Das Protokoll stellt die gesamten Laborverfahren dar, die für Präimplantations-Gentests auf Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Hier präsentieren wir die detaillierten Schritte der Amplifikation des gesamten Genoms, der DNA-Fragmentauswahl, des Bibliotheksaufbaus, der Template-Vorbereitung und des Sequenzierungs-Arbeitsablaufs mit repräsentativen Ergebnissen.
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Methodenartikel
Präimplantations-Gentests für Aneuploidie auf einer halbleiterbasierten Next-Generation-Sequenzierungsplattform
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Next-Generation-Sequenzierung hat in der klinischen Anwendung bei der Bestimmung genetischer Varianten zunehmend an Bedeutung gewonnen. Im Präimplantations-Gentest hat diese Technik ihre einzigartigen Vorteile in Bezug auf Skalierbarkeit, Durchsatz und Kosten. Für den Präimplantations-Gentest für die Aneuploidie-Analyse bietet das hier vorgestellte halbleiterbasierte Next-Generation-Sequencing-System (NGS) einen umfassenden Ansatz zur Bestimmung struktureller genetischer Varianten mit einer Mindestauflösung von 8 Mb. Von der Probenaufnahme bis zum Abschlussbericht erfordert der Arbeitsprozess mehrere Schritte unter strikter Einhaltung der Protokolle. Da verschiedene kritische Schritte das Ergebnis der Verstärkung, die Qualität der Bibliothek, die Abdeckung der Lesevorgänge und die Ausgabe von Daten bestimmen könnten, könnten beschreibende Informationen mit visueller Demonstration außer Wörtern mehr Details zur Bedienung und Manipulation bieten, was einen großen Einfluss auf die Ergebnisse aller kritischen Schritte haben kann. Die hier vorgestellten Methoden zeigen die Verfahren, die an der gesamten Genomamplifikation (WGA) von biopsierten Trophektodermzellen (TE), der genomischen Bibliothekskonstruktion, dem Sequenzermanagement und schließlich der Erstellung von Berichten über Kopienzahlvarianten beteiligt sind.
Einleitung
Aneuploidie ist die Anomalie in der Anzahl der Chromosomen durch das Vorhandensein eines oder mehrerer zusätzlicher Chromosomen oder das Fehlen eines oder mehrerer Chromosomen. Embryonen, die eine Art von Aneuploidie tragen, wie den Verlust eines X-Chromosoms (Turner-Syndrom), zusätzliche Kopien von Autosomen, wie Trisomien von Autosom 21 (Down-Syndrom), 13 (Patau-Syndrom) und 18 (Edwards-Syndrom), oder zusätzliche Geschlechtschromosomen wie 47, XXY (Klinefelter-Syndrom) und 47, XXX (Triple-X-Syndrom), können mit Geburtsfehlern1 überleben. Aneuploidie ist die Hauptursache für Fehlgeburten im ersten Trimester und Versagen der In-vitro-Fertil....
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Protokoll
Alle Protokolle und die Trophektoderm (TE) Biopsie (Abschnitt 1.1.1.1), die in dieser Studie angewendet wurden, wurden am 18. September 2017 von der Ethikkommission für Humanforschung des Krankenhauses Nr. 924 überprüft und genehmigt (NO: PLA924-2017-59). Die Patienten/Teilnehmer gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie.
1. DNA-Isolierung aus menschlicher Embryobiopsie und ganzgenomischer Amplifikation
- Protokoll für die Amplifikation des gesamten Genoms 9,10
HINWEIS: Das Pico PLEX WGA Kit wird verwendet, um die Ampl....
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Ergebnisse
Wenn der Sequenzplan nach dem laufenden Prozess in der Maschine abgeschlossen ist, meldet das Sequenzserversystem die Zusammenfassung mit beschreibenden Informationen zu generierten Daten, Chipstatus, ISP-Laderate und Bibliotheksqualität, wie in Abbildung 2 dargestellt. In dieser Ergebnisdemonstration wurden 17,6 G-Daten in der Gesamtbasis erhalten, und die Gesamtladerate von ISP betrug 88% in den Gesamtwells des Chips; Die Heatmap zeigte, dass die Probe gleichmäßig auf die Gesamtfläche des .......
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Diskussion
Die chromosomale Aneuploidie von Embryonen ist die Ursache für einen großen Teil des Schwangerschaftsverlustes, unabhängig davon, ob es sich um eine natürliche Empfängnis oder eine In-vitro-Fertilisation (IVF) handelt. In der klinischen Praxis der IVF wird vorgeschlagen, dass das Screening der Embryo-Aneuploidie und der Transfer des Euploidie-Embryos das Ergebnis der IVF verbessern könnte. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung ist die früheste Technik für die Geschlechtsselektion und PGT-A; Diese Techn.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir möchten Dr. Zhangyong Ming und Herrn Rongji Hou für ihre Beratung zur erweiterten Anwendung von LIMS danken. Diese Studie wird von PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) und Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m Spritzenvorsatz-Filtereinheit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1,5 mL DNA LoBind Röhrchen | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL Röhrchen | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2,0 mLDNA LoBind Röhrchen | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL Röhrchen | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Puffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA-Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP Reagenz (magnetische Beads für die DNA-Bindung) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Zelllysepuffer | Southern Medical University | Zelllysepuffer mit 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 1 % (v/v) Triton X-100, 5 mM Natrium Pyrophosphat, 2 mM β-Glycerophosphat, 0,1 % SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/ | |
| DNA-Elutionspuffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethylalkohol | Guangzhou Chemisches Reagenzhaus Thermo Fisher Wissenschaftliche | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Unabhängig entwickelte Reagenzien für die Amplifikation des gesamten Genoms | Southern Medical University | Die Reagenzien bestehen aus den folgenden Komponenten: 1. Zelllyse 2. Amplifikation Vorgemischte Lösung 1) Grundierung WGA-P2 (10 μ M) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Puffer (Mg2+ Plus) 3. Amplifikationsenzym 1) Anstart Tap DNA-Polymerase (5 U/μ L) | |
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit, das in Schritt 4.2.8 erwähnt |
| wurde Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ionenprotonensystem | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| Isopropanol | Guangzhou Chemisches Reagenzienfabrik | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Bibliotheksvorbereitungskit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuklease-freies Wasser | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3'OneTouch | |
| 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template-Amplifikations- und Anreicherungssystem |
| PCR-Röhrchen | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio | USA R300671 | |
| Pipettenspitzen | Qualität Wissenschaftliche Produkte | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Tragbare Mini-Zentrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Röhrchen | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequenzierer-Serversystem | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequenzierung Reaktionen Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html Dieses Kit enthält folgende Komponenten: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR Buffer Emulsion PCR Enzyme mix Template Carrier solution 1.2 Template Preparation Lösungen: Template Preparation Reaktionsöl I Emulgator aufbrechende Lösung II Template Preparation Reaktionsöl II Nukleasefreies Wasser Tween Lösung Demulgierlösung I Template-Waschlösung C1-Bead-Waschlösung C1-Bead-Resuspensionslösung Template-Resuspensionslösung 1.3 Matrizenvorbereitungsmaterialien: Reagenzröhrchen I Anschluss Entnahmeröhrchen Reagenzröhrchenpipette I Amplifikationsplatte 8 Vertiefungen strip Spezielle Tipps Schablonenvorbereitung Waschadapter Schablonenvorbereitungsfilter 2. Sequenzierungskit Set 2.1 Sequenzierungskit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequenzierungsenzymlösung Sequenzierungsprimer Vorlagen für Qualitätskontroll 2.2 Sequenzierlösungen: Sequenzierlösung II Sequenzierlösung IIII Glühpuffer Ladepuffer Schaumbildner Chlortabletten C1 bead 2.3 Sequenzierungsmaterialien: Reagenzröhrchen II Reagenzröhrchendeckel Reagenzröhrchen-Schlüpfer II Reagenzflasche sipper Reagenzflaschen 3. Chip |
| Natronlauge | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermocycler | Life | 4375786 |
Referenzen
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....
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Nachdrucke und Genehmigungen
