurzel und der Segmente der proximalen und distalen Enden des parasitierten Wirtsorgans. Die ideale Länge jedes Segments entspricht dem doppelten Durchmesser des Haustoriums.
   HINWEIS: Fügen Sie bei seitlichen Haustorien einen Teil des Mutterstamms/der Wurzel des Parasiten hinzu, aus dem das Haustorium gebildet wurde (Abbildung 1A,B,D). Sammeln Sie bei Endoparasiten ein Segment des Wirtsstamms/der Wirtswurzel, in dem Anzeichen des Parasiten sichtbar sind (Abbildung 1B). Bei Klemmenanschlüssen sollte die gesamte Anlage gesammelt werden (Bild 1E).
2. Tauchen Sie die gesamte Probe in Fixierlösung (z. B. FAA) in einem volumetrischen Verhältnis von 1:10 (Probe: Fixiermittel). Lassen Sie die Proben je nach Größe der Probe mindestens 1 Tag im Fixiermittel²⁷.
   HINWEIS: Die Proben können vor dem Scannen in einem Fixiermittel gelagert oder in eine Konservierungslösung (z. B. Ethanol 70%) überführt werden. Frische Proben können auch verwendet werden, wenn die anschließende anatomische Analyse nicht gerechtfertigt ist (siehe Abschnitt Diskussion). Wenn Sie mit frischem Material arbeiten, stellen Sie die Apparatur für die Perfusion der Kontrastlösung ein und entnehmen Sie dann die Probe. Die Probe darf nicht austrocknen.

2. Anwendung kontrastierender Lösungen

1. Wählen Sie die zu verwendende Anwendungsmethode. Verwenden Sie die Vakuummethode (Schritt 2.3) für kleine (Abbildung 1A) oder nicht holzige (Abbildung 1B) Proben. Verwenden Sie die Perfusionsmethode für größere Proben, vorausgesetzt, sie enthält ein Segment des Stammes/der Wurzel des Wirts (Abbildung 1A, C-E).
2. Tragen Sie Gummihandschuhe und andere geeignete persönliche Schutzausrüstung (z. B. Laborkittel), wenn Sie die Probe manipulieren, unabhängig davon, welchen Ansatz Sie in den folgenden Schritten gewählt haben.
   ACHTUNG: Alle kontrastierenden Lösungen enthalten Schwermetallsalze in ihrer Zusammensetzung und sollten daher nicht ohne angemessene persönliche Schutzausrüstung und unter einem Abzug gehandhabt werden.
3. Befolgen Sie für die Vakuummethode die unten aufgeführten Schritte.
   1. Wählen Sie eine geeignete Durchstechflasche aus und beschriften Sie sie. Die Durchstechflasche muss groß genug sein, um die Probe und die kontrastierende Lösung aufzunehmen, in der Regel in einem Verhältnis von 1:10. Überprüfen Sie die Anweisungen des Herstellers, um sicherzustellen, dass die Durchstechflasche einem niedrigen bis mäßigen Vakuum standhält.
      Anmerkungen: Füllen Sie die Durchstechflasche nicht bis zum Rand, da der Unterdruck (Vakuum) dazu führen kann, dass die Flüssigkeit verschüttet wird.
   2. Die Probe wird in die Durchstechflasche mit der kontrastierenden Lösung (1 % Jod oder 3 % Phosphowolframat, siehe Materialtabelle) gegeben. Stellen Sie dann die Durchstechflasche in eine Vakuumkammer oder einen Exsikkator, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist. Entfernen Sie den Deckel von der Durchstechflasche und schließen Sie dann die Vakuumkammer oder den Exsikkator.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Vakuumkammer/der Exsikkator keine Risse aufweist und dass die Vakuumpumpe über genügend Öl verfügt.
   4. Schließen Sie das Abluftventil der Pumpe, um zu verhindern, dass Luft austritt, und öffnen Sie das Abluftventil der Kammer/des Exsikkators, um die Luft herauszudrücken.
   5. Schalten Sie die Pumpe ein und warten Sie, bis der Druck ca. 20" Hg erreicht.
      ACHTUNG: Dieser Vorgang ist in der Regel schnell, lassen Sie das Vakuumsystem also nicht unbeaufsichtigt.
      Anmerkungen: Während die metrische Systemeinheit für den Druck Pascal (Pa) ist, zeigen die Manometer in den meisten Laborvakuumpumpen den Druck in Zoll Quecksilber ("Hg"), Pfund pro Quadratzoll (psi) oder bar an. 20" Hg entspricht ca. 67,7 Pa, 10 psi oder 0,7 bar.
   6. Schließen Sie das Auslassventil der Kammer/des Exsikkators, um ein erneutes Eindringen von Luft zu verhindern, und schalten Sie die Pumpe dann schnell aus.
   7. Lassen Sie die Probe mindestens 2 h unter Vakuum; Größere Proben benötigen länger, bis die kontrastierende Lösung in sie eindringen kann.
   8. Nach der gewünschten Zeit wird die Probe aus der kontrastierenden Lösung entnommen, um sie für das Scannen vorzubereiten.
   9. Öffnen Sie langsam das Absaugventil der Kammer/des Exsikkators, damit Luft eindringen kann.
   10. Warten Sie, bis der Druck in der Kammer/im Exsikkator vollständig erschöpft ist (d. h. das Manometer nahe 0 reicht), und öffnen Sie es dann vorsichtig, um die Probe zu entnehmen.
   11. Verwerfen Sie die kontrastierende Lösung entsprechend und bewahren Sie die Probe für das Scannen auf.
4. Befolgen Sie für die Perfusionsmethode die unten aufgeführten Schritte.
   1. Wählen Sie einen Vorratstank für die kontrastierende Lösung entsprechend der Größe der Probe aus. Verwenden Sie eine 50-ml-Spritze (ohne Nadel oder Kolben) für kleine Proben (Abbildung 2A) oder ein 1-Liter-Notfallset für große Proben (Abbildung 2B).
   2. Verbinden Sie ein Ende eines transparenten Kunststoffschlauchs (siehe Materialtabelle) mit dem Vorratsbehälter und verbinden Sie dann das andere Ende mit einem Zweiwege- oder Dreiwegeventil. Schließen Sie einen zweiten Schlauch an einen anderen Auslass im Ventil an (Abbildung 2A,B).
   3. Befestigen Sie den Vorratsbehälter an einer erhöhten Position, ohne das im vorherigen Schritt eingerichtete Gerät zu zerlegen.
      Anmerkungen: Der vertikale Abstand zwischen dem Tank und der Probe bestimmt den Perfusionsdruck der Lösung (Abbildung 2B). Ein Abstand von 20-50 cm reicht für kleine Proben. Für große Proben ist ein Abstand von 1 m ausreichender.
   4. Schließen Sie das Dreiwegeventil (Abbildung 2C) oder das Zweiwegeventil (Abbildung 2D), um zu verhindern, dass Flüssigkeit aus dem Schlauchsystem austritt, und gießen Sie dann die kontrastierende Lösung in den Vorratstank. Wenn Sie ein intravenöses medizinisches Set verwenden, füllen Sie den Beutel mit der Lösung und schließen Sie das Ventil, bevor Sie das Gerät an einer erhöhten Position befestigen.
   5. Stellen Sie sicher, dass sich entlang des Schlauchsystems keine großen Luftblasen bilden (Abbildung 2E). Falls erforderlich, lassen Sie die Kontrastlösung aus dem Schlauch fließen, bis die Blase entfernt ist. Schließen Sie das Ventil wieder und lassen Sie das Gerät an Ort und Stelle.
   6. Um die Probe für die Perfusion der Kontrastlösung vorzubereiten, tauchen Sie sie in Flüssigkeit (Wasser, Ethanol oder Fixiermittel) und schneiden Sie die Spitze des proximalen Endes des Wirtsstamms/der Wurzel in der Probe ab (Abbildung 2F).
   7. Nehmen Sie die Probe aus der Flüssigkeit, in der sie gelagert wurde, und wickeln Sie sie in eine Paraffinfolie ein, um ein Austrocknen zu vermeiden. Bewahren Sie die Probe in der Nähe und für den Anschluss an das Gerät auf.
   8. Öffnen Sie vorsichtig das Ventil, damit die kontrastierende Lösung langsam fließen kann, und füllen Sie den mit dem Tank verbundenen Kunststoffschlauch, während Sie das offene Ende des Systems in einer leicht erhöhten Position halten, um ein Verschütten der kontrastierenden Lösung zu verhindern. Achten Sie auch hier darauf, dass sich keine großen Luftblasen entlang des Schlauchs bilden.
   9. Verbinden Sie das proximale Ende des Wirtsstamms/der Wirtswurzel in der Probe mit dem offenen Ende des Schlauchsystems (Abbildung 2B, vergrößerter Bereich). Vermeiden Sie es, während dieses Schritts Luftblasen in das System einzuführen. Falls erforderlich, trennen Sie die Probe vom Gerät und entfernen Sie Luftblasen aus dem System, indem Sie die Lösung fließen lassen.
   10. Lassen Sie die Probe an das Gerät angeschlossen und legen Sie sie in einen Behälter, um ein Auslaufen der kontrastierenden Lösung in den Bereich zu vermeiden, in dem das Experiment aufgebaut wurde. Verwenden Sie Schläuche mit unterschiedlichen Durchmessern, Kunststoffkabelbinder und Ventiladapter (Abbildung 2G), um sicherzustellen, dass alle Anschlüsse im Gerät gut sitzen, Wirtszweige unterschiedlicher Größe aufnehmen können und dass die Lösung nicht aus dem Schlauchsystem austritt (Abbildung 2B, vergrößerter Bereich).
   11. Lassen Sie die Lösung die Probe mindestens 2 Stunden lang durchbluten oder bis sich die Lösung im Behälter ansammelt.
   12. Schließen Sie das Ventil und trennen Sie die Probe vorsichtig vom Gerät. Lassen Sie den Rest der Lösung in den Behälter ab und entsorgen Sie ihn ordnungsgemäß.
   13. Entfernen Sie die Paraffinfolie von der Probe, um sie für das Scannen vorzubereiten.

Abbildung 2: Perfusionsansatz für die Kontrastmittelapplikation. Kleine (A) und große (B) Versionen der Perfusionsapparatur umfassen einen Vorratsbehälter (st) und zwei Kunststoffschläuche (t1 und t2), die durch ein Ventil (va) verbunden sind. Das proximale Ende des Wirtsstammes (H), an dem ein Parasit (P) über das Haustorium (ha) befestigt ist, ist mit dem offenen Ende des Systems (B, expandiert) verbunden. Ein Dreiwegeventil (C) oder ein Zweiwegeventil (D) wird verwendet, um die Bildung von Luftblasen im Inneren des Schlauchsystems zu verhindern, die den Durchgang der kontrastierenden Lösung (E) blockieren. Die Spitze des proximalen Endes des Wirtsschaftes (H) wird unter Wasser durchtrennt, um den Durchgang der Kontrastmittellösung (F) zu ermöglichen. Kabelbinder, Ventiladapter und Schläuche mit unterschiedlichen Durchmessern helfen, festere Verbindungen zu sichern und Leckagen im System zu vermeiden (G). Die Abbildungen 2B, D und F wurden mit BioRender erstellt. Maßstabsleisten = 2 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Probenvorbereitung und -montage

1. Waschen Sie die Probe, indem Sie sie 2 Minuten lang in Wasser tauchen.
   VORSICHT: Waschen Sie die Proben nicht in der Spüle, da alle kontrastierenden Lösungen Schwermetallsalze in ihrer Zusammensetzung enthalten. Betrachten Sie das zum Waschen verwendete Wasser als verdünnte kontrastierende Lösung und entsorgen Sie es ordnungsgemäß.
2. Legen Sie die Probe bei Raumtemperatur in ein Papiertuch, damit überschüssiges Wasser je nach Größe der Probe 2-5 Minuten lang verdunsten kann. Alternativ können Sie die Probe mit Hilfe eines Papiertuchs leicht abtrocknen. Lassen Sie die Probe nicht vollständig austrocknen.
3. Wickeln Sie die Probe in eine Paraffinfolie ein, indem Sie sie zu einer dünnen Schicht dehnen. Vermeiden Sie es, die Paraffinfolie auf die Probe zu falten.
4. Montieren Sie die eingewickelte Probe auf einem Probenhalter und halten Sie sie stabil und in Position, während sie sich während des Scannens dreht. Verwenden Sie Klebeband, Schaumstoff mit geringer Dichte, Pipettenspitzen und/oder durchsichtige Kunststoffbehälter, um die Probe an Ort und Stelle zu befestigen.
5. Scannen Sie die Probe und analysieren Sie die Bilder gemäß den spezifischen Protokollen und Richtlinien, die für das verfügbare Mikro-CT-System festgelegt wurden.

Das Haustorium parasitischer Pflanzen ist ein komplexes Organ, das aus verschiedenen Geweben und Zelltypen besteht, die sich mit dem Gewebe einer anderen Pflanze verflechten und verbinden, die als Wirt verwendet wird20. Mikro-CT-Scans können genutzt werden, um diese komplexe Struktur auf zerstörungsfreie und dreidimensionale Weise besser zu verstehen, wenn sowohl kleine (Abbildung 1A-C) als auch große (Abbildung 1D,E) Haustorien analysiert werden. Dazu können kontrastierende Lösungen in die Parasit-Wirt-Grenzfläche eingebracht werden, wodurch es möglich wird, Proben zu analysieren, die sonst eine geringe und homogene Röntgenabsorption aufweisen würden. Die beiden einfachen Ansätze, die in diesem Protokoll beschrieben werden, beruhen auf der Druckbeaufschlagung der kontrastierenden Lösung, um das Eindringen durch die Probe zu beschleunigen. Erwartungsgemäß funktionieren die hier beschriebenen Protokolle für verschiedene Mikro-CT-Systeme. Die Scaneinstellungen und -parameter unterscheiden sich jedoch je nach System und analysierter Probe (Tabelle 1).

Tabelle 1: Scan-Einstellungen und -Parameter für die analysierten Proben.

In Anlehnung an den ersten Ansatz zur Kontrastmittelapplikation (Schritt 2.3) wurde das Haustorium des euphytoiden Parasiten P. pubera mit einer 3%igen Phosphowolframatlösung zwei Stunden lang im Vakuum perfundiert. Die Probe wurde dann in einem 3D-Röntgenmikroskop (XRM) gescannt (siehe Materialtabelle), wobei eine hohe Bildauflösung durch sekundäre optische Vergrößerung4 erreicht wurde. XRM-Bilder erwiesen sich als genauso effektiv wie anatomische Schnitte, die unter einem Lichtmikroskop analysiert wurden, um die Gewebeorganisation und -topologie an der Grenzfläche zwischen Parasit und Wirt zu analysieren (Abbildung 3). Die Verwendung von Phosphowolframat unterstreicht die Fülle an Parenchymgewebe, das aufgrund der hohen Absorption des Kontrastmittels in einem hellen Weißton erscheint. Die Gefäße erscheinen aufgrund der geringen Kontrastabsorption in einem dunklen Grauton. Anhand dieses Farbunterschieds ist es möglich, die Häufigkeit von Parenchymen zu beobachten, die den vaskulären Kern des Haustoriums umgeben (Abbildung 3). Die komplizierten Gefäße und dünnen Parenchymstränge des Gefäßkerns selbst werden ebenfalls beobachtet, insbesondere in Längsschnitten (Abbildungen 3A-C). Im Querschnitt ist der Gefäßkern leicht als zwei durch Parenchym getrennte Gefäßstränge zu erkennen (Abbildungen 3D,E).

Abbildung 3: Haustorium des euphytoiden Parasiten. Längsschnitte (A-C) und Transversale (D-E) Schnitte durch das Haustorium wurden unter einem Lichtmikroskop (A,E) und mittels 3D-Röntgenmikroskopie nach Applikation von 3%iger Phosphowolframatlösung im Vakuum (B-D) beobachtet. Rote Umrisse stehen für Parenchymgewebe (par) und blaue Umrisse für den Gefäßkern (vc). Hx: Wirts-Xylem. Hb: Wirtsrinde. Maßstabsbalken = 500 μm (A, E) und 2,5 cm (B-D; Voxelgröße = 2,8382 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der gleiche Ansatz wurde verwendet, um Kontrast in den Stängel einer sukkulenten Wirtspflanze (Euphorbia polygona, Cactaceae) einzubringen, die von V. minimum parasitiert wurde. Hier wurde 1%ige Jodlösung als Kontrastmittel gewählt, basierend auf einer vorläufigen histochemischen Analyse, die zeigte, dass Parenchymzellen des Endoparasiten Kohlenhydrate in Form von Stärke speichern (Abbildung 4A). Gleichzeitig speichern Zellen in der Wirtsrinde keine nachweisbare Menge an Stärke (Abbildung 4B-D). Nach der Kontrastmittelapplikation wurde die Probe dann mit einem Nikon X-Tek Mikro-CT-System gescannt (siehe Materialtabelle). Der Unterschied in der Jodaufnahme ermöglichte den Nachweis des komplizierten Netzes kortikaler Stränge, das vom Endoparasiten im Wirtskörper gebildet wird (Abbildung 4E). Nach dieser Methodik wurde beobachtet, dass sich kortikale Stränge um das vaskuläre Zentrum des Wirts konzentrieren und sich schließlich in Richtung der Peripherie des Wirtsstamms verzweigen, wenn sie mit dem Auftauchen einer parasitären Blüte assoziiert werden (Abbildungen 4F, G).

Abbildung 4: Gewebenetzwerk der Endoparasiten. Anatomische (A) und Makroschnitte (B-D) zeigen eine Reaktion mit 1%iger Jodlösung, was darauf hinweist, dass Stärke (schwarz gefärbt) im Parenchym (par) vorhanden ist, das mit den Gefäßen (ve) des Parasiten verbunden ist. Da Stärke im Wirtskortex (Hc) und Xylem (Hx) fehlt, wurden selektiv 1%ige Jodlösungen verwendet, um den Kontrast des kortikalen Stranggewebes des Parasiten (violette Umrisse, E-G) vor dem Wirtshintergrund (H) zu erhöhen. Das Vorhandensein einer Blüte (Pf) bestätigt, dass das gefärbte Gewebe Teil der Endoparasitenstruktur (A,F,G) ist. Maßstabsleisten = 0,25 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Bei dem zweiten Ansatz, der hier beschrieben wird (Schritt 2.4), wird ein Vorratsbehälter, der die kontrastierende Lösung enthält, von dem Niveau angehoben, in dem die Probe platziert wird, wodurch die Schwerkraft genutzt wird, um den Durchgang der Lösung durch die Probe zu steuern. Nach der Kontrastmittelperfusion wurde die Untersuchung mit einem Bruker Skycan Mikro-CT-System durchgeführt (siehe Materialtabelle). Die Ergebnisse von C. americana (Abbildungen 5A, B) und S. martianus (Abbildungen 5C-G) verdeutlichen die Bequemlichkeit dieses Ansatzes sowohl für kleine als auch für große Proben. Der Vergleich von Proben, die vor (Abbildung 5C, E) und nach (Abbildung 5D,F) Perfusion von 1%iger Jodlösung gescannt wurden, unterstreicht die Bedeutung der Kontrastmittelapplikation auch in holzigen Haustoriumproben. Bemerkenswert ist, dass Parasiten in den Assoziationen zwischen C. americana und S. martianus (Abbildung 5) und ihren jeweiligen Wirten wenig bis gar keinen Stärkegehalt in ihrem Gewebe aufweisen. Dies erklärt die unterschiedlichen Ergebnisse, die für den Endoparasiten V. minimum (Abbildung 4) beschrieben wurden, bei denen die gleiche Methode und Art der Kontrastlösung verwendet wurde.

Abbildung 5: Schmarotzerisches Reben- und Mistelhaustorium. Längsschnitte durch das Haustorium einer parasitären Rebe (A,B) und einer Mistel (C-G). Der Vergleich zwischen Scan und Makroschnitt von frischem Material zeigt, dass die komplizierte Haustoriumstruktur in Mikro-CT-Scans gut erfasst wird (A,B). Der Vergleich zwischen fixierten Proben vor (C,E) und nach (D,F) der Perfusion von 1%iger Jodlösung zeigt, dass der Kontrast auch in verholzten Proben erhöht ist, was die Beobachtung von Parasitenstrukturen (P) wie Gefäßen in der Epikortikalwurzel (rosa Pfeilspitzen), Gefäßsträngen (blaue Pfeilspitzen) und Senker (gelbe Pfeilspitze) erleichtert. Gefäße und Jahresringe des Wirtsxylems (Hx) und der Stärke in der Wirtsrinde (Hb) sind ebenfalls leichter zu beobachten. Maßstabsleisten = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ein Endergebnis, das mit dem hier beschriebenen Perfusionsprotokoll erzielt wird, ist die Möglichkeit, vaskuläre Verbindungen zwischen Parasiten und Wirtspflanzen zu erkennen. Dies wurde erreicht, indem eine 0,2%ige Bleinitratlösung durch ein Segment der Wirtswurzel perfundiert wurde, um das sich die Knolle des obligaten Wurzelparasiten S. fungiforme entwickelt hatte. Nach der Kontrastmittelapplikation wurde auch das Scannen mit einem Bruker Skyscan Mikro-CT-System durchgeführt (siehe Materialtabelle). Sequenzielle Projektionen zeigen, dass sich Gefäße in der Wirtswurzel in die Parasitenknolle gabeln (Abbildung 6A-C). Nach der Analyse dieser Ergebnisse wurde dieselbe Probe in eine kleinere Teilprobe zerlegt, für anatomische Untersuchungen vorbereitet und lichtmikroskopisch analysiert. Die serielle Schnittung dieser Teilprobe bestätigt, dass die Xylem-Kontinuität zwischen den beiden Anlagen durch die Verbindung von Gefäß zu Behälter über Perforationsplatten gebildet wird (Abbildung 6D-F).

Abbildung 6: Obligater Wurzelparasit Haustorium. Längsschnitte durch das Haustorium, wie sie durch Mikro-CT-Scans (A-C) und anatomische Schnitte unter dem Lichtmikroskop (D-F) beobachtet wurden. Die Akkumulation von 0,2%iger Bleinitratlösung im Gefäßsystem der Wirtswurzel (Hr, rosa Umriss) ermöglicht die Beobachtung von Wirtsgefäßen, die sich innerhalb der Parasitenröhre (Pt) verzweigen, und den Nachweis einer direkten vaskulären Verbindung zwischen den beiden Pflanzen (gestrichelter weißer Umriss). Maßstabsbalken = 1 cm (A-C) und 500 μm (D-F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der Autor hat nichts zu verraten.