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Methodenartikel

Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna

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DOI:

10.3791/63470

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1. Februar 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Phormidium lacuna ist ein fadenförmiges Cyanobakterium, das aus marinen Felsbecken isoliert wurde. Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von Filamenten aus natürlichen Quellen, DNA-Extraktion, Genomsequenzierung, natürliche Transformation, Expression von sfGFP, Kryokonservierung und Motilitätsmethoden.

Zusammenfassung

Cyanobakterien stehen im Mittelpunkt der Grundlagenforschung und biotechnologischer Projekte, in denen Sonnenenergie für die Biomasseproduktion genutzt wird. Phormidium lacuna ist ein neu isoliertes filamentöses Cyanobakterium. Dieses Papier beschreibt, wie neue filamentöse Cyanobakterien aus marinen Gesteinsbecken isoliert werden können. Es beschreibt auch, wie DNA aus Filamenten extrahiert werden kann und wie die Genome sequenziert werden können. Obwohl die Transformation für viele einzellige Arten etabliert ist, wird sie für filamentöse Cyanobakterien seltener berichtet. Eine vereinfachte Methode zur natürlichen Umwandlung von P. lacuna wird hier beschrieben. P. lacuna ist das einzige Mitglied der Ordnung Oscillatoriales, für das eine natürliche Transformation etabliert ist. Dieses Papier zeigt auch, wie die natürliche Transformation verwendet wird, um Superfolder Green Fluorescent Protein (sfGFP) zu exprimieren. Ein endogener cpcB-Promotor induzierte eine etwa 5-mal stärkere Expression als cpc560-, A2813- oder psbA2-Promotoren von Synechocystis sp. PCC6803. Weiterhin wurde ein Verfahren zur Kryokonservierung von P. lacuna und Synechocystis sp.CPP 6803 etabliert und Verfahren zur Beurteilung der Motilität in einem flüssigen Medium und auf Agar- und Kunststoffoberflächen beschrieben.

Einleitung

Cyanobakterien sind prokaryotische Organismen, die die Photosynthese als Energiequelle nutzen 1,2. Die Forschung konzentriert sich zunehmend auf Cyanobakterienarten. Mehrere Cyanobakterien können mit DNA3 transformiert werden. Gene können bei diesen Arten ausgeschaltet oder überexprimiert werden. Die Transformation ist jedoch auf einige Arten beschränkt 4,5,6,7,8,9,10,11, und es kann schwierig sein, die Transformation in Stämmen aus Kultursammlungen oder der Wildnis 8 festzustellen. Stämme der fadenförmigen Art Phormidium lacuna (Abbildung 1) wurden aus marinen Gesteinsbecken isoliert, in denen die Umweltbedingungen wie Salzkonzentrationen oder Temperatur im Laufe der Zeit schwanken. Diese fadenförmigen Cyanobakterien können als Modellorganismen für die Ordnung Oscillatoriales12 verwendet werden, zu der sie gehören.

Während Versuchen, den Gentransfer durch Elektroporation zu testen 13,14, wurde festgestellt, dass P. lacuna durch natürliche Transformationtransformiert werden kann15. Dabei wird DNA auf natürliche Weise von einigen Zellen aufgenommen. Im Vergleich zu anderen Transformationsmethoden16,17 hat die natürliche Transformation den Vorteil, dass keine zusätzlichen Werkzeuge erforderlich sind, die das Verfahren erschweren könnten. Zum Beispiel erfordert die Elektroporation richtige Küvetten, intakte Drähte und die Auswahl der richtigen Spannung. P. lacuna ist derzeit das einzige Oscillatoriales-Mitglied, das anfällig für natürliche Transformation ist. Da das ursprüngliche Protokoll auf Elektroporationsprotokollen basiert, enthielt es immer noch mehrere Waschschritte, die möglicherweise unnötig sind. Verschiedene Ansätze wurden getestet, um das Protokoll zu vereinfachen, was zu dem hier vorgestellten Transformationsprotokoll führte.

Die Genomsequenz ist essentiell für weitere molekulare Studien, die auf Gen-Knockout oder Überexpression basieren. Obwohl Genomsequenzen mit Next-Generation-Sequenziermaschinen innerhalb kurzer Zeit erhalten werden können, kann die Extraktion von DNA schwierig sein und hängt von der Spezies ab. Mit P. lacuna wurden mehrere Protokolle getestet. Eine modifizierte Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-basierte Methode wurde dann etabliert, was zu einer akzeptablen Reinheit der DNA und DNA-Ausbeuten jedes Reinigungszyklus für die weitere Arbeit im Labor führte. Das Genom von fünf Stämmen könnte mit diesem Protokoll sequenziert werden. Der nächste logische Transformationsschritt bestand darin, die Proteinexpression in P. lacuna zu etablieren.

Das in diesem Protokoll als Markerprotein verwendete sfGFP kann mit jedem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen werden. Alle getesteten Promotoren konnten für den P. lacuna sfGFP-Ausdruck verwendet werden. Die zunehmende Anzahl von Belastungen, die sich aus der Transformation ergeben, hat dazu geführt, dass eine Methode zur Speicherung der Kulturen erforderlich ist. Solche Methoden sind für Escherichia coli und viele andere Bakterienetabliert 18. In Standardprotokollen werden Glycerinkulturen hergestellt, in flüssigem Stickstoff übertragen und bei -80 °C gelagert. Diese Methode erfordert nur wenige Schritte und ist für die Arten, für die sie etabliert ist, sehr zuverlässig. Das Standardprotokoll war für P. lacuna nicht durchführbar, da lebende Zellen nicht in allen Fällen wiederhergestellt werden konnten. Als jedoch Glycerin nach dem Auftauen entfernt wurde, überlebten die Zellen aller Studien. Für die Analyse der Motilität von P. lacuna werden einfache Methoden vorgestellt, die mit der Knockout-Mutagenese kombiniert werden können, um Typ-IV-Pili oder die Rolle von Photorezeptoren zu untersuchen. Diese Assays unterscheiden sich von denen der einzelligen Cyanobakterien 19,20,21 und können auch für andere Oszillatorien nützlich sein.

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Protokoll

1. Isolierung von der natürlichen Umwelt

HINWEIS: Grünalgen, Kieselalgen, fadenförmige Cyanobakterien und andere Mikroalgen können isoliert werden. Das Protokoll kann für alle Mikroalgenarten aus Gesteinsbecken verwendet werden, die unter Laborbedingungen wachsen. Filamentöse Cyanobakterien, die zu Oscillatoriales gehören, sind leicht an ihrer Bewegung und filamentösen Form zu erkennen. Die Spezies kann in einem halbreinen Zustand durch Genomsequenzierung oder 16S rRNA-Sequenzierung identifiziert werden.

  1. Transfer von flüssigen Meerwasserproben aus marinen Felsbecken (d. H. Hohlräumen in der felsigen Küste) in 50-ml-Kolben. Notieren Sie sich für jeden Kolben den genauen Ort oder die genauen Koordinaten der natürlichen Quelle. Wenn möglich, filtern Sie den Inhalt durch 50 μm Netze, um die Mengen an Zooplankton zu reduzieren. Lagern Sie die Proben bei 4 °C, bis sie subkulturiert werden können.
  2. 1 ml Kulturen auf 10 cm Petrischalen mit 3% Bacto-Agar in f/2 medium22,23 (siehe Materialtabelle) geben. Bereiten Sie bis zu 20 Teller vor. Kultivieren unter weißem Licht von 50 μmol m-2 s-1.
    HINWEIS: Für die Kultivierung können höhere Lichtintensitäten verwendet werden. Eine Intensität von bis zu 400 μmol m-2 s-1 kann für P. lacuna verwendet werden, obwohl andere Arten lichtempfindlicher sein könnten.
  3. Nach einer Woche die gewünschten Zellen mit steriler Pinzette auf frische Agarplatten übertragen. Isolieren Sie die Zellen unter einem binokularen Mikroskop unter sterilen Bedingungen. Lagern Sie die alte Agarplatte bei 4 °C, bis Zellen auf der neuen Agarplatte erscheinen und wachsen.
  4. Wiederholen Sie diesen Übertragungsschritt jede Woche, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie das bloße Auge zur Erkennung starker Verunreinigungen und ein Mikroskop mit 400-facher Vergrößerung für zusätzliche Kontrollen auf Kontamination.
  5. Wenn eine Probe frei von Kontamination zu sein scheint, testen Sie auf bakterielle oder pilzliche Kontamination auf Agarplatten. Übertragen Sie einen Bruchteil der Kultur mit einer Impfschleife auf eine LB 24-Agarplatte (10 cm Durchmesser), halten Sie die Platte bei Raumtemperatur und überprüfen Sie das Wachstum von Verunreinigungen über1-3 Tage.
  6. Wenn eine sterile filamentöse Cyanobakterienspezies erhalten wird, verwenden Sie sie für weitere Kulturarbeiten. P. lacuna in Flüssigkeit oder auf Bacto-Agar-Platten kultivieren. Verwenden Sie 250-ml-Kolben mit 50 ml f/2-Medium oder f/2+- Medium für die Flüssigkultur.

2. DNA-Extraktion

ANMERKUNG: Diese Methode ist vom 25 26 

  1. Bereiten Sie zwei Kolben mit 50 ml f/2 Medium vor. Beimpfen Sie jeden mit ~ 1 ml P. lacuna-Filamenten aus anderen Anbaukulturen. Halten Sie die Kulturen für 7 Tage oder länger unter Bewegung (horizontale Drehung) bei 50 U / min unter weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) bei 25 °C.
  2. Behandeln Sie die Kultur mit Ultraschall (siehe Tabelle der Materialien) für 2 min mit voller Energie. OD bei 750 nm messen; Überprüfen Sie, ob es ~ 0,5 ist. Bauen Sie die Kulturen weiter aus, wenn die OD zu niedrig ist.
  3. Sammeln Sie die Filamente um 5.000 × g, 20 min Zentrifugation. Entfernen Sie den Überstand. Die Filamente mit Restflüssigkeit in die Kammer einer French Press27 geben. Stellen Sie den Druck der French Press auf 20.000 psi ein und extrahieren Sie die Zellen.
    HINWEIS: Die französische Presse wird alle Zellen lysieren und die DNA freisetzen; starke Scherkräfte erzeugen 1.500 bp DNA-Fragmente.
  4. Die Probe wird 10 min lang bei 10.000 × g zentrifugiert und der Überstand entfernt.
  5. 400 μL Lysepuffer (4 M Harnstoff, 0,1 M Tris/Cl, pH 7,4) und 50 μL Proteinase K (10 mg/ml) in das Pellet geben. Erhitzen Sie die Probe 60 min lang auf 55 °C mit Schütteln bei 550 U/min.
  6. 1 ml DNA-Extraktionspuffer (3% CTAB, 1,4 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,1 M Tris/Cl, 1% Sarkosyl, 0,1 M DTT, pH 8) zugeben und 60 min bei 55 °C und 550 U/min inkubieren. Übertragen Sie die Lösungen in Zentrifugationsröhrchen und fügen Sie zwei Volumina Chloroform/Isoamylalkohol hinzu (24/1).
  7. Nach dem Schütteln zentrifugieren Sie die Probe für 5 min bei 9.000 × g. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in Reaktionsfläschchen und fügen Sie 1 ml eiskaltes Ethanol und 50 μL 3 M Natriumacetat hinzu.
  8. Wirbeln Sie die Probe vor und legen Sie sie für 1 h oder länger bei -20 °C.
  9. 5 min bei 10.000 × g (4 °C) zentrifugieren und den Überstand entsorgen. Waschen Sie das Pellet mit 70% Ethanol.
  10. Zentrifugieren Sie die Probe erneut. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet über Nacht. Lösen Sie die DNA in nukleasefreiem Wasser auf. Messen Sie das DNA-Spektrum, um zu überprüfen, ob das OD 260 nm/OD 280 nm zwischen 1,6 und 1,9 liegt.
  11. Analysieren Sie die Größe der DNA auf einem Agarose-Elektrophorese-Gel28.
  12. Sequenzieren Sie die genomische DNA durch Next-Generation-Sequenzierung für 300 Zyklen, mit einer paarigen Endeinstellung und einer Leselänge von 150 Basen (siehe Materialtabellen).
  13. Führen Sie die Assemblierung mit dem entsprechenden Computerprogramm durch. siehe das Beispiel in der Materialtabelle.
  14. Senden Sie den Genomentwurf zur Annotation an den RAST-Server.
    HINWEIS: Laden Sie DNA-Sequenzen hoch, um innerhalb weniger Minuten eine vollständige Annotation zu erhalten.

3. Natürliche Transformation und GFP-Ausdruck

HINWEIS: Die Transformation basiert auf einem Plasmidvektor, der sich in E. coli ausbreitet; pGEM-T oder pUC19 können als Backbone-Vektoren verwendet werden. Klonierungstechniken sind in vielen Laboratorien etabliert; siehe auch Standardprotokolle28 und die Artikel zu Transformationsvektoren für P. lacuna 15,29. Beispiele für Vektoren für den sfGFP-Ausdruck werden im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse beschrieben. Details zu vier noch unveröffentlichten Vektoren finden Sie in der Ergänzungsdatei 1.

  1. Führen Sie alle Schritte mit sterilem Material unter sterilen Laborbedingungen durch (saubere Bank, sterile Glaswaren).
  2. Beimpfen Sie 2 x 50 ml f/2 flüssiges Medium in zwei 250 ml Kolben mit 2 x 1 ml P. lacuna Filamenten aus einer Laufkultur. In weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) unter Bewegung (horizontale Rotation, 50 U/min) für ~5 Tage bei 25 °C kultivieren.
  3. Bereiten Sie ~ 200 μg der Transformationsvektor-DNA mit einem Midi-Prep-Kit (siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
  4. Homogenisieren Sie 100 ml P. lacuna-Zellsuspension (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min. OD bei 750 nm messen (gewünschter Wert = 0,35).
  5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 15 min bei 6.000 × g. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 800 μL (Gesamtvolumen einschließlich Restflüssigkeit und Filamente) der verbleibenden Flüssigkeit und des zusätzlichen f / 2 + -Mediums.
  6. Nehmen Sie acht f/2+ Bacto-Agar-Platten (10 cm Durchmesser) mit 120 μg/ml Kanamycin. Pipette 10 μg DNA in die Mitte jeder Agarplatte. Pipettieren Sie sofort 100 μL Zellsuspension in die Mitte jeder Agarplatte (oben auf der DNA).
  7. Bewahren Sie die Agarplatte ohne Deckel auf der sauberen Bank auf, damit die überschüssige Flüssigkeit verdunsten kann. Schließen Sie den Teller und kultivieren Sie ihn 2 Tage lang in weißem Licht bei 25 °C.
  8. Verteilen Sie die Filamente jeder Agarplatte mit einer Impfschleife auf mehrere frische f/2+ Bacto-Agar-Platten mit 120 μg/ml Kanamycin. Die Platten bei 25 °C in weißem Licht kultivieren und die Kulturen regelmäßig unter dem Mikroskop überprüfen.
  9. Identifizieren Sie lebende, transformierte Filamente nach 7-28 Tagen unter dem Mikroskop. Suchen Sie nach gesunden, grünen Filamenten (Abbildung 2), die sich von anderen Filamenten unterscheiden. Wenn diese grünen Filamente identifiziert werden können, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort; Andernfalls bewahren Sie die Platte für weitere 7 Tage auf.
  10. Verwenden Sie eine Pinzette, um diese identifizierten lebenden Filamente in 50 ml flüssiges f / 2 + - Medium mit 250 μg / ml Kanamycin zu übertragen. Bei weißem Licht bei 25 °C auf einem Shaker kultivieren (horizontale Drehung, 50 U/min). Beobachten Sie das Wachstum bis zu vier Wochen lang.
  11. Übertragen Sie die Filamente zurück auf Agarmedium, das 250 μg/ml Kanamycin enthält, und warten Sie, bis die Filamente wachsen. Nach einigen Tagen einzelne Filamente auf eine frische Agarplatte mit einer höheren Konzentration an Kanamycin, z. B. 500 μg/ml, übertragen. Behalten Sie die Originalplatte bei.
  12. Stellen Sie sicher, dass die Filamente in einer hohen Konzentration von Kanamycin in flüssiger Kultur oder auf Agar vermehrt werden. Erhöhen Sie die Kanamycinkonzentration erneut, um die Segregation zu beschleunigen.
    HINWEIS: Transformierte P. lacuna wächst in bis zu 10.000 μg/ml Kanamycin. Andere Arten tolerieren solche hohen Konzentrationen möglicherweise nicht.
  13. Wenn resistente Zellen gezüchtet und breit über eine Platte verteilt werden, testen Sie die Integration des Inserts in das Genom von P. lacuna , indem Sie eine PCR mit äußeren und inneren Primern durchführen.
    1. Verwenden Sie Primer, die für das Klonen der Einfügung als innere Primer entwickelt wurden.
    2. Für das Design der äußeren Primer wählen Sie Sequenzen, die 5' und 3' der vorgeschlagenen Insertionsstelle auf dem Genom von P. lacuna , aber außerhalb der Insertion sind.
    3. Verwenden Sie für PCR-Reaktionen innere Primer und äußere Primer. Verwenden Sie die resistenten Stämme und den Wildtyp.
      HINWEIS: Innere Primer zeigen an, dass der Einsatz vorhanden ist. Äußere Primer zeigen, dass der Einsatz am richtigen Ort eingesetzt wird.
  14. Geben Sie für jede PCR-Reaktion ~ 10 mg der Filamente direkt in die PCR-Röhrchen und führen Sie eine PCR gemäß den Standardprotokollen24 durch. Wenn kein Produkt erhalten wird, variieren Sie die Glühtemperatur und waschen Sie die Filamente mit Wasser.
    HINWEIS: Viele verschiedene Polymerasen können in der PCR verwendet werden. Standardpolymerasen wie die Taq-Polymerase haben eine höhere Fehlerrate als fehlerprüfende Polymerasen, die teurer sind. Diese analytische PCR erfordert keine fehlerprüfende Polymerase. Die Fehlerprüfung der Polymerase sollte jedoch getestet werden, wenn kein PCR-Produkt mit einer Standardpolymerase erhalten wird.
  15. Analysieren Sie die PCR-Produkte der resistenten Linie auf Agaroseelektrophorese24.
    1. Vergleichen Sie die Bandpositionen mit dem Marker und vergleichen Sie den Wildtyp und das Transformant. Suchen Sie bei inneren und äußeren Primern nach einem größeren Band für den Transformator als der Wildtyp (aufgrund des Einsetzens der Widerstandskassette) oder nach zwei Bändern für den Transformator: eines mit der Größe des Wildtypbandes und ein größeres. Da der letztere Fall auf eine unvollständige Segregation hinweist, setzen Sie die Kultivierung mit hohen Kanamycinkonzentrationen fort.
      HINWEIS: Weitere Informationen zu PCR und Elektrophorese finden Sie in 15,24 oder anderer Standardliteratur.
  16. Für die GFP-Expression: Beobachten Sie einzelne Filamente mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle) bei einer Vergrößerung des auf 40x oder 63x eingestellten Objektivs. Nehmen Sie ein Hellfeldübertragungsbild und ein Fluoreszenzbild auf. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für GFP: 470-nm-Bandpass für Anregung, 525-nm-Bandpass für Emissionen und einen 495-nm-Strahlteiler, anfängliche Belichtungszeit von 500 ms.
  17. Passen Sie die Belichtungszeit für klare Fluoreszenzsignale an, um Sättigungsintensitäten zu vermeiden. Versuchen Sie, für alle Beispiele dieselbe Einstellung zu verwenden.
  18. Da die Wildtyp-Filamente auch Fluoreszenz anzeigen, nehmen Sie Bilder mit den gleichen Einstellungen wie oben für diese Hintergrundfluoreszenz auf.
    HINWEIS: Die Dehnung, die GFP ausdrückt, muss ein höheres Signal haben; Andernfalls drückt es nicht GFP aus.
  19. Anhand der Belichtungszeiten und der Pixelintensitäten der Fluoreszenzbilder wird der GFP-Gehalt der verschiedenen Filamente berechnet und verglichen.

4. Kryokonservierung

HINWEIS: P. lacuna und das einzellige Cyanobakterium Synechocystis sp. Zum Einsatz kommen PCC 6803. Die vorliegende Methode funktioniert besser für P. lacuna.

  1. P. lacuna oder Synechocystissp PCC 6803 mindestens 10 Tage lang in 10 ml f/2+ bzw. BG-11 Medium unter weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) bei 25 °C unter Bewegung (horizontale Umdrehungen, 50 U/min) kultivieren.
  2. Homogenisieren Sie die P. lacuna-Kultur (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min oder mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialtabelle) für 2 min bei voller Energie. Bestimmen Sie OD 750 nm einer der Kulturen, um zu überprüfen, ob der Wert zwischen 1 und 7 liegt.
  3. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 15 min. Entfernen Sie den Überstand.
  4. Suspensionieren Sie das Zellpellet in 800 μL f/2+ oder BG-11 Medium (Endvolumen) und übertragen Sie es auf ein 2 ml Kryo. Geben Sie 800 μL einer 50% igen Glycerinlösung in die Zellsuspension. Schließen Sie die Durchstechflasche und mischen Sie sie durch wiederholtes Umdrehen.
  5. Überführen Sie das Kryoöl in flüssigen Stickstoff und lagern Sie es in einer Kryobox in einem -80 °C Gefrierschrank. Notieren Sie sich die Position der Box im Gefrierschrank und die Koordinaten der Probe innerhalb der Box.
  6. Zur Wiederherstellung der Zellen nehmen Sie das Kryo heraus und tauen Sie den Inhalt bei Raumtemperatur auf. Den Inhalt in ein 2 ml Reaktionsrohr überführen.
  7. Waschen Sie die Probe zweimal. Für die 1.Wäsche 5 min bei 6.000 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 2 ml f/2+ oder BG-11 Medium. Für die 2. Wäsche 5 min bei 6.000 × g rezentrifugieren, den Überstand entfernen und das Pellet in 2 ml f/2+ oder BG-11 Medium suspendieren.
  8. Um die Integrität dieser kultivierungsbereiten Zellen zu überprüfen, übertragen Sie das Pellet auf 9 ml Medium und kultivieren Sie es in weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) unter Bewegung (55 U / min). Vergleichen Sie die OD 750 nm der Kultur am ersten Tag und nach 1 Woche.

5. Motilität von Phormidium lacuna

HINWEIS: Es werden drei verschiedene Assays beschrieben. In allen Fällen wird die gleiche Kultur verwendet.

  1. P. lacuna in f/2 Medium unter horizontaler Bewegung (50 U/min) in weißem Licht (50 μmol m-2 s-1) für ~5 Tage kultivieren, bis die geschätzte OD 750 nm 0,35 beträgt. Lagern Sie die Probe bis zum Gebrauch bei 4 °C.
  2. Homogenisieren Sie die Filamente (siehe Materialtabelle) bei 10.000 U/min für 3 min oder mit Ultraschall (siehe Materialtabelle) für 1 min bei maximaler Leistung und Zyklus von 1. Messen Sie OD 750 nm. Bei über 0,35 wird der Anteil mit f/2-Medium verdünnt. Verwenden Sie diese Lösung in Motilitätsassays in den Schritten 5.3, 5.4 und 5.5.
  3. Assay für Bewegung in flüssigem Medium
    1. Zur direkten Beobachtung der Motilität werden 8 ml P. lacuna enthaltendes Medium (ab Schritt 5.2) in eine 6 cm große Petrischale überführt. Warten Sie einige Minuten, bis die Probe Raumtemperatur erreicht hat. Die Petrischale mit Zellophanfolie bedecken.
    2. Legen Sie einen Objektträger auf den x-y-Tisch eines Standardmikroskops mit einer Kamera. Schalten Sie das Mikroskoplicht ein. Verwenden Sie idealerweise immer die gleichen elektrischen und optischen Einstellungen für die Beleuchtung. Bewegen Sie ein 4- oder 10-faches Ziel in den Weg des Lichts.
    3. Legen Sie die Petrischale auf die Rutsche. Passen Sie einzelne Filamente oder Filamentbündel durch x-, y- und z-Bewegungen des Tisches an.
      HINWEIS: Aufgrund der dreidimensionalen Anordnung kann nur ein Teil des relevanten Abschnitts im Fokus stehen. Die Zellophanfolie ermöglicht es, den Fokus uneingeschränkt einzustellen.
    4. Beobachten Sie Bewegungen einzelner Filamente oder Bündel. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse die Flüssigkeit nicht berührt. Zeichnen Sie die Bewegungen von Filamenten mit einer Standard-Mikroskopkamera auf (siehe Supplemental Video S1).
  4. Assay für Bewegung auf der Oberfläche
    1. Zur Beobachtung der Filamentmotilität auf Agaroberflächen 6 cm Petrischalen mit f/2 Bacto-Agar zubereiten. Stellen Sie sicher, dass das Agar hoch genug ist, damit sich das Objektiv der Agaroberfläche nähert. Alternativ können Sie eine ~ 3 mm dicke Agarschicht herstellen und die Filamente durch das Agar aufzeichnen (halten Sie die Platte auf dem Kopf oder verwenden Sie ein inverses Mikroskop).
    2. Pipette 0,5 ml einer Lösung, die P. lacuna (aus Schritt 5.2) auf der Bacto-Agar-Oberfläche einer 6 cm großen Petrischale enthält. Lassen Sie die Flüssigkeit in die Oberfläche eindringen. Schließen Sie die Petrischale und beobachten Sie die Bewegung der Filamente auf der Oberfläche mit einem 4x- oder 10x-Objektiv.
    3. Stellen Sie sicher, dass während der gesamten Aufnahme und bei nachfolgenden Aufnahmen die gleichen elektrischen und optischen Einstellungen des Mikroskops verwendet werden.
    4. Nehmen Sie Zeitrafferaufnahmen mit einer Augenkamera und einem Minicomputersystem auf. Stellen Sie sicher, dass das Zeitintervall zwischen den nachfolgenden Bildern 5 s-1 min beträgt. Programmieren Sie das Linux-Skript des Minicomputers, um die Zeitrafferaufzeichnung zu steuern. Siehe Supplemental File 2 für ein Beispielskript und Supplemental Video S2 als Beispiel.
  5. Assay für Phototaxis
    1. Für Phototaxis-Experimente bereiten Sie Leuchtdiodenhalter (LED) (hier mit einem 3D-Drucker) vor, in denen die ausgewählten 5-mm-LEDs montiert sind, um eine Fläche von 20 mm 2 von unten nach oben abzustrahlen (Abbildung 3). Verwenden Sie bei Bedarf viele LED-Halter parallel und verbinden Sie jede LED elektrisch über einen Widerstand und ein Potentiometer mit einer einstellbaren Stromversorgung. Messen und justieren Sie je nach Experiment die LED-Intensitäten. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Einstellung in einem dunklen Raum oder einem geschlossenen dunklen Behälter befindet.
    2. 8 ml des Mediums, das P. lacuna enthält (ab Schritt 5.2), in eine 6 cm große Petrischale geben. Stellen Sie die Lichtintensität der LED ein. Schließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und legen Sie sie auf einen LED-Halter, so dass sich die LED in der Mitte der Petrischale befindet.
    3. Nehmen Sie nach der gewünschten Dauer (in der Regel 2 Tage) ein Bild der Petrischale mit einer Smartphone-Kamera auf, die direkt auf die Position der Lichtbehandlung gerichtet ist. Verwenden Sie ein weißes LED-Panel für die Bestrahlung der Probe. Verwenden Sie die manuellen Einstellungen der Kamera; Lichtreflexionen vermeiden; Passen Sie sich immer an, um den gleichen Abstand zwischen dem Kameraobjektiv und der Probe zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungseinstellungen ein Bild liefern, das für spätere Analysen mit ImageJ geeignet ist.
    4. Quantifizieren Sie den Durchmesser des zentralen Kreises von Filamenten mit der ImageJ-Software.
      1. Öffnen Sie ImageJ, klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie, wählen Sie die gewünschte Datei aus, und klicken Sie auf die EINGABETASTE.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche Gerade (mit einer geraden Linie) aus. Drücken Sie die linke Maustaste, um eine Linie von einem Ende der Petrischale zum gegenüberliegenden Ende zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass die Leitung durch die Mitte des Kreises der Filamente verläuft.
      3. Drücken Sie Strg-K auf der Tastatur oder klicken Sie auf | analysieren Plotprofil im Menü ImageJ Suchen Sie nach einem x-y-Fenster mit Pixelintensitäten, die im Vergleich zur Entfernung dargestellt werden - ein 1D-Profil der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die niedrigste Pixelintensität leicht über 0 und der höchste Wert unter 255 liegt.
      4. Schätzen Sie einen Durchschnittswert für die Pixelintensität außerhalb des Kreises und einen weiteren Durchschnittswert für die Pixelintensität im Kreis. Schätzen Sie an der y-Position zwischen diesen Werten die x-Werte beider Seiten des Kreises, indem Sie mit der Maus auf diese Positionen zeigen. Notieren Sie sich beide Werte und berechnen Sie die Differenz.
      5. Ermitteln Sie den höchsten x-Wert, indem Sie mit der Maus auf die y-Achse rechts zeigen. Beachten Sie, dass dieser Wert e den Durchmesser der Petrischale darstellt. Wenn dieser Durchmesser 5 cm beträgt, berechnen Sie den Durchmesser des zentralen Filamentkreises als d/e × 5 cm.

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Ergebnisse

Nach den oben genannten Methoden wurden 5 verschiedene Stämme von P. lacuna aus Gesteinsbecken isoliert und sequenziert (Abbildung 1 und Tabelle 1). Alle Kulturen waren nach ~ 1 Jahr Subkulturation steril, mit Ausnahme von P. lacuna HE10JO. Dieser Stamm ist immer noch mit Marivirga atlantica, einem Meeresbakterium, kontaminiert. Bei anschließenden Helgoland-Exkursionen wurden weitere fadenförmige Cyanobakterien aus Gesteinsbecken isoliert, die sich...

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Diskussion

Obwohl viele Stämme von Cyanobakterien aus den Kultursammlungen 32,33,34,35,36 verfügbar sind, besteht immer noch eine Nachfrage nach neuen Cyanobakterien aus der Wildnis, da diese Arten an bestimmte Eigenschaften angepasst sind. P. lacuna wurde aus Felsenbecken gesammelt und ist an Variationen der Salzkonzentrationen und der Temperatur

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Unterstützt wurde die Arbeit vom Karlsruher Institut für Technologie.

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Materialien

Kulturmedien
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Autoklav 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto AgarOttoNorwald214010
BG-11 SüßwasserlösungSigma AldrichC3061
BG-11 MediumMerck73816-250ML
BorsäureMerck10043-35-3H3BO3
Calciumchlorid-DihydratCarl Roth10035-04-8CaCl2 · 2 H2O
Zellkulturkolben Cellstar mit Filterschraubverschluss, steril, 250 mLGreiner658190
Zellkulturkolben Cellstar mit Filterschraubverschluss, steril, 50mL Greiner601975
Zentrifuge LYNX 4000Thermo Scientific75006580und Rotor
Zentrifuge microstar 17VWR InternationalN/Afür bis zu 13.000 U/min
Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB)PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
Chloroform : Isoamylalkohol 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
Kobalt(II)-chlorid-hexahydratMerck7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
Kupfer(II)-sulfat-PentahydratMerck7758-99-8  CuSO4 · 5 H2O
D(+)-BiotinCarl Roth58-85-5  C10H16N2O3S
DNA-Leiter 1 kbNew England BiolabsN3232
DNA-Leiter 100 bpNew England BiolabsN3231
Elektrische Pipettierhilfe accujet-pro SBrand GmbH26360zum Pipettieren von 1-25 mL
EthanolVWR64-17-5C2H6O
Ethylendiamintetraessigsäure DinatriumsalzdihydratCarl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2
O Fluoreszenzmikroskop ApoTomeZeiss
Fluoreszenzmikroskop Axio Imager 2Zeiss
French Pressure Cell PressAmerican Instrument CompanyN/A
Gel-Dokutiersystem Saffe ImageInvitrogen
Gelelctrophorese System Mupid-One/-exuADVANCED
Glaswaren, verschiedene
GlycerinCarl Roth56-81-5C3H8O3
>Eisen(III)-chloridhexahydratMerck10025-77-1  FeCl3 · 6 H2O
KanamycinSigma-Aldrich25389-94-0
KanamycinsulfatCarl Roth25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
Lauroylsarcosin, Natriumsalz (Sarcosyl)Sigma Aldrich137-16-6C15H28NO3 · Na
LB Bouillon (Lennox)Carl RothX964.4
Lichtquelle, Leuchtstoffröhre L18W/954 TageslichtOSRAMKultivierung von Cyanobakterien
Lichtquelle, LED-Panel XL 6500K 140 WBloom StarN/AKultivierung von Cyanobakterien, bis zu 1.000 & Mikrobakterien; mol m-2 s-1
Magnesiumchlorid-HexahydratCarlRoth 7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
Mangan(II)-chlorid-TetrahydratServa13446-34-9MnCl2 · 4 H2
O Mikroskop DM750Zeiss
Midi-Prep Plasmid-Extraktionskit NucleoBond Xtra Midi-KitMacherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
Minicomputer Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YDfür Zeitrafferaufnahmen
Okularkamera EC3Leicafür Daueraufnahmen bis zu 30 s
Okularkamera MikrOkular Full HDBresserfür Zeitrafferaufnahmen, gekoppelt an Raspberry Pi Minicomputer
Petrischalen aus Polystyrol, 100 mm x 20 mmMerckP5606-400EA
Petrischalen aus Polystyrol, 60 mm x 15 mmMerckP5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1.000 &Mikro; LGilsonArtikelnummer: FA10006M
Pipetman 10-100 µ LGilsonArtikelnummer: FA10004M
Kunststoffpipetten 10 mL, sterilGreiner607107
Kunststoffröhrchen, steril, 15 mLGreiner188271
Kunststoffröhrchen, steril, 50 mLGreiner227261
KaliumbromidCarl Roth7758-02-3KBr
KaliumchloridCarl Roth7447-40-7KCl
Netzteil Statron 3252-1Statron Gerä tetechnik GmbH
Netzteil Voltcraft PPS 16005Conrad Elektronikfür LED
Proteinase KPromegaMC500Cvon Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470
Q5 PolymeraseNew England BiolabsM0491S
Sequencing Kit NextSeq 500/550 v2.5Illumina
Sequencing System NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instrumentsfür die Kultivierung
NatriumacetatCarl Roth127-09-3NaCH3COO
NatriumchloridCarl Roth7647-14-5NaCl
Natriumdihydrogenphosphat-MonohydratCarl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
NatriumfluoridCarl Roth7681-49-4NaF
NatriumhydrogencarbonatCarl Roth144-55-8NaHCO3
NatriummolybdatDihydratServa10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
NatriumnitratMerck7631-99-4NaNO3
NatriumsulfatCarl Roth7757-82-6Na2SO4
Strontiumchlorid-HexahydratCarl Roth10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
ThiaminhydrochloridMerck67-03-8C12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1C4H11NO3
Ultraschallgerät UP100H mit Sonotrode MS3Hielscher UltraschalltechnologieUP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph InstrumentsHomogenisator
HarnstoffCarl Roth 57-13-6CH4N2O
Vitamin B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
Vitaminlösung0,3 µ M thiamin-HCl, 2,1 nM Biotin, 0,37 nM Cyanocobalamin
Water Stills, WasseraufbereitungVEOLIA WassertechnologienELGA_21001
Zinksulfat-HeptahydratSigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
software, URL
https://github.com/GATB/gatb-minia-pipelinemacht aus kurzen DNA-Reads große Gerüste, Linux-basierte
ImageJ-Software für die Bildverarbeitung (Pixelintensitäten, Kreisdurchmesser)
>
Künstliches Meerwasser0,41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM  KCl , 2,4 mM NaHCO3 ,0,84 mM KBr, 0,49 mM H3BO3, 90 & micro; M SrCl2, 72 µ M NaF
f/2 -flüssiges Mediumkünstliches Meerwasser, 0,1 % (v/v) Spurenelementlösung, 0,05 % (v/v) Vitaminlösung, 0,88 mM NaNO3, 36 & micro; M NaH2PO4 
f/2+ flüssiges Mediumf/2-medium, mit 10-fach erhöhtem NaNO3 und NaH2PO4 (0,88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
f/2+-Agar3 % (w/v) Bacto-Agar, künstliches Meerwasser, 0,1 % (v/v) Spurenelementlösung, 0,05 % (v/v) Vitaminlösung, 8,8 mM NaNO3, 0,36 mM NaH2PO4
f/2-agar3 % (w/v) Bacto-Agar, künstliches Meerwasser, 0,1 % (v/v) Spurenelementlösung, 0,05 % (v/v) Vitaminlösung, 0,88 mM NaNO3, 36 µ M NaH2PO4
Spurenelementlösung0,36 mM NaH2PO4, 12 µ M Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0,91 &Mikro; M MnCl2
Vitaminlösung0,3 &Mikro; M Thiamin-HCl, 2,1 nM Biotin, 0,37 nM Cyanocobalamin
gatb-minia Programm für DNA-Assemblierung RAST-Annotationsserver https://rast.nmpdr.org Eingabe: Genom-DNA-Sequenz, erkennt offene Leserahmen, listet Proteinsequenzen und deren Funktionen auf

Referenzen

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