Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.
Im menschlichen Körper verlaufen die meisten der wichtigsten physiologischen Reaktionen, die an der Immunantwort und der Blutgerinnung beteiligt sind, auf den Membranen der Zellen. Ein wichtiger erster Schritt in jeder membranabhängigen Reaktion ist die Bindung von Protein an die Phospholipidmembran. Ein Ansatz zur Untersuchung der Proteinwechselwirkung mit Lipidmembranen wurde unter Verwendung fluoreszierend markierter Proteine und Durchflusszytometrie entwickelt. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Protein-Membran-Interaktionen mit lebenden Zellen und natürlichen oder künstlichen Phospholipid-Vesikeln. Der Vorteil dieser Methode ist die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Bei dieser Methode werden Proteine mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Es können jedoch sowohl selbst hergestellte als auch kommerziell erhältliche, fluoreszierend markierte Proteine verwendet werden. Nach der Konjugation mit einem fluoreszierenden Farbstoff werden die Proteine mit einer Quelle der Phospholipidmembran (Mikrovesikel oder Zellen) inkubiert und die Proben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die erhaltenen Daten können zur Berechnung der kinetischen Konstanten und des Gleichgewichts Kd verwendet werden. Darüber hinaus ist es möglich, die ungefähre Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Phospholipidmembran mit speziellen Kalibrierperlen abzuschätzen.
Biomembranen trennen den inneren Inhalt tierischer Zellen und des extrazellulären Raums. Beachten Sie, dass Membranen auch Mikrovesikel umgeben, die während des Lebenszyklus der Zelle gebildet wurden, und Organellen. Die Zellmembran besteht überwiegend aus Lipiden und Proteinen. Membranproteine übernehmen Signal-, Struktur-, Transport- und Klebefunktionen. Die Lipiddoppelschicht ist aber auch essentiell für die Wechselbeziehung der tierischen Zelle mit dem extrazellulären Raum. Diese Arbeit schlägt eine Methode vor, um die periphere Wechselwirkung externer Proteine mit der Lipidmembran zu untersuchen.
Das auffälligste Beispiel für Reaktionen, die auf der äußeren Membranschicht einer tierischen Zelle auftreten, ist die Blutgerinnungsreaktion. Ein wichtiges Merkmal der Blutgerinnung ist, dass alle Hauptreaktionen auf den Phospholipidmembranen von Zellen und Mikrovesikeln ablaufen, die aus diesen Zellen entstehen, und nicht im Plasma 1,2,3. Membranabhängige Reaktionen umfassen den Prozess des Startens der Koagulation (auf den Zellmembranen des Subendothels, des entzündeten Endothels oder der aktivierten Immunzellen, unter Beteiligung eines Gewebefaktors), alle Reaktionen der Hauptkaskadenaktivierung der Faktoren IX, X, Prothrombin; Aktivierung von Faktor XI durch Thrombin (auf den Membranen von aktivierten Blutplättchen, Erythrozyten, Lipoproteinen und Mikrovesikeln); Reaktionen des Protein-C-Signalwegs; Inaktivierung von Gerinnungsenzymen (auf den Membranen von Endothelzellen unter Beteiligung von Thrombomodulin-Cofaktoren, Endothelprotein-C-Rezeptor, Heparansulfat); und Kontaktwegreaktionen (auf Membranen von Blutplättchen und einigen Mikrovesikeln unter Beteiligung unbekannter Cofaktoren). Daher ist es unmöglich, die Blutgerinnung zu untersuchen, ohne die Wechselwirkung verschiedener Plasmaproteine mit der Membran von Blutzellen zu untersuchen.
Dieser Beitrag beschreibt eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Lipidmembranen von Zellen oder Mikrovesikeln. Dieser Ansatz wurde ursprünglich vorgeschlagen, um die Wechselwirkung von Blutplasma mit Blutplättchen und künstlichen Phospholipidvesikeln zu untersuchen. Darüber hinaus interagieren die meisten der untersuchten Proteine direkt mit negativ geladenen Membranphospholipiden, insbesondere mit Phosphatidylserin 4,5. Hinzu kommen Proteine, deren Interaktion mit der Membran durch spezielle Rezeptoren vermitteltwird 6.
Eine wichtige Fähigkeit der Durchflusszytometrie ist die Unterscheidung zwischen freien und gebundenen Liganden ohne zusätzliche Trennung. Diese Eigenschaft der Zytometrie ermöglicht die Untersuchung der Ligandengleichgewichtsbindung am Endpunkt und hilft bei der Durchführung kontinuierlicher kinetischer Messungen. Die Technik ist unausgereift und erfordert keine komplexe Probenvorbereitung. Die Durchflusszytometrie wird aktiv eingesetzt, um die Dynamik der Wechselwirkung zwischen fluoreszierenden Peptiden, Rezeptoren und G-Proteinen in intakten und waschmitteldurchlässigen Neutrophilenquantitativ zu untersuchen 7. Dieser Ansatz eignet sich auch für die Erforschung von Protein-DNA-Interaktionen und der Kinetik der Endonukleaseaktivitätin Echtzeit 8. Im Laufe der Zeit wurde diese Methode verwendet, um hochaffine Protein-Protein-Interaktionen mit gereinigten Lipidvesikeln9 oder, allgemeiner, mit Membranproteinen, die in einem hocheffizienten Sf9-Zellexpressionssystem10 exprimiert werden, quantitativ zu untersuchen. Quantitative Methoden wurden auch zur Charakterisierung von Protein-Liposom-Interaktionen mittels Durchflusszytometrie für Transmembranproteinebeschrieben 11.
Diese Technik verwendet selbst hergestellte Kalibrierperlen, um die Verwendung von kommerziell erhältlichen Perlenzu vermeiden 7. Die zuvorverwendeten Kalibrierperlen 7 sollten mit Fluorescein arbeiten, was das Sortiment an zugänglichen fluoreszierenden Liganden auf den Proteinen erheblich einschränkte. Darüber hinaus bietet dieses Dokument eine neue Möglichkeit, kinetische Daten für eine angemessene Zeitauflösung zu erfassen und zu analysieren. Obwohl diese Methode für künstliche Phospholipidvesikel beschrieben wird, gibt es keine offensichtlichen Einschränkungen für ihre Anpassungsfähigkeit an Zellen, natürliche Vesikel oder künstliche Phospholipidvesikel mit einer anderen Lipidzusammensetzung. Das hierin beschriebene Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Parameter Wechselwirkung (kon, koff) und Gleichgewicht (Kd) und erleichtert die quantitative Charakterisierung der Anzahl der Proteinbindungsstellen auf der Membran. Beachten Sie, dass diese Technik eine ungefähre Schätzung der Anzahl der Bindungsstellen liefert. Die Vorteile der Methode sind ihre relative Einfachheit, Zugänglichkeit und Anpassungsfähigkeit an native Zellen und natürliche und künstliche Mikrovesikel.
Die vorgeschlagene Methode kann für eine grobe Charakterisierung der Wechselwirkung von Proteinen mit Phospholipidmembranen aus verschiedenen Quellen und Zusammensetzungen angepasst werden. Die hier beschriebene quantitative Durchflusszytometrie räumt der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) in mehreren Parametern zu. Insbesondere hat es eine geringere Empfindlichkeit und Zeitauflösung und erfordert eine fluoreszierende Markierung von Proteinen. Die fluoreszierende Markierung kann bei vielen Proteinen zu einer Verände…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren wurden durch ein Stipendium der Russian Science Foundation 20-74-00133 unterstützt.
A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |