Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.
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Methodenartikel
Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Morbus Crohn (CD) sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, von denen etwa 20 pro 1.00.000 in Europa und den USA betroffen sind. CD ist gekennzeichnet durch transmurale Entzündungen, Darmfibrose und Luminalstenose. Obwohl entzündungshemmende Therapien helfen können, Entzündungen zu kontrollieren, haben sie keine Wirksamkeit bei Fibrose und Stenose bei CD. Die Pathogenese der CD ist nicht gut verstanden. Aktuelle Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Abgrenzung von dysregulierten Immunantwortmechanismen des Darms. Während CD-assoziierte transmurale Entzündungen, Darmfibrose und luminale Stenose alle eine mechanische Belastung der Darmwand darstellen, ist die Rolle der mechanischen Belastung bei CD nicht gut definiert. Um festzustellen, ob mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD spielt, wurde ein Protokoll des TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis-Modells bei Nagetieren entwickelt. Dieses TNBS-induzierte transmurale Entzündungs- und Fibrosemodell ähnelt pathologischen Kennzeichen von CD im Dickdarm. Es wird durch intrakolonische Instillation von TNBS in den distalen Dickdarm erwachsener Sprague-Dawley-Ratten induziert. In diesem Modell führt eine transmurale Entzündung zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle (Site I). Mechanische Dehnung wird in dem Teil proximal zur Instillationsstelle (Site P) beobachtet, der mechanische Belastung, aber keine sichtbare Entzündung darstellt. Der distale bis zur Entzündung (Punkt D) distale Dickdarmabschnitt stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Markante Veränderungen der Genexpression, der Immunantwort, der Fibrose und des Wachstums der glatten Muskulatur an verschiedenen Stellen (P, I und D) wurden beobachtet, was einen tiefgreifenden Einfluss mechanischer Belastungen hervorhebt. Daher wird uns dieses Modell der CD-ähnlichen Kolitis helfen, die pathogenen Mechanismen von CD besser zu verstehen, insbesondere die Rolle von mechanischem Stress und mechanischer stressinduzierter Genexpression bei Immundysregulation, Darmfibrose und Gewebeumbau bei CD.
Einleitung
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind durch chronische Entzündungen im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet. Es betrifft ~ 1-2 Millionen Amerikaner1. Die geschätzten jährlichen Kosten für die IBD-Pflege in den USA belaufen sich auf 11,8 Milliarden US-Dollar. Im Gegensatz zu UC ist die CD durch transmurale Entzündung und Strikturbildung gekennzeichnet 2,3. Strikturbildung (Stenose) tritt bei bis zu 70% der CD-Patientenauf 3 und kann durch transmurale Entzündung (entzündliche Stenose) oder Darmfibrose ....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden nach dem institutionellen Komitee für Tierpflege und -nutzung der University of Texas Medical Branch (#0907051C) durchgeführt. Männliche oder weibliche Sprague-Dawley-Ratten, ~ 8-9 Wochen alt, wurden für die Studie verwendet.
1. Tierpräparation
- Fasten Sie Ratten für 24 h und behandeln Sie sie über Nacht mit Abführmittel (Darmreiniger, siehe Materialtabelle).
- Am nächsten Tag betäuben Sie Ratten mit einem Anästhesiesystem (siehe Materialtabelle), indem Sie sie während der TNBS-Verabreichung 2% Isofluran zusammen mit 1 l / min Sauerstoff aussetzen. ....
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Ergebnisse
Makroskopische Ansicht der Morbus-Crohn-ähnlichen Colitis, induziert durch intrakolonische Instillation von TNBS
Wie in Abbildung 1 gezeigt, induzierte die intrakolone Instillation von TNBS bei Ratten eine lokalisierte transmurale Entzündung (~ 2 cm lang) mit verdickter Darmwand und verengtem Lumen (Stenose) an der Instillationsstelle im distalen Dickdarm (Abbildung 1A). Der Ort der TNBS-Instillation wird als Standort I bezeichnet. Als Folge .......
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Diskussion
TNBS-induzierte Kolitis wurde 1989 eingeführt und wird seit 19,20,23 als experimentelles Modell für Morbus Crohn verwendet. Wesentliche Merkmale dieses Modells bei Nagetieren sind die Entwicklung einer transmuralen Entzündung, die den histopathologischen Läsionen, die bei menschlichem Morbus Crohn entwickelt wurden, sehr ähnlich ist19,20. Frühere Studien zum Modell haben.......
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Offenlegungen
Die Autoren berichten von keinem Interessenkonflikt und haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01 DK124611 bis XZS) und des US-Verteidigungsministeriums (W81XWH-20-1-0681 bis XZS) unterstützt. Die histologische Arbeit wurde mit Hilfe des UTMB Surgical Pathology Lab durchgeführt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| ACT-1 Steuerungssoftware Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler mit 96-Well-Schnellreaktionsmodul | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optisches Reaktionsmodul für real-time PCR-Systeme | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Spezialfärber | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digitale Farb-HR-Kamera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotische 18S rRNA Endogene Kontrolle | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anästhesie | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hartschalen-96-Well-PCR-Platten, flaches Profil, dünnwandig, umrandet, weiß/klar | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x ohne Calcium und Magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Mikrotom | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isofluran | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler mit Bedienfeld 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medizinischer offener Polyurethan-Katheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spektralphotometer | Thermo Fisher | Scientific ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 aufrechtes Mikroskop | Nikon | E800 | |
| Nitrozellulose/Filterpapier Sandwiches Packung mit 50, 0,45 μ m, 7 x 8,5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylenglykol 3350, osmotisches Abführmittel | Miralax | C8175 | Dosis: 17 g in 226 mL Wasser |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Säulen, Sammelröhrchen (1,5 mL und 2 mL), RNasefreie Reagenzien und Puffer | QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III Erststrangsynthesesystem | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Genexpressionsassays Rn00573960_g1 CTGF-Sonde | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Genexpressionsassays Rn99999011_m1 IL6-Sonde | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master | Mix ThermoFisher | Scientific 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H& E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automatisierter Objektträgerfärbeer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonsäurelösung) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
Referenzen
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn's disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G.
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease
Posted by JoVE Editors on 5/20/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: A TNBS-Induced Rodent Model to Study the Pathogenic Role of Mechanical Stress in Crohn's Disease. The Introduction and Protocol were updated.
The first sentence of the Introduction was updated from:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,00,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
to:
Inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease (CD) are chronic inflammatory disorders of the gastrointestinal tract affecting approximately 20 per 1,000,000 in Europe and USA. CD is characterized by transmural inflammation, intestinal fibrosis, and luminal stenosis.
Step 1.3 in the Protocol was updated from:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol was used.
to:
Prepare fresh TNBS solution according to body weights.
NOTE: TNBS - 65 mg/kg of body weight in 250 µL of 40% ethanol/saline was used.
