Entwicklung von Organoiden aus der Hypophyse der Maus als In-vitro-Modell zur Erforschung der Hypophysenstammzellbiologie

Die Hypophyse ist eine winzige endokrine Drüse, die sich an der Basis des Gehirns befindet, wo sie mit dem Hypothalamus verbunden ist. Die Drüse integriert periphere und zentrale (hypothalamische) Eingänge, um eine abgestimmte und koordinierte Hormonfreisetzung zu erzeugen, wodurch nachgeschaltete endokrine Zielorgane (wie Nebennieren und Gonaden) reguliert werden, um geeignete Hormone zum richtigen Zeitpunkt zu produzieren. Die Hypophyse ist der Schlüsselregulator des endokrinen Systems und wird daher zu Recht als Masterdrüse¹ bezeichnet.

Die Hypophyse der Maus besteht aus drei Lappen (Abbildung 1), d. h. dem Vorderlappen (AL), dem Zwischenlappen (IL) und dem hinteren Lappen (PL). Die große endokrine AL enthält fünf hormonelle Zelltypen, einschließlich Somatotropen, die Wachstumshormon (GH) produzieren; Lactotrope, die Prolaktin erzeugen (PRL); Kortikotrope, die das adrenocorticotrope Hormon (ACTH) absondern; Thyreotrope, die für die Produktion von Schilddrüsen-stimulierenden Hormonen (TSH) verantwortlich sind; und Gonadotrope, die luteinisierendes Hormon (LH) und follikelstimulierendes Hormon (FSH) bilden. Die PL besteht aus axonalen Projektionen aus dem Hypothalamus, in denen die Hormone Oxytocin und Vasopressin (antidiuretisches Hormon) gespeichert sind. Das IL befindet sich zwischen dem AL und dem PL und beherbergt Melanotrope, die Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH) produzieren. In der menschlichen Hypophyse bildet sich die IL während der Entwicklung zurück, und Melanotrope werden innerhalb der AL¹ verteilt. Neben den endokrinen Zellen enthält die Hypophyse auch einen Pool von Stammzellen, die im Wesentlichen durch den Transkriptionsfaktor SOX2 2,3,4,5,6 gekennzeichnet sind. Diese SOX2⁺-Zellen befinden sich in der Randzone (MZ), der Epithelauskleidung der Spalte (ein embryonales Restlumen zwischen AL und IL), oder sind als Cluster über das Parenchym des AL verteilt, wodurch zwei Stammzellnischen in der Drüse vorgeschlagen werden (Abbildung 1) ^2,3,4,5,6.

Angesichts der unverzichtbaren Natur der Hypophyse ist eine Fehlfunktion der Drüse mit einer schweren Morbidität verbunden. Hyperpituitarismus (gekennzeichnet durch Übersekretion eines oder mehrerer Hormone) und Hypopituitarismus (fehlerhafte oder fehlende Produktion eines oder mehrerer Hormone) können durch neuroendokrine Hypophysentumoren (PitNETs; z. B. ACTH-produzierende Tumoren, die zur Morbus Cushing führen) oder durch genetische Defekte (z. B. GH-Mangel, der zu Zwergwuchs führt) verursacht ^werden7. Darüber hinaus sind Hypophysenchirurgie (z. B. zur Entfernung von Tumoren), Infektionen (z. B. Hypothalamus-Hypophysen-Tuberkulose oder Infektionen nach bakterieller Meningitis oder Enzephalitis), Sheehan-Syndrom (Nekrose aufgrund unzureichender Durchblutung aufgrund von starkem Blutverlust bei der Geburt), Hypophysenapoplexie und traumatische Hirnverletzung weitere wichtige Ursachen für die Hypophysenunterfunktion⁸ . Es wurde gezeigt, dass die Hypophyse der Maus die Regenerationsfähigkeit besitzt und in der Lage ist, lokale Schäden zu reparieren, die durch transgene Ablation endokriner Zellen verursacht werden ^9,10. Die SOX2⁺-Stammzellen reagieren akut auf die zugefügte Verletzung und zeigen einen aktivierten Phänotyp, der durch eine erhöhte Proliferation (was zu einer Stammzellexpansion führt) und eine erhöhte Expression von stammesbedingten Faktoren und Signalwegen (z. B. WNT / NOTCH) gekennzeichnet ist. Darüber hinaus beginnen die Stammzellen, das abgetragene Hormon zu exprimieren, was schließlich zu einer erheblichen Wiederherstellung der erschöpften Zellpopulation über die folgenden (5 bis 6) Monate ^9,10 führt. Auch während der neonatalen Reifungsphase der Drüse (die ersten 3 Wochen nach der Geburt) gedeihen die Hypophysenstammzellen in einem aktivierten Zustand 6,11,12,13, während das Altern des Organismus mit einer verminderten In-situ-Stammzellfunktionalität verbunden ist, aufgrund einer zunehmenden entzündlichen (Mikro-) Umgebung beim Altern (oder "entzündlich")^10,14 . Darüber hinaus ist die Tumorgenese in der Drüse auch mit der Stammzellaktivierung assoziiert ^7,15. Obwohl die Stammzellaktivierung in mehreren Situationen des Hypophysenumbaus nachgewiesen wurde (überprüft in ^7,16), bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen unklar. Da In-vivo-Ansätze (wie die Linienverfolgung bei transgenen Mäusen) kein klares oder umfassendes Bild von Hypophysenstammzellen geliefert haben, ist die Entwicklung zuverlässiger In-vitro-Modelle zur Erforschung der Stammzellbiologie in normaler und kranker Hypophyse unerlässlich. Die Standard-In-vitro-Kultur primärer Hypophysenstammzellen ist aufgrund der sehr begrenzten Wachstumskapazität und der nicht-physiologischen (2D) Bedingungen mit schnellem Verlust des Phänotyps nach wie vor unzureichend (für einen detaillierteren Überblick siehe¹⁶). 3D-Kugelkulturen (Pituisphären) wurden aus Hypophysenstammzellen etabliert, die durch die Nebenpopulation und den SOX2⁺-Phänotyp ^2,3,4 identifiziert wurden. Die Pituisphären wachsen klonal aus den Stammzellen, exprimieren Stammheitsmarker und zeigen Differenzierungsfähigkeit in die endokrinen Zelltypen. Sie dehnen sich jedoch nicht wesentlich aus, während sie nur eine begrenzte Durchlässigkeit aufweisen (2-3 Passagen)^3,4. Kugelartige Strukturen wurden auch aus nicht dissoziierten Hypophysenstammzellclustern erhalten, wenn sie 1 Woche lang in 50% verdünntem Matrigel kultiviert wurden, aber die Erweiterbarkeit wurde nicht gezeigt¹⁷. Der Pituisphere-Ansatz wird hauptsächlich als Auslesewerkzeug für Stammzellzahlen verwendet, aber weitere Anwendungen sind durch eine geringere Expansionskapazität^{begrenzt 16}.

Um diese Mängel zu beheben und zu überwinden, wurde kürzlich ein neues 3D-Modell entwickelt, d.h. Organoide, ausgehend von der großen endokrinen AL von Mäusen, die die MZ- und parenchymalen Stammzellen enthalten. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide tatsächlich aus den Stammzellen der Hypophyse gewonnen werden und ihren Phänotyp¹⁸ originalgetreu rekapitulieren. Darüber hinaus sind die Organoide langfristig expandierbar, während sie ihre Stammnatur robust beibehalten. Daher bieten sie eine zuverlässige Methode, um primäre Hypophysenstammzellen für eine tiefgreifende Exploration zu erweitern. Eine solche Exploration ist mit der begrenzten Anzahl von Stammzellen, die aus einer Hypophyse isoliert werden können, die auch unter 2D-Bedingungen nicht erweiterbar sind, nicht erreichbar¹⁶. Es hat sich gezeigt, dass die Organoide wertvolle und zuverlässige Werkzeuge sind, um neue Merkmale von Hypophysenstammzellen (übersetzbar in vivo) ^{aufzudecken14,18}. Wichtig ist, dass das Organoidmodell den Aktivierungsstatus der Hypophysenstammzellen während lokaler Gewebeschäden und neonataler Reifung getreu widerspiegelt, eine verbesserte Bildungseffizienz zeigt und hochregulierte molekulare Wege repliziert^14,18. Daher ist das aus der Hypophyse abgeleitete Organoidmodell ein innovatives und leistungsfähiges Forschungsmodell für die Hypophysenstammzellbiologie sowie ein Werkzeug zum Auslesen der Stammzellaktivierung.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert die Etablierung von aus der Hypophyse stammenden Organoiden der Maus. Zu diesem Zweck wird die AL isoliert und in einzelne Zellen dissoziiert, die in das extrazelluläre Matrix-nachahmende Matrigel (im Folgenden als ECM bezeichnet) eingebettet sind. Die Zell-ECM-Anordnung wird dann in einem definierten Medium kultiviert, das im Wesentlichen Stammzellwachstumsfaktoren und Hypophysen-Embryonalregulatoren enthält (im Folgenden als "Hypophysen-Organoid-Medium" (PitOM)¹⁸ bezeichnet; Tabelle 1). Sobald die Organoide vollständig entwickelt sind (nach 10-14 Tagen), können sie durch sequentielles Passieren weiter expandiert und einer umfangreichen nachgelagerten Exploration unterzogen werden (z. B. Immunfluoreszenz, RT-qPCR und Bulk- oder Einzelzelltranskriptomik; Abbildung 1). Längerfristig wird erwartet, dass die Hypophysenstammzell-Organoide den Weg für Gewebereparaturansätze und regenerative Medizin ebnen werden.

Tierversuche für diese Studie wurden vom KU Leuven Ethical Committee for Animal Experimentation genehmigt (P153/2018). Alle Mäuse wurden in der Tieranlage der Universität unter standardisierten Bedingungen (konstante Temperatur von 23 ± 1,5 ° C, relative Luftfeuchtigkeit 40% -60% und ein Tag-Nacht-Zyklus von 12 h) untergebracht, mit Zugang zu Wasser und Nahrung ad libitum.

1. Mäuse

1. Verwenden Sie handelsübliche Mausstämme wie C57BL/6J-Mäuse im jungen Erwachsenenalter (8-12 Wochen alt). Im Allgemeinen stellen 2-3 Mäuse eine ausreichende Anzahl von AL-Zellen für das Protokoll zur Verfügung.

2. Isolierung und Dissoziation von Maus-AL

HINWEIS: Medium A, B und C werden im Voraus^{vorbereitet 19,20}. Die Zusammensetzungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

1. Isolierung von Maus-AL
   1. Euthanasie die Mäuse durch CO₂ -Erstickung, gefolgt von Enthauptung (Abbildung 2A). Waschen Sie die Köpfe der Mäuse mit deionisiertem Wasser, um das Blut zu entfernen, und besprühen Sie sie mit 70% EtOH, um eine sterile Umgebung zu erzeugen.
   2. Entfernen Sie mit sterilen chirurgischen Werkzeugen die Haut des Kopfes zwischen den Ohren (Abbildung 2B).
   3. Öffnen Sie den Schädel und entfernen Sie das Gehirn.
      1. Brechen Sie den "Nasenrücken" (d. h. den vorderen Teil des Frontalknochens; Abbildung 2B) mit steriler Schere.
      2. Öffnen Sie den Schädel weiter mit einer Schere, ausgehend vom gebrochenen Nasensteg zu den Ohren, auf beiden Seiten (Abbildung 2C).
      3. Entfernen Sie den Schädel und das Gehirn mit einer sterilen Pinzette, ohne die Hypophyse zu berühren (Abbildung 2D).
   4. Entfernen Sie das Zwerchfell sellae mit einer stumpfen Pinzette, ohne die Hypophyse zu beschädigen. Entsorgen Sie die PL und die IL aus der AL unter einem Stereomikroskop.
      HINWEIS: PL und IL werden gleichzeitig verknüpft und somit entfernt. Diese Teile erscheinen als weißes Gewebe im Vergleich zum rosafarbenen AL (Abbildung 2D).
   5. Isolieren Sie die ZL vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette und sammeln Sie sie in einem 10-ml-Erlenmeyerkolben, der mit 3 ml Medium A gefüllt ist (siehe Tabelle 2). Den Kolben bis zur Weiterverarbeitung auf Eis legen.
2. Dissoziation der Maus AL
   1. Entfernen Sie das überstehende Medium (SN) A aus dem Erlenmeyerkolben, der den isolierten AL enthält. 2 ml vorgewärmte (37 °C) 2,5%ige Trypsinlösung zugeben und 15 min bei 37 °C inkubieren.
   2. Ohne die Trypsinlösung zu entfernen, fügen Sie 2 ml vorgewärmte (37 °C) DNase-Lösung (2 μg/ml in Medium A; steril gefiltert durch ein 0,22 μm-Netz) hinzu und schwenken Sie den Erlenmeyerkolben 10 Mal. Lassen Sie die Hypophyse auf den Boden sinken (~ 1 min) und entfernen Sie die SN.
   3. 2 ml vorgewärmte (37 °C) Trypsin-Inhibitor-Lösung (0,1 mg/ml in Medium A; sterilfiltriert durch ein 0,22 μm-Netz) und 10 min bei 37 °C inkubieren. Lassen Sie das Hypophysensediment auf den Boden und entfernen Sie das SN.
   4. 2 ml vorgewärmtes (37 °C) Medium B (siehe Tabelle 2) zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Ohne das SN zu entfernen, fügen Sie 2 ml vorgewärmtes (37 °C) mittleres C hinzu (siehe Tabelle 2) und inkubieren Sie bei 37 °C für 15 min.
   5. Lassen Sie die Hypophyse auf den Boden sinken und entfernen Sie die SN. Spülen Sie die Hypophyse dreimal mit vorgewärmtem (37 °C) Medium C ab.
   6. Dissoziation der Hypophyse in einzelne Zellen.
      1. Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes (37 °C) Medium C hinzu. Saugen Sie die Hypophyse mehrmals mit einer sterilen, flammpolierten Pasteur-Pipette ab und stoßen Sie sie aus, bis die Fragmente nicht mehr sichtbar sind.
      2. Überführen Sie die Suspension in ein 15-ml-Röhrchen mit 4,5 ml vorgewärmter (37 °C) DNase-Lösung (2 μg/ml in Medium A; steril gefiltert durch ein 0,22 μm-Netz). Spülen Sie den Erlenmeyer dreimal mit 2 mL vorgewärmtem (37 °C) Medium C ab und geben Sie die Suspension in das 15 mL Röhrchen.
   7. Mischen Sie die gesammelte Zellsuspension und filtern Sie sie durch ein 40 μm Zellsieb in ein 30 ml Röhrchen. Spülen Sie das 15 mL Röhrchen und das Zellsieb dreimal mit 2 mL Medium C aus und geben Sie die Suspension in das 30 mL Röhrchen.
   8. Positionieren Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette aus Glas, gefüllt mit 2 ml 3% Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung (in Medium A; steril gefiltert durch ein 0,22 μm-Netz), am Boden des Rohres und pipettieren Sie vorsichtig heraus, um eine sichtbare Dichteschicht zu bilden. Zentrifuge bei 190 x g für 10 min bei 4 °C.
   9. Entfernen Sie den SN, indem Sie den Schlauch in einer fließenden Bewegung umkehren, und entfernen Sie die verbleibenden SN-Tröpfchen mit einer P1000-Spitze. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml eiskaltem Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) und quantifiziert die Zellen mit einem Zellzähler.

3. Etablierung und Kultivierung von aus AL gewonnenen Organoiden

HINWEIS: Tauen Sie ECM im Voraus auf Eis auf (2-3 h für 1 ml) und halten Sie es für die Dauer des Protokolls auf Eis.

1. Organoide Aussaat und Kultivierung
   1. Die AL-Zellsuspension bei 190 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren und die SN entfernen. Resuspendiert das Zellpellet in Adv DMEM/F12 unter Verwendung des spezifischen Volumens, das berechnet wurde, um eine Zelldichte von 1,1 x 10⁶ Zellen/ml zu erreichen.
      HINWEIS: Wenn die Zellsuspension beispielsweise 500.000 Zellen / ml enthält, muss das Zellpellet in 454,54 μL Adv DMEM / F12 resuspendiert werden, um die gewünschte Dichte von 1,1 x 10⁶ Zellen / ml zu erreichen.
   2. Nehmen Sie das Volumen der Zellsuspension heraus, das für die Beschichtung benötigt wird (entsprechend der gewünschten Anzahl von Vertiefungen für die Organoidentwicklung) und fügen Sie ECM im Verhältnis 30: 70 (30% Zellsuspension (in Adv DMEM / F12) und 70% ECM) hinzu. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Zum Beispiel sollte man für einen Tröpfchen von 30 μL (siehe Schritt 3.1.3) 9 μL Zellsuspension (mit ~ 10.000 Zellen, wenn es aus der 1,1 x 10⁶ Zellen / ml Suspension entnommen wird) mit 21 μL ECM mischen.
   3. Pro Bohrung wird ein 30 μL-Tropfen des Zellsuspensions/ECM-Gemisches (siehe Schritt 3.1.2) auf eine vorgewärmte (37 °C) 48-Well-Platte abgelegt. Drehen Sie die Platte auf den Kopf und lassen Sie das ECM bei 37 °C für 20 min erstarren.
      HINWEIS: Die Kulturplatten mindestens 24 h bei 37 °C vorwärmen.
   4. Bringen Sie die Platte wieder in ihre richtige Ausrichtung und fügen Sie vorsichtig 250 μL vorgewärmtes (37 °C) PitOM (siehe Tabelle 1) hinzu, ergänzt durch 10 μM Rock Inhibitor (Y-27632).
   5. Setzen Sie die Kultur der Organoide fort, indem Sie das Medium (ohne Y-27632) alle 2-3 Tage wechseln, bis die Organoide ausgewachsen sind, was zwischen 10-14 Tagen dauert (Abbildung 3A). Dann passieren Sie die Organoide.
      HINWEIS: Achten Sie beim Absaugen des Mediums darauf, die ECM-Dome nicht zu stören. Kippen Sie die Kulturplatte leicht und entfernen Sie das Medium vom unteren Rand des Brunnens. Frisches (bei 37 °C vorgewärmtes) Medium sollte vorsichtig an der Seite des Brunnens hinzugefügt werden. Wenn sich Geltröpfchen lösen, sammeln Sie die Organoide und suspendieren und kultivieren Sie sie erneut in einem neuen ECM-Tröpfchen.
2. Organoid-Passaging
   1. Saugen Sie das Medium vorsichtig ab und fügen Sie 400 μL eiskaltes Adv DMEM/F12 hinzu, um das ECM aufzulösen und die Organoide in einem Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Einmal mit 400 μL eiskaltem Adv DMEM/F12 EM waschen. Zentrifuge bei 200 x g für 5 min bei 4 °C.
   2. Entfernen Sie das SN vorsichtig und fügen Sie 400 μL vorgewärmtes (37 °C) TrypLE Express Enzym (1X) hinzu. Mischen Sie, indem Sie das Rohr mehrmals umkehren, und inkubieren Sie bei 37 ° C für 5 min.
   3. 400 μL eiskaltes Adv DMEM/F12 zugeben und bei 200 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie die SN.
   4. Resuspendiert das Pellet mit 100 μL eiskaltem Adv DMEM/F12 und bricht anschließend die Organoide auf, indem es mit einer verengten P200-Spitze kräftig auf und ab pipettiert wird (d. h. die leere Spitze gegen den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens drückt, um den Öffnungsdurchmesser zu reduzieren), bis Organoidfragmente (mit einem Durchmesser um 50 μm) erhalten werden (Abbildung 3B).
      HINWEIS: Die Dissoziationsmischung sollte überwiegend Organoidfragmente und nur wenige Einzelzellen enthalten. Eine harte Dissoziation der Organoide in einzelne Zellen wirkt sich negativ auf das Nachwachsen der Organoide aus.
   5. 800 μL Adv DMEM/F12 zugeben und bei 190 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie die SN.
   6. Passage der Organoide im Verhältnis 1:2 bis 1:4. Resuspendiert das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Adv DMEM/F12, wie es für die Beschichtung benötigt wird, und fügen Sie ECM im Verhältnis 30:70 hinzu (30% Zellsuspension und 70% ECM). Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
   7. Samen und Kultivieren Sie die Organoide wie oben in den Schritten 3.1.3-3.1.5 beschrieben.
      HINWEIS: Im Durchschnitt entwickeln sich 20 Organoide pro Bohrloch aus den 10.000 ausgesäten Ganz-AL-Zellen (0,2%). Diese Organoide der Passage 0 können im Verhältnis 1:2 aufgeteilt werden, was dazu führt, dass sich pro Bohrloch >50 Organoide entwickeln (Passage 1). Organoide können dann in einem Verhältnis von 1:2 bis 1:4 während der nachfolgenden Passagen geteilt werden. Das Nachwachsen der Organoide verlangsamt sich nach ~ 10 Passagen (entsprechend 3 Monaten Kultur), konkretisiert in allmählich weniger und kleineren Organoiden.

4. Kryokonservierung von AL-abgeleiteten Organoiden und Auftauen

1. Kryokonservierung von Organoiden
   1. Befolgen Sie das Passaging-Protokoll von Schritt 3.2.1 bis Schritt 3.2.5.
   2. Resuspendiert das Organoidpellet (das Fragmente und Zellen enthält) mit 1 ml Kryokonservierungsmedium (Tabelle 3). Übertrage die Suspension in ein Kryo und lege sie auf Eis.
      HINWEIS: Organoide (d.h. resultierende Fragmente und Zellen) aus bis zu vier Vertiefungen der 48-Well-Platte können in einem Kryo kombiniert werden.
   3. Legen Sie die Kryofrüchte in einen Gefrierbehälter und geben Sie sie auf -80 ° C.
   4. Nach 24 h die Proben in eine Kryobox überführen und in flüssigem Stickstoff (-196 °C) zur Langzeitlagerung lagern.
2. Auftauen von kryokonservierten Organoiden
   1. Entfernen Sie das Kryotivglas aus dem Flüssigstickstofftank und legen Sie es auf Eis. Fahren Sie sofort mit dem Auftauprotokoll fort.
   2. Tauen Sie die Lösung mit den kryokonservierten Organoidfragmenten und Einzelzellen bei 37 °C auf (Wasserbad).
      HINWEIS: Bewahren Sie die Lösung nicht länger als 2 Minuten bei 37 °C auf, um Zelltoxizität durch DMSO zu vermeiden.
   3. Übertragen Sie den Inhalt auf ein 15-ml-Röhrchen, das 10 ml eiskaltes Adv DMEM/F12 mit 30% fetalem Rinderserum (FBS) enthält. Spülen Sie das Kryo mit 1 ml Adv DMEM/F12 mit 30% FBS.
   4. Zentrifuge bei 190 x g für 10 min bei 4 °C. Resuspendiert das Pellet mit 1 ml eiskaltem Adv DMEM/F12 und überführt die Suspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
   5. Zentrifuge bei 190 x g für 10 min bei 4 °C. Resuspendiert das Pellet in einem ausreichenden Volumen von Adv DMEM/F12, wie es für die Beschichtung benötigt wird, und fügen Sie ECM in einem Verhältnis von 30:70 hinzu. Gut mischen, indem Sie auf und ab pipettieren.
   6. Samen und Kultivieren Sie die Organoide wie oben in den Schritten 3.1.3-3.1.5 beschrieben.

5. Validierung von AL-abgeleiteten Organoiden

1. Sammlung und Lyse von Organoiden zur RNA-Isolierung
   1. Die Organoide werden wie oben beschrieben gesammelt und zentrifugiert (Schritt 3.2.1).
   2. Entfernen Sie das SN und fügen Sie 350 μL Lysepuffer mit 1% 2-Mercapto-Ethanol hinzu. Vortex für 30 s und bei -80 °C lagern oder sofort mit der RNA-Isolierung fortfahren.
      ACHTUNG: Beachten Sie, dass 2-Mercapto-Ethanol eine giftige Verbindung ist. Alle Arbeiten müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden, während Nitrilhandschuhe, eine Staubmaske und eine Schutzbrille getragen werden. 2-Mercapto-Ethanol kann irreversible Schäden an Augen und Haut verursachen.
2. Fixierung und Einbettung von Organoiden zur Immunhistochemie/-fluoreszenzfärbung
   1. Die Organoide werden wie oben beschrieben gesammelt und zentrifugiert (Schritt 3.2.1).
   2. Entfernen Sie den SN, fügen Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) hinzu und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbitalschüttler (100 U / min).
      ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes Karzinogen für den Menschen, das irreversible Schäden an der Hornhaut verursachen kann. Alle Arbeiten müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden. Nitrilhandschuhe und Schutzbrillen müssen immer getragen werden.
   3. 5 min bei 200 x g zentrifugieren und SN entfernen. 1 ml PBS hinzufügen, 10 min bei RT auf einem Orbitalschüttler (100 U/min) inkubieren und bei 90 x g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Wiederholen Sie den Waschschritt zweimal. In PBS bei 4 °C lagern.
   4. Für die Gewebeverarbeitung und Dehydratisierung entfernen Sie das SN und fügen Sie 150 μL 2% Agarosegel (in PBS) zum Organoidpellet hinzu, indem Sie eine vorgewärmte, verbreiterte p200-Spitze verwenden (durch Schneiden eines kleinen Stücks der Spitze). Sofort das gesamte Volumen nach oben pipettieren und in den Deckel des Mikrozentrifugenröhrchens auswerfen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, da sich das Gel, das die Organoide enthält, schnell verfestigt.
   5. Lassen Sie das Gel 30 min fest erstarren und bewegen Sie die Gelscheibe auf eine Histologiekassette. Eintauchen und in 50% EtOH lagern, bis es im Gewebeprozessor dehydriert ist.
   6. Für die Paraffineinbettung die Gelscheibe (mit Pinzette) in eine Einbettform geben und mit warmem Paraffin (60 °C) füllen. Stellen Sie die Formen bei 4 °C auf, bis das Paraffin fest ist (ca. 45 min). Diese Proben können entweder bei 4 °C gelagert oder sofort geschnitten werden.
   7. Mikrotomieren Sie die Paraffinblöcke, die Organoide in einer Dicke von 5 μm enthalten, und sammeln Sie die Proben auf Glasobjektträgern. Fügen Sie einen Tropfen deionisiertes Wasser unter jedem Abschnitt hinzu, um eine ordnungsgemäße Dehnung des Abschnitts zu ermöglichen, und legen Sie die Schienen über Nacht auf eine flache Heizplatte bei 37 ° C. Lagern Sie die Objektträger mit Schnitten bei 4 °C oder fahren Sie direkt mit der immunhistochemischen oder Immunfluoreszenzfärbung fort.

Nach Isolierung und Dissoziation der ZL werden die erhaltenen Einzelzellen in ECM ausgesät und in PitOM gezüchtet (Abbildung 1, Tabelle 1). Abbildung 3A zeigt die Zellkultur und -dichte bei der Aussaat (Tag 0). Einige kleine Ablagerungen können vorhanden sein (Abbildung 3A, weiße Pfeilspitzen), verschwinden aber beim Passieren. Vierzehn Tage nach der Aussaat sind die aus AL gewonnenen Organoide vollständig entwickelt (Abbildung 3A). Die Organoide weisen eine zystische Morphologie auf, mit einer Epithelschicht, die ein Lumen umschließt. In diesem Stadium erreichen die Organoide einen Durchmesser von 500 μm und müssen durchlaufen werden. Abbildung 3B zeigt die AL-abgeleitete Organoidkultur nach dem Passieren zum angegebenen Zeitpunkt nach der erneuten Aussaat der dissoziierten Organoidfragmente.

Gelegentlich können eine oder mehrere dichte Strukturen in der Organoidkultur auftreten (Abbildung 3A, ungünstig). Beim Passieren neigen dichte Organoide dazu, die Oberhand zu gewinnen und enden nach ein paar Passagen in Kulturen mit nur dichten Strukturen (Abbildung 3B, ungünstig). Daher wird empfohlen, nicht mit Vertiefungen fortzufahren, die dichte Organoide enthalten (Passage 0). Alternativ können dichte Organoide durch Sedimentation verworfen werden, wodurch die zystischen Organoide fortgesetzt werden können. Der Ursprung dieser dichten Organoide ist derzeit unklar, aber sie zeigen eine weniger ausgeprägte Hypophysennatur18. Wenn Organoide nach dem Passieren nicht oder weniger effizient nachwachsen, müssen Dissoziationsverfahren optimiert werden. Insbesondere muss man darauf achten, nicht zu hart zu dissoziieren; Die Organoide müssen in Fragmente aufgeteilt werden, nicht in einzelne Zellen (Abbildung 3B, Tag 0, Inset).

Die Analyse der Immunfluoreszenzfärbung bestätigt den epithelialen Charakter der AL-abgeleiteten Organoide, da sie die epithelialen Marker E-Cadherin (E-Cad) und Cytokeratin 8/18 (CK8/18; Abbildung 3C), die im Übrigen als Stammzellmarker in der Hypophyse18 beschrieben wurden. Die Stammfähigkeit der Organoide wird zusätzlich durch die SOX2- und TROP2-Expression demonstriert, die beide auch als Hypophysenstammzellmarker identifiziert wurden (Abbildung 3C)14,18. LHX3, ein Transkriptionsfaktor, der speziell in der (sich früh entwickelnden) Hypophyse exprimiert wird, validiert den Hypophysenphänotyp der Organoide (Abbildung 3C). Einige der organoidbildenden Zellen befinden sich in einem proliferativen Zustand und exprimieren den Proliferationsmarker Ki67 (Abbildung 3C).

Eine weitere Exploration und Validierung des Hypophysenphänotyps (Stammform) der AL-abgeleiteten Organoide wird mit der Reverse-Transkriptions-quantitativen PCR (RT-qPCR) durchgeführt. Eine hohe Expression der Stammheitsmarker Sox2, Cdh1 (kodierend für E-Cad), Krt8, Krt18 und Trop2 ist in den Organoiden vorhanden, deutlich höher als in der primären AL, was darauf hindeutet, dass sich die Organoide für die Stammzellen anreichern und somit das AL-Stammzellkompartiment darstellen, wie zuvor beschrieben (Abbildung 3D)18. Insbesondere die Entwicklungstranskriptionsfaktoren Pitx1 und Pitx2 bleiben nach der Entwicklung in mehreren hormonellen Zelltypen in der AL exprimiert und damit auch ihre hohe Expression in der AL. Die Kulturen behalten ihren Stammphänotyp robust, wie die anhaltende (hohe) Expression dieser Marker nach mehreren Passagen zeigt (Abbildung 3D).

Abbildung 1: Überblick über die Etablierung, Erhaltung, Charakterisierung und das Anwendungspotenzial von Organoiden aus der gesunden und kranken Hypophyse. AL, vorderer Lappen; IL, Zwischenlappen; PL, hinterer Lappen; MZ, Randzone; PitOM, Hypophysen-Organoid-Medium (erstellt mit BioRender.com). Stammzellnischen in der AL sind violett gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Isolierung der Hypophyse von erwachsenen eingeschläferten Mäusen. Repräsentative Bilder, die nacheinander aufgenommen wurden nach (A) Enthauptung, (B) Entfernung der Kopfhaut (Nasenbrücke ist eingekreist), (C) Öffnung des Schädels und (D) Entfernung des Gehirns, Freilegung der Hypophyse (eingekreist). Pfeil zeigt auf die PL, die (zusammen mit der zugehörigen IL) verworfen wird, und lässt die AL zur Isolierung und Dissoziation zurück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Etablierung und Validierung von AL-abgeleiteten Organoiden. (A) AL-Zellaussaat und Organoidentwicklung in PitOM an angegebenen Tagen (Passage 0). Die obere Reihe zeigt ein günstiges Organoidwachstum, wobei sich nur zystische Strukturen entwickeln. Die untere Reihe zeigt ungünstiges Wachstum mit einer großen dichten Struktur (geboxt). Weiße Pfeilspitzen zeigen Ablagerungen an, schwarze Pfeilspitzen zeigen einzelne Zellen an (vergrößert im Einschub). (B) Organoidfragmente (vergrößert im Einschub), die beim Passieren (Tag 0) und Nachwachsen von Organoiden, wie 7 Tage später beobachtet, ausgesät werden. Die obere Reihe zeigt ein günstiges organoides Nachwachsen, wobei nur zystische Strukturen wachsen. Die untere Reihe zeigt ein ungünstiges Nachwachsen mit dichten Organoiden, die die Kultur übernehmen. (C) Immunfluoreszenzfärbung von E-Cad, SOX2, TROP2 (alle rot), CK8/18, LHX3 und Ki67 (alle grün) in AL-abgeleiteten Organoiden. Kerne sind mit Hoechst33342 (blau) gekennzeichnet. Pfeilspitzen zeigen Ki67+-Zellen an. Maßstabsbalken werden angezeigt. (D) Genexpressionsanalyse von Stammheitsmarkern (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) und Entwicklungstranskriptionsfaktoren (Pitx1, Pitx2) in primären AL- und AL-abgeleiteten Organoiden (Passage 0 bedeutet 14 Tage nach der Zellaussaat), bestimmt durch RT-qPCR (Mittelwert ± REM). Datenpunkte stellen biologische Replikate dar. Es werden Delta-Zyklus-Schwellenwerte (dCT) angezeigt, die mit der Formel berechnet werden: CT (Gen von Interesse) - CT (Housekeeping-Gen Actb). Je positiver der dCT-Wert ist (der auf der Y-Achse unterhalb der X-Achse Null dargestellt wird), desto niedriger ist das Expressionsniveau des interessierenden Gens. Je niedriger (oder negativer) der dCT-Wert, desto höher der Ausdruckspegel 14,18,21,22. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1. Zusammensetzung von PitOM. PitOM wird durch einen 0,22 μm Netzfilter filtriert und bei 4 °C für maximal 2 Wochen gelagert.

Tabelle 2. Zusammensetzung von Medium A, B und C. Alle Medien werden durch einen 0,22 μm Mesh-Filter gefiltert und maximal 4 Monate bei 4 °C gelagert. Der pH-Wert von Medium A und C muss auf 7,3 eingestellt werden.

Tabelle 3. Zusammensetzung des Kryokonservierungsmediums.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.