Nachweis der postreplizierenden Lückenakkumulation und -reparatur in menschlichen Zellen mit dem DNA-Faser-Assay

Summary

Hier beschreiben wir zwei Modifikationen des DNA-Faserassays zur Untersuchung einzelsträngiger DNA-Lücken bei der Replikation von DNA nach Läsionsinduktion. Der S1-Faserassay ermöglicht die Detektion von postreplizierenden Lücken mit der ssDNA-spezifischen S1-Endonuklease, während der lückenfüllende Assay die Visualisierung und Quantifizierung der Spaltreparatur ermöglicht.

Abstract

Der DNA-Faser-Assay ist eine einfache und robuste Methode zur Analyse der Replikationsgabeldynamik, basierend auf dem Immunnachweis von Nukleotidanaloga, die während der DNA-Synthese in menschliche Zellen eingebaut werden. Diese Technik hat jedoch eine begrenzte Auflösung von einigen tausend Kilobasen. Folglich sind postreplizierte einzelsträngige DNA-Lücken (ssDNA), die so klein wie einige hundert Basen sind, mit dem Standardassay nicht nachweisbar. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version des DNA-Faserassays, der die S1-Nuklease verwendet, ein Enzym, das speziell ssDNA spaltet. In Gegenwart von postreplizierenden ssDNA-Lücken zielt die S1-Nuklease auf die Lücken ab und spaltet sie, wodurch kürzere Traktate erzeugt werden, die als Auslesevorgang für ssDNA-Lücken auf laufenden Gabeln verwendet werden können. Diese postreplizierenden ssDNA-Lücken entstehen, wenn beschädigte DNA diskontinuierlich repliziert wird. Sie können über Mechanismen repariert werden, die von der Genomreplikation entkoppelt sind, in einem Prozess, der als lückenfüllende oder postreplizierte Reparatur bekannt ist. Da lückenfüllende Mechanismen eine DNA-Synthese unabhängig von der S-Phase beinhalten, können auch Änderungen im DNA-Fasermarkierungsschema verwendet werden, um lückenfüllende Ereignisse zu überwachen. Insgesamt sind diese Modifikationen des DNA-Faser-Assays mächtige Strategien, um zu verstehen, wie postreplizierende Lücken im Genom menschlicher Zellen gebildet und gefüllt werden.

Introduction

Bahnbrechende Arbeiten haben Hinweise auf die Anhäufung von postreplizierenden einzelsträngigen (ssDNA) Lücken bei der Behandlung mit DNA-schädigenden Wirkstoffen in Bakterien 1 und menschlichen Zellen ^2,3 geliefert. Während der Replikation beschädigter DNA-Vorlagen kann die DNA-Synthese-Maschinerie die Läsionen umgehen, indem sie spezifische Transläsionssynthese-DNA-Polymerasen oder durch Template-Switching-Mechanismen verwendet. Alternativ kann das Replisom auch einfach die Läsion überspringen und eine ssDNA-Lücke hinterlassen, die später repariert werden soll. In jüngerer Zeit zeigte....

Protocol

Da die Studie menschliche Zellen verwendet, wurde die Arbeit von der Ethikkommission des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften an der Universität von São Paulo (ICB-USP, Zulassungsnummer # 48347515.3.00005467) für die Forschung mit menschlichen Proben genehmigt.

HINWEIS: Die hier beschriebenen Protokolle wurden in früheren Veröffentlichungen mit geringfügigen Änderungen^14,16,28 verwendet. Hier liegt der Fokus auf der Verwendung von ultraviolettem Licht C (UVC) als DNA-schädigendes Mittel. Aber auch andere DNA-schädigende Mittel wie Cisplatin....

Results

Wenn im S1-Faser-Assay die Behandlung mit einem genotoxischen Wirkstoff zu postreplizierenden ssDNA-Lücken führt, sind die Gesamtlängen der DNA-Fasern aus S1-behandelten Kernen bei der Behandlung mit DNA-Schäden kürzer als bei unbehandelten Proben sowie bei Proben, die mit dem genotoxischen Mittel behandelt wurden, aber keiner S1-Spaltung unterzogen wurden (Abbildung 1).

Alternativ, wenn die Behandlung mit der S1-Nuklease die Länge der DNA-Fasern im Vergleich zu u.......

Discussion

Kritische Schritte des Standard-DNA-Faser-Assay-Protokolls wurden in einer früheren Publikation^{diskutiert 32}. Hier beschreiben wir modifizierte Versionen des Standard-DNA-Faser-Assays, um das Vorhandensein von postreplizierenden ssDNA-Lücken sowie deren Reparatur durch Lückenfüllung zu untersuchen, die ursprünglich in¹⁴ beschrieben wurden. Im Zusammenhang mit der postreplizierenden Präsenz von ssDNA-Lücken wäre die Verwendung der S1-Nuklease im S1-Faserprotokoll höchstwahrs.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Essigsäure, Glacial	Synth	64-19-7	Alternativ, BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
Ammoniumhydroxid	Synth	1336-21-6	Oder ähnlich
Antikörper Anti-Maus IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005-Antikörper
Anti-Ratte Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470-Antikörper
Maus Anti-BrdU	Becton Disckson	347580-Antikörper
Ratte Anti-BrdU	Abcam	Ab6326-Biologische
Sicherheitshaube	Pachane	PA 410	Verwendung Haube im Labor
vorhanden BSA (Rinderserumalbumin)	Sigma-Aldrich	A3294	Oder ähnlich
Zellschaber	Thermo Scientific	179693	Oder ähnlich
CldU	Millipore-Sigma	C6891-Cloridrinsäure
	Synth	7647-01-0	Oder ähnlich
Konfokales Zeiss LSM Serie (7, 8 oder 9)	Zeiss-Oder		ähnliches
Deckglas (oder Deckgläser)	Thermo Scientific	152460	Alternativ, Olen - Kasvi Deckglas (24 x 60 mm) - K5-2460
DMEM - High Glucose	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	Verwenden Sie Kulturmedien, die für die verwendete Zelllinie spezifisch sind.
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat)	Sigma-Aldrich	E5314	Oder ähnliches
Epifluoreszenzmikroskop Axiovert 200	Zeiss-Oder		ähnliches
FBS (Fötales Rinderserum)	Gibco	12657-029	Oder ähnlich
Forma Serie II Wasserummantelter CO2-Inkubator	Thermo Scientific 3110	13-998-074	Verwenden Sie den im Laborglas
	Objektträger Sigma-Aldrich	S5516	Oder ähnlich
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5	Oder ähnlich
Idu	Millipore-Sigma	I7125-Magnesium
Chloride	Synth	7791-18-6	Oder ähnlich
Methanol	Merck	67-56-1	Oder ähnlich
Objektträger	Denville	M1021	Alternativ, Olen - Kasvi Objektträger - K5-7105 OR Präzisionsglaslinie - 7105-1
MOPS (&Aakut; Cido 3-Morfolinopropano 1-sulfô nico)	Synth	1132-61-2	oder ähnlich
Nocodazol	Sigma-Aldrich	31430-18-9-PBS
(Phosphate Buffer Saline)	Life Thechnologies	3002	Oder ähnlich
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Oder ähnlich
ProLong Gold AntiFade Eindeckmittel	Invitrogen	P36930	Alle Antifading-Eindecklösung für Immunfluoreszenz könnte verwendet werden
S1-Nuklease, die aus Aspergillus oryzae	Invitrogen	18001-016	. Die S1-Nuklease (1/100 - 1/200) in dem vom Hersteller bereitgestellten S1-Nuklease-Verdünnungspuffer vorverdünnen, aliquotieren und bei -20 & deg lagern; C
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	BioRad	161-0302	Or similar
Sodium Acetate Trihydrate	Sigma-Aldrich	6131-90-4	Or similar
Sodium Chloride	Synth	7647-14-5	Oder ähnlich
Saccharose	Sigma-Aldrich	57-50-1	Oder ähnlich
Tris Base	West Lab Research	BP152-1	Oder ähnlich
Triton X-100	Synth	9002-93-1	Oder ähnlich
Trypsin	Gibco	25200072	Oder ähnlich
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	Oder ähnlich
UVC-Lampe	Non	Specific-Essential	: Emissionslänge von 254 nm
VLX-3W UV-Radiometer	Vilber Loumart-Or		similar
Zinkacetat	Sigma-Aldrich	557-34-6	Oder ähnlich