Impfungsstrategien zur Infektion von Pflanzenwurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen

Natürliche Böden werden von einer erstaunlichen Anzahl von Mikroben bewohnt, die neutral, schädlich oder vorteilhaft für Pflanzen sein können¹. Viele Pflanzenpathogene werden durch den Boden übertragen, umgeben die Wurzeln und greifen das unterirdische Organ an. Diese Mikroorganismen gehören zu einer Vielzahl von Kladen: Pilze, Oomyceten, Bakterien, Nematoden, Insekten und einige Viren ^1,2. Sobald die Umweltbedingungen eine Infektion begünstigen, werden anfällige Pflanzen krank und die Ernteerträge sinken. Die Auswirkungen des Klimawandels, wie die globale Erwärmung und Wetterextreme, werden den Anteil bodenbürtiger Pflanzenpathogene^{erhöhen 3}. Daher wird es immer wichtiger, diese zerstörerischen Mikroben und ihre Auswirkungen auf die Lebens- und Futtermittelproduktion, aber auch auf natürliche Ökosysteme zu untersuchen. Darüber hinaus gibt es mikrobielle Mutualisten im Boden, die eng mit den Wurzeln interagieren und das Wachstum, die Entwicklung und die Immunität der Pflanzen fördern. Wenn Pflanzen mit Krankheitserregern konfrontiert werden, können sie aktiv spezifische Gegner in der Rhizosphäre rekrutieren, die das Überleben des Wirts unterstützen können, indem sie Krankheitserreger unterdrücken ^4,5,6,7. Mechanistische Details und Signalwege, die an vorteilhaften Wurzel-Mikroben-Interaktionen beteiligt sind, sind jedoch oft noch unbekannt⁶.

Es ist daher wichtig, das allgemeine Verständnis der Wurzel-Mikroben-Wechselwirkungen zu erweitern. Zuverlässige Methoden zur Beimpfung von Wurzeln mit bodenbürtigen Mikroorganismen sind notwendig, um Modellstudien durchzuführen und die Erkenntnisse in landwirtschaftliche Anwendungen zu überführen. Vorteilhafte Wechselwirkungen im Boden werden beispielsweise mit Serendipita indica (früher bekannt als Piriformospora indica), stickstoffbindendem Rhizobium spp. oder Mykorrhizapilzen untersucht, während bekannte bodenbürtige Pflanzenpathogene Ralstonia solanacearum, Phytophthora spp., Fusarium spp. und Verticillium spp.1 umfassen. Die beiden letzteren sind Pilzgattungen, die weltweit verbreitet sind und Gefäßerkrankungen^{verursachen 2}. Verticillium spp. (Ascomycota) kann Hunderte von Pflanzenarten infizieren - hauptsächlich Dikotyledonen, einschließlich krautiger Einjähriger, holziger Stauden und vieler Kulturpflanzen ^2,8. Hyphen von Verticillium treten in die Wurzel ein und wachsen sowohl interzellulär als auch intrazellulär in Richtung des zentralen Zylinders, um die Xylemgefäße zu besiedeln ^2,9. In diesen Gefäßen bleibt der Pilz für den größten Teil seines Lebenszyklus. Da der Xylemsaft nährstoffarm ist und pflanzliche Abwehrstoffe trägt, muss sich der Pilz an diese einzigartige Umgebung anpassen. Dies wird durch die Sekretion von kolonisationsbezogenen Proteinen erreicht, die es dem Erreger ermöglichen, in seinem Wirt^10,11 zu überleben. Nach Erreichen des Wurzelgefäßes kann sich der Pilz innerhalb der Xylemgefäße akropetal auf das Laub ausbreiten, was zu einer systemischen Besiedlung des Wirts ^9,12 führt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Pflanze im Wachstum ^9,10,13 negativ beeinflusst. Zum Beispiel treten Wachstumsverzögerung und gelbe Blätter sowie vorzeitige Seneszenz^13,14,15,16 auf.

Ein Mitglied dieser Gattung ist Verticillium longisporum, das stark an brassicaceous Wirte wie den agronomisch wichtigen Raps, Blumenkohl und die Modellpflanze Arabidopsis thaliana¹² angepasst ist. Mehrere Studien kombinierten V. longisporum und A. thaliana, um umfangreiche Einblicke in bodenbürtige Gefäßerkrankungen und die daraus resultierenden Wurzelabwehrreaktionen^{zu gewinnen 13,15,16,17}. Mit dem Modellsystem V. longisporum / A. thaliana können einfache Empfindlichkeitstests durchgeführt werden und für beide Organismen stehen gut etablierte genetische Ressourcen zur Verfügung. Eng verwandt mit V. longisporum ist der Erreger Verticillium dahliae. Obwohl beide Pilzarten einen ähnlichen vaskulären Lebensstil und Invasionsprozess durchführen, sind ihre Vermehrungseffizienz von den Wurzeln bis zu den Blättern und die hervorgerufenen Krankheitssymptome bei A. thaliana unterschiedlich: Während V. longisporum normalerweise eine frühe Seneszenz induziert, führt eine Infektion mit V. dahliae zu welken¹⁸. Kürzlich wurden in einer methodischen Zusammenfassung verschiedene Wurzelimpfstrategien zur Infektion von A. thaliana mit V. longisporum oder V. dahliae vorgestellt, die bei der Planung von Versuchsaufbauten helfen¹⁹. Auf dem Feld verursacht V. longisporum gelegentlich erhebliche Schäden in der Rapsproduktion¹², während V. dahliae ein sehr breites Wirtsspektrum hat, das mehrere Kulturarten wie Weinrebe, Kartoffel und Tomate⁸ umfasst. Dies macht beide Krankheitserreger wirtschaftlich interessant zu untersuchende Modelle.

So verwenden die folgenden Protokolle sowohl V. longisporum als auch V. dahliae als Modell-Wurzelpathogene, um mögliche Ansätze für Wurzelimpfungen zu veranschaulichen. Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Raps (Brassica napus) und Tomaten (Solanum lycopersicum) wurden als Musterwirte ausgewählt. Detaillierte Beschreibungen der Methoden finden Sie im folgenden Text und im dazugehörigen Video. Vor- und Nachteile für jedes Impfsystem werden diskutiert. Zusammengenommen kann diese Protokollsammlung helfen, eine geeignete Methode für spezifische Forschungsfragen im Kontext von Wurzel-Mikroben-Interaktionen zu identifizieren.

1. Medien für Pilzkulturen und Pflanzenimpfsysteme

1. Flüssige Kartoffeldextrose-Brühe (PDB): 21 g/L PDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zubereiten.
2. Flüssige Czapek Dextrose Brühe (CDB): Bereiten Sie 42 g/L CDB in Reinstwasser in einem hitzestabilen Kolben zu.
3. Medium für das Petrischalen-Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 1,5 g/L Murashige und Skoog-Medium (MS) und 8 g/L Agar in Reinstwasser vor.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diesem Medium, da dies nach der Impfung zu übermäßigem Pilzwachstum führt.
4. Medium für das auf Kunststoffbechern basierende Impfsystem: Bereiten Sie einen hitzestabilen Kolben mit 4,4 g/L MS, 0,2 g/L MgSO₄, 1 g/L KNO₃, 0,5 g/L 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure (MES) und 6,0 g/L Agar in Reinstwasser vor und stellen Sie den pH-Wert mit 5 M KOH auf 5,7 ein.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Zucker in diesem Medium, da dies nach der Impfung zu übermäßigem Pilzwachstum führt.
5. 1/4 MS Medium: Bereiten Sie 1,2 g/L MS in Reinstwasser vor.
6. Verwenden Sie den Autoklaven, um alle oben genannten Lösungen zu sterilisieren. Die Glaskolben in den Korb legen, den Deckel schließen und 15 min bei 121 °C und 98,9 kPa sterilisieren.

2. Sterilisieren der Oberfläche von Pflanzensamen

HINWEIS: Verwenden Sie das folgende Protokoll immer, um die Oberfläche von Samen aus Arabidopsis, Raps und Tomaten vor der Aussaat zu sterilisieren.

1. Geben Sie die Samen in ein 2 ml Reaktionsrohr. Setzen Sie das Rohr in einen Exsikkator mit einem internen Fassungsvermögen von 5,8 l.
2. Erzeugen Sie Chlorgas im Exsikkator durch Zugabe von 6 ml 33% Salzsäure (HCl) in 100 ml 12% wässriges Natriumhypochlorit (NaClO).
3. Schließen Sie sofort den Deckel des Exsikkators und inkubieren Sie die Samen für 3 h im Gas.

3. Vorbereitung des Inokulums mit Verticillium-Sporen (asexuell abgeleitete Konidien)

HINWEIS: V. dahliae (Stamm JR2) wie V. longisporum (Stamm Vl43)^17,18,19 kultivieren. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer laminaren Durchflusshaube ausgeführt werden, um das Inokulum axenisch zu halten.

1. 150 ml flüssiges PDB (Schritt 1.1) werden in einen 500 ml Schikanenkolben gefüllt und das Medium mit 500 mg/L Cefotaxim ergänzt.
2. Geben Sie Verticillium conida aus der Lagerung von Glycerinmaterial in das PDB-Medium. Schließen Sie den Kolben mit einem sterilen Schaumstoffstopfen.
3. Inkubieren Sie die Kultur für 7-10 Tage in einer dunklen Box bei Raumtemperatur (RT) unter kontinuierlichem, horizontalem Schütteln (Rotary Shaker; 60 U / min). Dadurch entstehen kleine, weiße Myzelenkugeln.
4. Entfernen und verwerfen Sie den PDB-Überstand sorgfältig. Die meisten Myzelien sollten im Kolben verbleiben.
5. 100 ml flüssiges CDB (Schritt 1.2) auf die Myzelie im Schikanenkolben geben und das Medium mit 500 mg/L Cefotaxim ergänzen.
6. Inkubieren Sie weitere 4-5 Tage in einer dunklen Box bei RT unter kontinuierlichem, horizontalem Schütteln (Rotary Shaker, 60 U / min), um eine Sporulation zu induzieren. Der Überstand wird gelblich-gräulich, wenn Konidien freigesetzt werden.
7. Filtern Sie einen Teil (5-10 ml) der konidienhaltigen Flüssigkeit durch ein Filterpapier (Partikelrückhaltegrad von 8-12 μm) in ein steriles 50 mL Auffangröhrchen. Dies trennt Sporen von Myzelien.
8. Bestimmen Sie die Sporenkonzentration mit einer Zellzählkammer und einem Mikroskop. Mit keimfreiem 1/4 MS-Medium in Reinstwasser verdünnen, bis die unten angegebenen Sporenkonzentrationen erhalten sind.
   HINWEIS: Unter dem Mikroskop sind die Konidien von V. longisporum meist langgezogen und 7,1-8,8 μm groß, während V. dahliae-Konidien kürzer (3,5-5,5 μm) und eher kugelförmig²⁰ sind.
9. Verwenden Sie diese frisch geernteten Konidien als Impfstoff. Stellen Sie sicher, dass die Experimente immer mit frisch geernteten Konidien und nicht mit gefrorenen Beständen durchgeführt werden, da das Einfrieren die Anzahl der lebensfähigen Sporen erheblich reduziert¹⁹.
10. Zur Langzeitlagerung die Sporen als hochkonzentrierte Sporenlösung (ca. 1 x 10⁸ Sporen/ml) in 25%igem Glycerin bei -80 °C (bis 1 Jahr lagerfähig) einfrieren. Für die nächsten Experimente verwenden Sie diese Glycerinvorräte, um das PDB-Medium in Schritt 3.2 zu impfen.

4. Ein steriles In-vitro-Impfsystem auf Basis von Petrischalen

HINWEIS: Stellen Sie beim Petrischalensystem¹⁷ sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden.

1. Nach dem Autoklavieren das Medium (siehe Schritt 1.3) in Petrischalen gießen.
2. Nach dem Aushärten des Mediums die Petrischalen in einen sterilen Plastikbeutel umpacken und über Nacht kopfüber im Kühlschrank (4-10 °C) aufbewahren. Ein gekühltes Medium hilft, ein Abrutschen des Mediums in den nächsten Schritten zu verhindern.
3. Schneiden und entfernen Sie einen Infektionskanal und das obere Drittel des erstarrten Mediums mit einem Skalpell (Abbildung 1A). Vermeiden Sie es, während des Schneidens Flüssigkeit oder Luft unter das Agarmedium zu bekommen. Andernfalls rutscht das Medium und schließt den Infektionskanal.
4. Verteilen Sie 50-100 oberflächensterilisierte Arabidopsis-Samen mit einer sterilen Pipettenspitze auf der geschnittenen Oberseite. Legen Sie die Samen in den Winkel, in dem die geschnittene Agaroberfläche die Wand der Petrischale berührt, so dass Wurzeln zwischen dem Medium und der Petrischalenwand wachsen können. Dies wird die Impfung später erleichtern.
5. Schließen Sie die Petrischalen und verschließen Sie sie mit luftdurchlässigem Klebeband, um einen Gasaustausch zu ermöglichen.
6. Nach der Schichtung für 2 Tage in der Dunkelheit bei 4 °C die Platten senkrecht in ein geeignetes Rack legen und die Pflanzen bei 22 °C ± 1 °C unter Langzeitbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit) in einer Wachstumskammer anbauen.
7. Wenn der Großteil der Wurzeln den Infektionskanal erreicht (etwa 9-11 Tage alte Sämlinge), legen Sie die Platten horizontal ab, öffnen Sie sie und fügen Sie 500 μL frisch geerntete Verticillium-Konidien mit einer Konzentration von 4 x 10⁵ Sporen / ml direkt in den Infektionskanal hinzu, wobei darauf zu achten ist, dass die Flüssigkeit gleichmäßig im Kanal verteilt wird.
8. Bereiten Sie in ähnlicher Weise Kontrollplatten vor, indem Sie 500 μL einer Scheinlösung anstelle von Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) hinzufügen.
9. Inkubieren Sie die Platten horizontal für ein paar Minuten, bis die Flüssigkeit eingeweicht ist und nicht austreten kann, wenn die Platten wieder vertikal aufgestellt werden. Schließen Sie dann den Deckel und verschließen Sie die Platten mit luftdurchlässigem Klebeband.
10. Inkubieren Sie die Platten vertikal in der Wachstumskammer. Optional können Sie die Wurzelteile mit schwarzen Papierkartons bedecken, um Wurzeln und bodenbürtige Pilze zu verdunkeln (siehe¹⁹).
11. Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
    1. Schneiden Sie die Blätter von den Wurzeln und ernten Sie beide separat. Nehmen Sie die Agarstreifen aus den Petrischalen heraus, um leicht an die Wurzeln zu gelangen, und ziehen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Agar. Sämtliches Pflanzenmaterial sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.
       1. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg Blattmaterial, um mittels einer quantitativen PCR (qPCR) die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe¹⁹).
       2. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial ein und extrahieren Sie die gesamte RNA. Durchführung einer quantitativen Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR), um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) während des Befalls zu bestimmen (siehe¹⁹).
    2. Entfernen Sie vorsichtig die Wurzeln aus dem Agar, vermeiden Sie Verletzungen und untersuchen Sie sie unter dem Fluoreszenzmikroskop.
       1. Bestimmen Sie die Induktion von Markergenen in Pflanzenreporterlinien (z. B. Luciferase, β-Glucuronidase oder fluoreszierende Reporter^17,19,21).
       2. Visualisieren Sie die Pilzvermehrung an der Wurzel unter Verwendung von Pilzreporterlinien (z. B. V. longisporum, das konstitutiv ein verbessertes grün fluoreszierendes Protein, Vl-sGFP 9) exprimiert, oder durch Färbetechniken (z. B. durch 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-N-acetyl-beta-d-glucosaminid (X-beta-D-Glc-Nac)¹⁸).

5. Ein steriles In-vitro-Impfsystem , das mit Plastikbechern organisiert ist

HINWEIS: Wie in der ersten Beschreibung dieser Technik¹⁹ erwähnt, stellen Sie sicher, dass alle Geräte und Medien keimfrei sind und dass alle Schritte in einer Laminar-Flow-Haube ausgeführt werden.

1. Verwenden Sie transparente Plastikbecher mit einem Gesamtvolumen von 500 ml und sterilisieren Sie sie in einem 70% -75% -Ethanolbad für mindestens 20 min. Trocknen Sie die Becher in der Laminar-Flow-Haube.
2. Gießen Sie das autoklavierte Medium (siehe Schritt 1.4) in die Plastikbecher. Optional Cefotaxim (Endkonzentration von 50 mg/L) in das autoklavierte Medium geben, um bakterielle Kontaminationen zu vermeiden. Verwenden Sie 150 ml Medium pro Tasse für Experimente mit Arabidopsis oder mehr Medium (250-300 ml pro Tasse) für Experimente mit größeren Pflanzenarten (Raps, Tomate).
3. Legen Sie eine Kunststoffschicht (zuvor durch Inkubation in 70%-75% Ethanol für 20 min sterilisiert) auf das Medium, bevor es erstarrt (Abbildung 1B).
   HINWEIS: Diese Kunststoffschicht enthält vier vorgefertigte Löcher an den Ecken zum Platzieren von oberflächensterilisiertem Saatgut. Dadurch können die Samen auf das Medium zugreifen. Später verhindert diese Trennschicht, dass die Blätter das pilzhaltige Medium berühren, so dass die Mikroben die Blätter nicht direkt angreifen können und den Wurzelweg nehmen müssen. Ein weiteres Loch befindet sich in der Mitte, wodurch der Infektionskanal durchtrennt werden kann.
4. Wenn das Medium erstarrt ist, schneiden Sie das Agar mit einem Skalpell durch das vorgefertigte Mittelloch bis zu einer Tiefe von etwa 1,5 cm. Entfernen Sie den geschnittenen Agar, um einen Infektionskanal zu schaffen, in den die Pilzsporen später hinzugefügt werden können.
5. Kratzen Sie das Agarmedium leicht mit einer Pipettenspitze in den vier kleineren Löchern, um die erstarrte Haut zu unterbrechen (dies ermöglicht es den Samen, Wasser aus dem wässrigen Agarmedium aufzunehmen). Legen Sie die Samen mit einer Pipettenspitze in die kleineren Löcher.
6. Schließen Sie den Plastikbecher mit einem zweiten, umgedrehten Plastikbecher und verschließen Sie ihn mit luftdurchlässigem Klebeband. Das Band muss den Gasaustausch ermöglichen.
7. Nach 3 Tagen Schichtung bei Dunkelheit bei 4 °C die Bechersysteme unter 12 h Licht / 12 h Dunkelheit (Arabidopsis, Raps) oder 16 h Licht / 8 h Dunkelheit (Tomate) in Wachstumskammern bei konstanter Temperatur von 22 °C und 60% Luftfeuchtigkeit inkubieren.
8. Befolgen Sie das empfohlene Alter der Pflanzen für die Impfung: 21 Tage für Arabidopsis; 5-7 Tage für Raps; 12 Tage für Tomaten.
9. Beimpfen Sie Pflänzchen mit Verticillium , indem Sie 1 ml Konidienlösung (empfohlene Konzentration: 4 x 10⁵ Sporen/ml) in den Infektionskanal geben. Um Kontrollproben vorzubereiten, geben Sie 1 ml Scheinlösung ohne Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) in den Kanal.
10. Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
    1. Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben, wobei der Abstand für jedes Foto gleich bleibt. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ²² oder BlattFlaeche^17,19; verwenden Sie die Länge der Tassen^, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter).
       HINWEIS: Wenn es Stängel auf Arabidopsis gibt, entfernen Sie sie, um bessere Fotos von den Rosetten zu erhalten.
    2. Entfernen Sie die Wurzeln und definieren Sie die Biomasse (Frischgewicht) von Trieben aus infizierten und kontrollieren Sie Proben durch Wiegen. Bestimmen Sie das relative Frischgewicht¹⁹.
    3. Sammeln Sie die Proben für molekulare Analysen wie folgt.
    4. Arabidopsis: Entfernen Sie Stängel, falls vorhanden. Schneiden Sie die Rosetten an der Basis von den Wurzeln ab. Achten Sie darauf, das gesamte Wurzelmaterial aus der Probe auszuschließen und ganze Rosetten zu ernten. Kombinieren Sie 4-5 Rosetten aus verschiedenen Pflanzen zu einer Probe und frieren Sie das Blattmaterial in flüssigem Stickstoff ein.
    5. Ziehen Sie die Wurzeln vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Medium, drücken und tupfen Sie sie mit einem Papiertuch ab, um Agarreste zu entfernen, und kombinieren Sie 4-5 Wurzeln von verschiedenen Pflanzen zu einer Probe. Sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren.
    6. Raps/Tomate: Schneiden Sie Stielsegmente aus dem Hypokotyl (z. B. 1 cm lang; immer die gleiche Stammregion nehmen). Kombinieren Sie Material von 4-5 Pflanzen in jede Probe und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
    7. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg des Blatt- oder Stammmaterials, um mittels qPCR die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe¹⁹).
    8. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff, nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial und extrahieren Sie die gesamte RNA. Führen Sie die qRT-PCR durch, um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) bei Befall zu bestimmen (siehe¹⁹).

6. Ein bodenbasiertes Impfsystem in Töpfen

1. Mischen Sie Erde und Sand gründlich in einem volumetrischen Verhältnis von 3: 1 (Erde: Sand), um das Waschen des Substrats von den Wurzeln zu erleichtern. Gießen Sie die Mischung in einen Autoklavenbeutel. Wenn die Mischung zu trocken ist, fügen Sie eine angemessene Menge Wasser hinzu und mischen Sie es in das Substrat. Dampf bei 80 °C für 20 min in einem Autoklaven, um mikrobielle Kontaminationen zu minimieren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Erwärmung auf über 80 ° C, da dies die organischen Bodennährstoffe beeinträchtigen kann.
2. Füllen Sie Töpfe mit der Erde-Sand-Mischung und geben Sie sie in Schalen. Fügen Sie Wasser in die Schalen etwa 1/3 der Höhe eines Topfes hinzu, so dass das Erde-Sand-Gemisch gründlich mit Wasser getränkt wird. Besprühen Sie das Substrat zusätzlich mit einer Sprühflasche, um nasse Startbedingungen zu gewährleisten.
3. Säen Sie 3-4 Samen in jedem Topf (Abbildung 1C) und stellen Sie sicher, dass die Samen genügend Abstand voneinander haben. Halten Sie sie für 3 Tage in der Dunkelheit bei 4 ° C für die Schichtung, um die Keimung zu synchronisieren.
   HINWEIS: Einen Pflanzenüberschuss vorkultivieren, der eine Auswahl von Pflanzen ähnlicher Größe für die Impfexperimente ermöglicht und Abweichungen aufgrund individueller Unterschiede reduziert.
4. Lassen Sie die Sämlinge unter langen Tagesbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit; konstante Temperatur von 22 °C; 60% Luftfeuchtigkeit) bei regelmäßiger Bewässerung wachsen.
5. Befolgen Sie das empfohlene Alter der Pflanzen für die Impfung: 21 Tage für Arabidopsis, 7 Tage für Raps und 10 Tage für Tomaten. Pflücken Sie Pflanzen ähnlicher Größe, um die "Wurzeldip-Impfung^{" durchzuführen15,17,23,24}. Nehmen Sie den Boden aus den Töpfen und graben Sie vorsichtig die Wurzeln aus.
6. Waschen Sie vorsichtig nur die Wurzeln in einem Wasserbehälter und halten Sie die Rosetten aus dem Wasser. Die gewaschenen Wurzeln 60 min in einer Petrischale mit der Sporenlösung Verticillium (empfohlene Konzentration: 2 x 10⁶ Sporen/ml) inkubieren. Für die nicht infizierte Kontrollgruppe die Wurzeln für 60 min in der Scheinlösung ohne Sporen (keimfreies 1/4 MS-Medium) inkubieren.
7. Bereiten Sie neue Töpfe mit feuchter, dampfsterilisierter Erde (80 °C für 20 min) ohne Sand vor. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um in jedem Topf ein Loch in der Mitte des Bodens zu machen.
8. Legen Sie die Wurzeln direkt in das Loch (Transfer nur eine Pflanze pro Topf). Nachdem Sie die Wurzeln eingefügt haben, stellen Sie sicher, dass Sie die Löcher vorsichtig mit Erde auffüllen. Vermeiden Sie es, den Boden zu drücken, da sonst das Umtopfen Stresssymptome wie violette Blätter verursachen kann.
9. Kultivieren Sie infizierte und kontrollieren Sie Gruppen unter Langzeitbedingungen (16 h Licht / 8 h Dunkelheit; eine konstante Temperatur von 22 ° C; 60% Luftfeuchtigkeit) mit regelmäßiger Bewässerung.
10. Führen Sie die Analysen je nach Forschungsfrage zu den bevorzugten Zeitpunkten nach der Inokulation durch (die hier verwendeten genauen Zeitpunkte finden Sie in den Abbildungslegenden). Im Folgenden finden Sie einige Vorschläge.
    1. Machen Sie Fotos von den Pflanzen mit einer Digitalkamera von oben und halten Sie den Abstand für jedes Foto gleich. Quantifizieren Sie die Blattfläche (z. B. mit ImageJ²² oder BlattFlaeche^17,19; verwenden Sie den Durchmesser der Töpfe^, um die Skala einzustellen) und vergleichen Sie infizierte und Kontrollgruppen. Kategorisieren Sie die Entwicklung von Krankheitssymptomen (z. B. kleinere, gelblichere oder nekrotische Blätter)¹³.
       HINWEIS: Das Entfernen von Stängeln von Arabidopsis erleichtert das Fotografieren der Rosetten.
    2. Entfernen Sie die Wurzeln und definieren Sie die Biomasse (Frischgewicht) von Trieben aus infizierten und kontrollieren Sie Proben durch Wiegen. Bestimmen Sie das relative Frischgewicht¹⁹.
    3. Alternativ können Sie die Pflanzenhöhe messen oder Pilzauswuchs aus Stammsegmenten kategorisieren, um die Schwere der Erkrankung zu bewerten¹³.
    4. Sammeln Sie Proben für molekulare Analysen wie folgt.
    5. Arabidopsis: Entfernen Sie die Stängel. Schneiden Sie die Rosetten an der Wurzelkrone ab. Kombinieren Sie 4-5 Rosetten aus verschiedenen Pflanzen zu einer Probe. Das Blattmaterial in flüssigem Stickstoff einfrieren.
       HINWEIS: Bei Wurzeln ist es schwierig, sie ausreichend vom Boden zu reinigen, ohne die Genexpression durch Waschen neu zu programmieren.
    6. Raps/Tomate: Schneiden Sie Stielsegmente aus dem Hypokotyl (z. B. 1 cm lang; immer die gleiche Stammregion nehmen). Kombinieren Sie Material aus 4-5 Pflanzen zu einer Probe und frieren Sie es in flüssigem Stickstoff ein.
    7. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff. Extrahieren Sie die Gesamt-DNA aus 100 mg Blatt- oder Stammmaterial, um mittels qPCR die Menge an Pilz-DNA im Verhältnis zur Pflanzen-DNA zu bestimmen (siehe¹⁹).
    8. Mahlen Sie die Proben in flüssigem Stickstoff, nehmen Sie 100 mg Pflanzenmaterial und extrahieren Sie die gesamte RNA. Führen Sie die qRT-PCR durch, um die Expression von Pflanzengenen (oder Pilzgenen) bei Befall zu bestimmen (siehe¹⁹).

7. Analyse der Daten

1. Berechnen Sie den Durchschnitt und die Standardabweichung (± SD) basierend auf den biologischen Replikaten.
2. Berechnen Sie die relativen Werte, indem Sie alle Ergebnisse der infizierten Gruppe durch das Ergebnis der Kontrolle dividieren. Zeigen Sie den Durchschnitt z. B. als "relativ zum Mock" oder "relativ zum Wildtyp" an.
3. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz zwischen Gruppen.

Abbildung 1: Zusammenstellung der drei Impfsysteme und einzelne Schritte in den Protokollen. Diese Abbildungen veranschaulichen die Systeme mit der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Bei anderen Pflanzenarten muss der Zeitpunkt angepasst werden. Orangefarbene Kästchen heben hervor, für welche Folgeanalysen mit dem jeweiligen System am meisten empfohlen werden. (A) Für das Impfsystem in Petrischalen¹⁷ das Medium gießen und verfestigen lassen. Bewahren Sie die Teller über Nacht im Kühlschrank auf. Schneiden und entfernen Sie dann das obere Drittel sowie den Infektionskanal (IC) mit einem Skalpell (weiße Bereiche in der Abbildung wurden vom Agar entfernt, während bläuliche Bereiche den Agar darstellen). Legen Sie die Samen auf die Schnittfläche und schließen Sie die Petrischale. Nach der Schichtung die Platten vertikal platzieren und die Pflanzen wachsen lassen. Sobald die meisten Wurzeln den Infektionskanal erreicht haben, fügen Sie die Sporenlösung mit einer Pipette direkt in den Kanal hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Schließen Sie die Petrischalen und inkubieren Sie sie vertikal in einer Wachstumskammer. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse mit quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR), Mikroskopie mit Reporterlinien und Quantifizierung mikrobieller DNA. (B) Für das Impfsystem in Plastikbechern¹⁹ gießen Sie das Medium und übertragen Sie die trennende Kunststoffschicht mit den vorgefertigten Löchern (vier kleine Löcher in den Ecken zum Platzieren der Samen und ein großes Loch in der Mitte für den Infektionskanal). Lassen Sie das Medium erstarren. Schneiden und entfernen Sie das Agarmedium im mittleren Loch mit einem Skalpell, um den Infektionskanal (IC) zu erhalten. Kratzen Sie das Medium in die kleineren Löcher und übertragen Sie die Samen. Schließen Sie den Becher mit einem umgekehrten Becher und verschließen Sie ihn mit luftdurchlässigem Klebeband (gelb symbolisiert). Lass die Pflanzen wachsen. Zur Impfung die Sporenlösung mit einer Pipette direkt in den Infektionskanal geben. Schließen Sie das System und setzen Sie die Kultivierung in der Wachstumskammer fort. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse mit qRT-PCR, die Quantifizierung mikrobieller DNA und die Bestimmung des Frischgewichts, der Blattfläche oder anderer Krankheitsmerkmale. (C) "Wurzeldip-Impfung^{"15,17,23,24:} Für das bodenbasierte Impfsystem die Töpfe mit einem Erde-Sand-Gemisch füllen. Übertragen Sie die Samen und lassen Sie die Sämlinge wachsen. Graben Sie Pflanzen ähnlicher Größe aus und waschen Sie die Wurzeln in Wasser. Legen Sie die gewaschenen Wurzeln in eine Petrischale, die die Lösung mit den Sporen hält. Legen Sie nach der Inkubation einzelne Pflanzen in Töpfe mit Erde ein. Ansätze, die folgen können, sind die Expressionsanalyse in Blättern mit qRT-PCR, die Quantifizierung der mikrobiellen DNA und die Bestimmung des Frischgewichts, der Blattfläche oder anderer Krankheitsmerkmale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Nach dem Protokoll wurden die Pflanzen kultiviert und mit V. longisporum (Stamm Vl4325) oder V. dahliae (Isolat JR218) beimpft. Verschiedene Szenarien wurden entwickelt, um die Wirksamkeit zu beweisen und einige Fähigkeiten der gegebenen Protokolle hervorzuheben. Repräsentative Ergebnisse werden gezeigt.

Die expressionale Induktion von Genen, die an der antimikrobiellen Indol-Glucosinolat-Biosynthese (IG) beteiligt sind, ist ein zuverlässiger Indikator für die Beurteilung einer Verticillium-Infektion 17,19,26. In Arabidopsis ist MYB51 (MYB-Domänenprotein 51; AT1G18570) kodiert für einen Transkriptionsfaktor, der an der Aktivierung von Genen beteiligt ist, die für die IG-Biosynthese notwendig sind27. MYB51 kann als Markergen dienen, das auf einen erfolgreichen Befall hinweist, da es in den Wurzeln konsequent durch V. longisporum 26 oder andere bodenbürtige Pilze wie Phytophthora parasitica26 und Fusarium oxysporum21 induziert wird. Zwei Tage nach der Inokulation (2 dpi) im Petrischalen-basierten System wurde die Induktion von MYB51 in den Wurzeln der Arabidopsis visualisiert. Die Reporter-Pflanzenlinie PromMYB51::YFP 21 zeigte eine Promotoraktivierung und eine qRT-PCR-Analyse bestätigte eine signifikante transkriptionelle Induktion dieses Gens (Abbildung 2A-B). Solche Experimente zielen darauf ab, expressionale Veränderungen in den Wurzeln während der Infektion zu bestimmen.

Da die in dieser Studie verwendeten Verticillium-Arten einen vaskulären Lebensstil führen und sich von der Wurzel über die Xylemgefäße zum Spross ausbreiten, kann die Menge an Pilz-DNA in Blättern als Parameter für den Grad der Pilzvermehrung bestimmt werden. Arabidopsis wurde im In-vitro-System in Plastikbechern mit der Wurzel geimpft und die Rosetten wurden 12 Tage später geerntet. Im Vergleich zu dem in der Scheinkontrolle nachgewiesenen Hintergrundwert wurden erhebliche Mengen an Pilz-DNA in Blättern infizierter Pflanzen gefunden (Abbildung 2C). Dies zeigt, dass die Infektion erfolgreich fortgeschritten ist. Für weitere Untersuchungen kann die Menge an Pilz-DNA in verschiedenen Pflanzengenotypen quantifiziert werden, um Einblicke in die Wurzelabwehrreaktionen zu erhalten. Zusätzlich wurden zu diesem Zeitpunkt Wurzeln gesammelt, um die Induktion des Markergens mittels qRT-PCR zu testen. Die MYB51-Transkripthäufigkeit wurde signifikant angereichert (Abbildung 2D). Dies zeigt, dass Empfindlichkeitstests und Expressionalanalysen problemlos parallel zum Bechersystem durchgeführt werden können, was den großen Vorteil dieses Verfahrens unterstreicht.

Um Hinweise darauf zu geben, dass auch andere Modellpflanzenarten eingeführt werden können, wurde Raps mit V. longisporum und Tomaten mit V. dahliae im System in Plastikbechern infiziert. Am Tag 12 nach der Impfung an den Wurzeln wurde die Menge an Pilz-DNA in Stammsegmenten quantifiziert, die an der Basis der Sämlinge geschnitten wurden (Abbildung 2E-F). Pilz-DNA war in beiden Pflanzenarten nachweisbar, was auf die Vermehrung der Krankheitserreger innerhalb der Pflanze hinweist. Auch hier konnten verschiedene Pflanzengenotypen getestet werden, um Erkenntnisse über Abwehrmechanismen zu gewinnen.

Wenn sich die Wurzelbesiedelungsmikrobe von Interesse nicht von den Wurzeln zu den Blättern ausbreitet, ist es nicht möglich, die Menge an mikrobieller DNA in Blättern als Parameter für die Schwere der Erkrankung zu quantifizieren. Eine weitere Möglichkeit, die Schwere der Erkrankung zu messen, ist die Beurteilung und Extrapolation der Symptome am Pfad. Um dies zu veranschaulichen, wurde Arabidopsis im bodenbasierten System mit V. dahliae beimpft und die Grünblattfläche ausgewertet (Abbildung 2G-H). Während die Rosetten von Mock-behandelten Pflanzen gesund und grün aussahen, hatten pathogen-infizierte Pflanzen eine reduzierte Blattgröße und gelbliche oder sogar nekrotische Blätter. Auf diese Weise kann die Anfälligkeit verschiedener Pflanzengenotypen analysiert und bestätigt werden, beispielsweise durch die Quantifizierung des Frischgewichts.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse, die durch die Einhaltung der Protokolle erzielt wurden. (A,B) Arabidopsis-Wurzeln wurden mit V. longisporum im Petrischalensystem beimpft. Die Reporterlinie Prom MYB51::YFP 21 ergab eine starke Aktivierung des MYB51-Promotors in infizierten Wurzeln im Vergleich zur Scheinkontrolle (Mikroskopie bei 2 dpi; Skalenbalken: 50 μm). Die transkriptionelle Induktion von MYB51 in Wildtypwurzeln (WT) wurde mit einer qRT-PCR-Analyse (2 dpi) weiter bestätigt. Die Werte infizierter Proben werden relativ zu Scheinproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 5; ± SD). (C) Systemische Besiedlung durch V. longisporum: Nach der Impfung von Arabidopsis-Wurzeln im Bechersystem wurde die relative Menge an Pilz-DNA in Blättern durch quantitative PCR (qPCR; 12 dpi) bestimmt. Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundpegel in Mock-Samples angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). (D) V. longisporum infizierte und mit Mock behandelte Wurzeln wurden aus dem Bechersystem geerntet und eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt. Die Werte infizierter Proben werden relativ zu Scheinproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). Es wurde festgestellt, dass MYB51 transkriptionell induziert ist (12 dpi). (E) Raps wurde im Bechersystem mit V. longisporum geimpft, und die relative Menge an Pilz-DNA wurde durch qPCR in Stammsegmenten (12 dpi) quantifiziert. Die Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundniveau in Mock-Stichproben angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 3; ± SD). (F) Die Tomate wurde im Bechersystem mit V. dahliae geimpft und die relative Menge an Pilz-DNA wurde durch qPCR in Stammsegmenten (12 dpi) quantifiziert. Werte infizierter Stichproben werden relativ zum Hintergrundniveau in Mock-Samples angegeben (auf 1 gesetzt) (n = 5; ± SD). (G,H) Arabidopsis wurde mit V. dahliae im bodenbasierten System beimpft und repräsentative Bilder von infizierten und simulierten Pflanzen werden gezeigt (21 dpi). Der grüne Blattbereich wurde untersucht. Relativ zu Mock (auf 1 gesetzt) hatten infizierte Pflanzen weniger grüne Blattfläche (n = 5; ± SD). (B-F,H) Für Primerpaare siehe19; Statistik: T-Test des Schülers relativ zum Mock, * p≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.