Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.
Abstract
الخلايا الدبقية الصغيرة ، الخلايا المناعية الفطرية المقيمة في الدماغ ، هي المستجيبين الأساسيين للالتهاب أو الإصابة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). يمكن تقسيم الخلايا الدبقية الصغيرة إلى حالة راحة وحالة تنشيط ويمكن أن تتغير حالتها بسرعة استجابة للبيئة الدقيقة للدماغ. سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في ظل ظروف مرضية مختلفة وتظهر أنماطا ظاهرية مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، هناك العديد من المجموعات الفرعية المختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة وعدم التجانس الكبير بين المجموعات الفرعية المختلفة. يعتمد عدم التجانس بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كشفت الدراسات أنه سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وتلعب دورا مهما في العملية المرضية لإزالة الميالين الالتهابية. لفهم خصائص الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أفضل في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية مثل التصلب المتعدد واضطراب طيف التهاب النخاع والعصب البصري ، نقترح بروتوكول فرز الخلايا الدبقية الدقيقة الأولية حول الآفات. يستخدم هذا البروتوكول فرز الخلايا العمودية المنشطة مغناطيسيا (MACS) للحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية عالية النقاء والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة للتحقيق في الآثار المحتملة للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية.
Introduction
تنشأ الخلايا الدبقية الصغيرة من أسلاف كيس صفار البيض ، والتي تصل إلى الدماغ الجنيني في وقت مبكر جدا وتشارك في تطوير الجهاز العصبي المركزي 1,2. على سبيل المثال ، يشاركون في التقليم المشبكي3 وتنظيم النمو المحوري4. أنها تفرز العوامل التي تعزز بقاء الخلايا العصبية وتساعد على توطين الخلايا العصبية5. في الوقت نفسه ، يشاركون في إزالة الخلايا غير الطبيعية والخلايا الماصة لضمان نمو الدماغ الطبيعي6. بالإضافة إلى ذلك ، باعتبارها الخلايا المختصة بالمناعة في الدماغ ، تراقب الخلايا الدبقية الصغيرة باستمرار حمة الدماغ لإزالة الخلايا الميتة ، والمشابك العصبية المختلة وظيفيا ، والحطام الخلوي7. وقد ثبت أن تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة يلعب دورا مهما في مجموعة متنوعة من الأمراض، بما في ذلك الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية، والأمراض العصبية التنكسية، وأورام الدماغ. تساهم الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في التصلب المتعدد (MS) في تمايز خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) وتجديد المايلين عن طريق ابتلاع حطام المايلين8.
في مرض الزهايمر (AD) ، ينشط تراكم بيتا أميلويد (Aβ) الخلايا الدبقية الصغيرة ، مما يؤثر على وظائف البلعمة والالتهابات في الخلايا الدبقية الصغيرة9. يمكن للدبقية الصغيرة المنشطة في أنسجة الورم الدبقي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالورم الدبقي (GAM) ، تنظيم تطور الورم الدبقي وتؤثر في النهاية على تشخيص المرضى10. يغير التنشيط بشكل عميق النسخ الدبقي الصغير ، مما يؤدي إلى تغيرات مورفولوجية ، والتعبير عن المستقبلات المناعية ، وزيادة نشاط البلعمة ، وتعزيز إفراز السيتوكين11. هناك مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الأمراض العصبية التنكسية مثل الخلايا الدبقية الصغيرة المرتبطة بالمرض (DAM) ، والخلايا الدبقية الصغيرة ذات الاستجابة المنشطة (ARM) ، والنمط الظاهري العصبي التنكسي الدبقي الصغير (MGnD)8.
وبالمثل ، تتعايش مجموعات فرعية وظيفية ديناميكية متعددة من الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في الدماغ في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية12. إن فهم عدم التجانس بين مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري للتحقيق في التسبب في أمراض إزالة الميالين الالتهابية وإيجاد استراتيجياتها العلاجية المحتملة. يعتمد عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل أساسي على الخصوصية الجزيئية8. من الضروري وصف التغيرات الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة بدقة لدراسة عدم التجانس. وقد مكن التقدم في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (RNA-seq) من تحديد الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في الحالات المرضية13. لذلك ، فإن القدرة على عزل مجموعات الخلايا أمر بالغ الأهمية لمزيد من التحقيق في هذه الخلايا المستهدفة في ظل ظروف محددة.
الدراسات التي أجريت لفهم خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة عادة ما تكون في الدراسات المختبرية ، حيث وجد أنه يمكن تحضير أعداد كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية وزراعتها من أدمغة جرو الفئران (1-3 أيام) ، والتي ترتبط بقوارير الثقافة وتنمو على السطح البلاستيكي مع الخلايا الدبقية المختلطة الأخرى. في وقت لاحق ، يمكن عزل الخلايا الدبقية الصغيرة النقية بناء على الالتصاق المختلف للخلايا الدبقية المختلطة14,15. ومع ذلك ، يمكن لهذه الطريقة فقط عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الدماغ في الفترة المحيطة بالولادة وتستغرق عدة أسابيع. قد تؤثر المتغيرات المحتملة في زراعة الخلايا على خصائص الخلايا الدبقية الدقيقة مثل التعبير الجزيئي16. علاوة على ذلك ، لا يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بهذه الطرق المشاركة إلا في التجارب المختبرية من خلال محاكاة ظروف أمراض الجهاز العصبي المركزي ولا يمكنها تمثيل خصائص ووظائف الخلايا الدبقية الصغيرة في حالات مرض الجسم الحي. لذلك ، من الضروري تطوير طرق لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة عن دماغ الفأر البالغ.
فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) والفصل المغناطيسي هما طريقتان مستخدمتان على نطاق واسع ، على الرغم من أن لهما قيودهما المختلفة الخاصة16،17،18،19. وسيتم المقارنة بين مزاياها وعيوبها في قسم المناقشة. يوفر نضج تقنية MACS إمكانية تنقية الخلايا بسرعة. طور هوانغ وآخرون طريقة ملائمة لتسمية الآفات المزيل للميالين في الأدمغة20. من خلال الجمع بين هذين النهجين التقنيين ، نقترح بروتوكول فصل مغناطيسي عمودي CD11b سريع وفعال ، مما يوفر وصفا خطوة بخطوة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين في أدمغة الفئران البالغة والحفاظ على الخصائص الجزيئية للخلايا الدبقية الصغيرة. كانت آفات إزالة الميالين البؤرية ناتجة عن الحقن التجسيمي ل 2 ميكرولتر من محلول الليسوليسيثين (1٪ LPC في 0.9٪ كلوريد الصوديوم) في الجسم الثفني قبل 3 أيام من بدء البروتوكول21. يضع هذا البروتوكول الأساس لتنفيذ الخطوة التالية في التجارب المختبرية. علاوة على ذلك ، يوفر هذا البروتوكول الوقت ويظل ممكنا للاستخدام على نطاق واسع في التجارب المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة معهد رعاية الحيوان التابعة لكلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين.
1. المواد
- قم بإعداد الحلول التالية قبل بدء البروتوكول.
- قم بإعداد مخزن التحميل المؤقت عن طريق إضافة مصل البقر الجنيني (FBS ، 2٪) إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- أضف صبغة حمراء محايدة (NR) (نهائي 1٪) إلى PBS.
- قم بإعداد الحلول التالية باستخدام مجموعة أدوات تفكك دماغ البالغين المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
- لإعداد مزيج الإنزيم 1 ، ماصة 1.9 مل من Buffer Z و 50 ميكرولتر من إنزيم P في أنبوب طرد مركزي 15 مل.
- لإعداد مزيج الإنزيم 2 ، ماصة 20 ميكرولتر من Buffer Y و 10 ميكرولتر من الإنزيم A في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل.
- تحضير حل إزالة الحطام.
2. تروية الفئران وتشريحها
- حقن الفأر داخل الصفاق (i.p) ب 500 ميكرولتر من صبغة NR 1٪ في PBS 2-3 h قبل التخدير.
ملاحظة: يساعد الحقن داخل الصفاق ل NR في نماذج الفئران المزيلة للميالين على تمييز الآفات (الشكل 1). - تخدير الفأر باستخدام بنتوباربيتال (50 مجم / كجم ، i.p.) ، وتأكد من تخدير الفأر بنجاح من خلال فحص استجابات الألم.
- افتح التجويف الصدري للفأر وكشف القلب.
- قطع زاوية صغيرة من الأذين الأيمن بعناية وداخل القلب تخلل الماوس مع 20-30 مل من PBS الباردة من البطين الأيسر.
- قطع رأس الفأر تحت التخدير.
- افتح جمجمة الفأر وحرر الدماغ بعناية من الجمجمة.
- نقل الدماغ إلى قالب شريحة دماغ الفأر وقطع الدماغ إلى شرائح 0.1 سم.
- قم بإزالة شرائح الدماغ وضعها في PBS باردة في طبق بتري (60/15 مم). تشريح دقيق للآفات التي تحمل صبغة NR حول الجسم الثفني تحت المجهر المجهري باستخدام ملقط الجراحة المجهرية.
ملاحظة: تأكد من أن الأنسجة التي تم تشريحها كاملة قدر الإمكان لتسهيل النقل اللاحق ؛ يجب إكمال التقدم الكلي في التشريح في 2 ساعة. - انقل الأنسجة المشوهة إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل تحتوي على الكمية المناسبة من المخزن المؤقت للتحميل البارد.
ملاحظة: قم بتجميع أنسجة الجسم الثفني من 2-3 فئران معا في أنبوب واحد كعينة واحدة.
3. تفكك الأنسجة
- الطرد المركزي للأنسجة المشوهة عند 300 ×g لمدة 30 ثانية (بعد الوصول إلى هذه السرعة) لجمع العينة في الجزء السفلي من الأنبوب.
- سخن مزيج الإنزيم 1 ومزيج الإنزيم من 2 إلى 37 درجة مئوية في الحاضنة.
- أضف 1950 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 1 إلى عينة واحدة وهضمه في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم المسخن مسبقا 2 واخلطه بلطف.
- يهضم في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ويخلط بلطف كل 5 دقائق.
- أضف 4 مل من PBS البارد إلى الأنبوب بعد الهضم ورجه بلطف.
- ضع مرشحات 70 ميكرومتر على أنابيب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتبليل المرشحات مسبقا ب 500 ميكرولتر من PBS البارد. قم بتصفية الأنسجة المنفصلة عن طريق تمرير عينات الأنسجة المهضومة عبر المرشحات ، ونقل التعليق المصفى في أنبوب جهاز الطرد المركزي سعة 50 مل إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كانت كمية الأنسجة صغيرة جدا. - الطرد المركزي لعينات الأنسجة المصفاة عند 300 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط السوبرناتان ببطء وبشكل كامل.
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات على الجليد باستثناء الهضم الإنزيمي.
4. إزالة الأنقاض
- أعد تعليق حبيبات الخلايا بلطف باستخدام 1550 ميكرولتر من PBS البارد.
- أضف 450 ميكرولتر من المحلول البارد لإزالة الحطام واخلطه جيدا.
- تراكب الخليط أعلاه ببطء شديد وبلطف مع 2 × 1 مل من PBS الباردة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
ملاحظة: قم بإمالة أنبوب جهاز الطرد المركزي بمقدار 45 درجة وأضف PBS ببطء على طول جدار الأنبوب مع الماصة. - انقل الأنبوب ببطء ولطف إلى جهاز طرد مركزي وقم بالدوران عند 4 درجات مئوية و 3000 × جم لمدة 10 دقائق.
- ابحث عن ثلاث طبقات بعد الطرد المركزي. استنشق الطبقتين العلويتين بالكامل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 2).
- املأ الأنبوب حتى 5 مل بمخزن مؤقت للتحميل البارد وقم بعكس الأنبوب بلطف ثلاث مرات.
- جهاز طرد مركزي عند 4 درجات مئوية و 1000 × جم لمدة 10 دقائق. شفط supernatant تماما وتجنب تعطيل بيليه الخلية.
5. الفصل المغناطيسي للخلايا الدبقية الدقيقة
- أعد تعليق حبيبات الخلية مع 90 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل وأضف 10 ميكرولتر من حبات CD11b (Microglia).
- تخلط جيدا وتحضن لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف 1 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل وماصة السائل بلطف لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لغسل الخلايا بعد الحضانة. الطرد المركزي للخلايا عند 4 درجات مئوية و 300 × غرام لمدة 10 دقائق وشفط supernatant تماما لإزالة الخرز غير المقيد.
- أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل.
- ضع عمود MS مع الفاصل الخاص به للاختيار الإيجابي في المجال المغناطيسي.
- شطف العمود مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت تحميل لحماية الخلايا وضمان كفاءة الفرز المغناطيسي على أساس بروتوكول الشركة المصنعة.
- قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود MS وتخلص من التدفق الذي يحتوي على خلايا غير مسماة.
- أضف 500 ميكرولتر من مخزن التخزين المؤقت للتحميل إلى العمود ثلاث مرات لغسل الخلايا التي تلتصق بجدار العمود وتتخلص من التدفق.
ملاحظة: أضف مخزن مؤقت جديد للتحميل للغسيل فقط عندما يكون خزان العمود فارغا تماما. - قم بإزالة العمود من الفاصل بعد غسل العمود وضعه على أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
- أضف 1 مل من مخزن التخزين المؤقت للتحميل إلى العمود وادفع المكبس إلى أسفل العمود لطرد الخلايا المصنفة مغناطيسيا. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات لجمع الخلايا المصنفة مغناطيسيا بالكامل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام حبات CD11b ذات نقاء عال
تم عزل الخلايا الدبقية الدقيقة حول الآفات في نماذج فئران إزالة الميالين باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه واختبارها بواسطة قياس التدفق الخلوي. يتم تصنيف الخلايا بشكل فلوري باستخدام CD11b-fluorescein isothiocyanate (FITC) و CD45-allophycocyanin (APC) لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة في قياس التدفق الخلوي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. هناك العديد من الأدبيات التي تثبت أن الأجسام المضادة CD11b و CD45 كافية للتحقق من نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة19,22. تم الانتهاء من تعويض التألق على مقياس التدفق الخلوي باستخدام عينات تحكم غير ملطخة وأحادية اللون. كانت الخلايا مسورة بارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) وارتفاع التشتت الجانبي (SSC-H) ؛ كانت الخلايا المفردة مسورة بواسطة منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) و FSC-H. تم اختبار نسب الخلايا الدبقية الصغيرة (التي تم تحديدها على أنها CD11b + CD45الوسيطة) قبل وبعد الفصل المغناطيسي بواسطة قياس التدفق الخلوي. تم استخدام تقنية الحلقة الخلفية لضبط استراتيجية البوابة لتحليل التدفق الخلوي عن طريق تحديد بوابة الخلايا الدبقية الصغيرة. بالمقارنة مع ما يقرب من 3 × 104 خلايا و 6 × 10 3 microglia قبل الفصل المغناطيسي لكل دماغ فأر (الشكل 3A) ، ينتج MACS عموما حوالي 2.5 × 10 3 خلايا و 2 × 103 microglia لكل دماغ فأر (الشكل 3B) ، وهو ما يقرب من 85 ٪ من جميع الخلايا المفردة. ومع ذلك ، كان ما يقرب من 3٪ من الخلايا النخاعية (التي تم تحديدها على أنها CD11b + CD45عالية) موجودة في الخلايا المنفصلة عن MACS-وكان من الصعب إزالتها من مجموعة CD11b في هذا البروتوكول. يمكن زيادة نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة إلى 95٪ باستخدام عمودين مغناطيسيين (الشكل التكميلي S1). يمكن لفرز MACS التقاط ما يقرب من 33٪ من الخلايا الدبقية الصغيرة في عينة خليط الدماغ.
الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام حبات CD11b لديها صلاحية عالية للخلايا
غالبا ما يستخدم الفلوروكروم 7-أمينوأكتينومايسين D (7-AAD) لإظهار صلاحية الخلية في قياس التدفق الخلوي. تمثل خلايا 7-AAD+ الخلايا الميتة19. كانت صلاحية الخلايا الدبقية الصغيرة المنفصلة عن MACS-Cats حوالي 95٪ عن طريق تلطيخ الخلايا ب 7-AAD (الشكل 4).
التحليل المورفولوجي للخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين التي تم فرزها بواسطة MACS
أظهر التحليل المورفولوجي أن الخلايا الدبقية الصغيرة لم يتم تنشيطها بواسطة MACS. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة جسما طوليا نموذجيا ثنائي القطب بعد MACS، وهو مشابه لمورفولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة بعد FACS19. سيتم تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين في نموذج إزالة الميالين الناجم عن LPC21. أظهرت الخلايا الدبقية الصغيرة الملطخة بجزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 (Iba-1) مورفولوجيا أميبية نموذجية للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة في هذا البروتوكول. P2ry12 هو جزيء نموذجي لحالة الراحة الدبقية الصغيرة. هناك جزء صغير من الخلايا الدبقية الصغيرة المتفرعة و P2ry12 + قبل MACS بسبب توسع مدى الآفات المنفصلة. ومع ذلك ، فإن وجود P2ry12 + microglia بعد MACS يشير أيضا إلى أن MACS لن يقوم بتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل التكميلي S2).
الشكل 1: صور لآفات إزالة الميالين البؤرية الموسومة بالصبغة الحمراء المحايدة.
الشكل 2: صور للطبقات الثلاث التي تشكلت بواسطة الطرد المركزي. يجب إزالة الطبقتين العلويتين (الطبقة 1 + الطبقة 2) في عملية إزالة الحطام (انظر خطوة البروتوكول 4.5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من آفات إزالة الميالين للفئران البالغة قبل وبعد MACS. (A) التمثيل التخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في تحليل قياس التدفق الخلوي قبل MACS: FSC-H و SSC-H لاختيار الخلايا ، FSC-A و FSC-H لاختيار الخلايا المفردة ، و CD11b-FITC و CD45-APC لاختيار الخلايا النخاعية (أعلى) والخلايا الدبقية الصغيرة (أسفل). (ب) التمثيل التخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في عينة تحليل التدفق الخلوي بعد MACS. زادت نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة بشكل كبير بعد MACS: FSC-H و SSC-H لاختيار الخلايا ، FSC-A و FSC-H لاختيار الخلايا المفردة ، و CD11b-FITC و CD45-APC لاختيار الخلايا النخاعية (أعلى) والخلايا الدبقية الصغيرة (لأسفل). الاختصارات: SSC-H = ارتفاع التشتت الجانبي. FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي ؛ FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ CD45-APC = CD45 المسمى بالوفيكوسيانين; CD11b-FITC = CD11b المسمى بالفلوريسين إيزوثيوسيانات ؛ MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: استراتيجية بوابات FACS للخلايا المفردة الحية / الميتة بعد MACS. 7-AAD و SSC-H لاختيار الخلايا الحية بعد MACS. الاختصارات: SSC-H = ارتفاع التشتت الجانبي. 7-AAD = 7-أمينوأكتينومايسين D ؛ MACS = فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ؛ FACS = فرز الخلايا المنشط بالفلور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من فئران إزالة الميالين البالغة. (أ) التمثيل التخطيطي لاستراتيجية البوابات المستخدمة في عينة تحليل التدفق الخلوي قبل MACS. (ب) التمثيل التخطيطي لاستراتيجية البوابة المستخدمة في عينة تحليل التدفق الخلوي بعد نظام التشغيل MACS باستخدام عمودين مغناطيسيين. (ج) رسم بياني أحادي المعلمة ل CD11b-FITC وCD45-APC في قياس التدفق الخلوي بعد MACS باستخدام عمودين مغناطيسيين. الاختصارات: SSC-H = ارتفاع التشتت الجانبي. FSC-H = ارتفاع التشتت الأمامي ؛ FSC-A = منطقة التشتت الأمامية ؛ CD45-APC = CD45 المسمى بالوفيكوسيانين; CD11b-FITC = CD11b المسمى بالفلوريسين إيزوثيوسيانات ؛ MACS = فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا ؛ CD45Int = تعبير CD45 متوسط. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: تلطيخ التألق المناعي للخلايا الدبقية الصغيرة مع Iba-1 و P2ry12 قبل وبعد MACS. (أ) صور الخلايا الدبقية الصغيرة قبل MACS. (ب) صور للخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بعد MACS. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: MACS = فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا. Iba-1 = جزيء محول ربط الكالسيوم المتأين 1 ؛ DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يقترح البروتوكول طريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة حول الآفات المزيلة للميالين ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة الخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين الالتهابية. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم التقاطها باستخدام حبات CD11b نقاء عاليا وقابلية للحياة. وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول التوطين الدقيق للبؤر والتنقية المثلى للدبقية الصغيرة. في خطوة البروتوكول 2.1 ، من الضروري حقن محلول NR 2 h قبل التضحية بالماوس لضمان إمكانية عرض الآفات بدقة20. في خطوة البروتوكول 2.8 ، تم توخي الحذر لوضع أقسام أنسجة المخ على صندوق ثلج للتشريح وإكمال هذه الخطوة في أقرب وقت ممكن ، وبالتالي تحسين صلاحية الخلايا. في الخطوة 2.9 ، من الضروري اختيار الأنسجة المناسبة كعينة واحدة لكل من هضم الإنزيم وإزالة الحطام. لا يمكن تخطي الخطوة 3.7 عندما يكون تأثير إزالة الحطام غير مرض. في الخطوة 4.3 ، يجب أن تكون إضافة PBS لطيفة لتشكيل طبقات مختلفة ، مما يضمن إزالة أكبر قدر ممكن من الحطام. يجب تنفيذ جميع الخطوات الواردة في البروتوكول ، باستثناء الهضم الأنزيمي ، على الجليد لضمان بقاء الخلية وتقليل الاستجابة النسخية للدبقية الصغيرة. كل خطوة في البروتوكول خفيفة وتحتفظ بصلاحية عالية ، لذلك من غير الضروري استخدام حل إزالة الخلايا الميتة22,23.
أثبتت طريقة التفكك الأنزيمي لدماغ الفأر في البروتوكول أنها مناسبة ل RNA-seq23 أحادي الخلية. على الرغم من أن الإنزيمات في البروتوكول خفيفة ، فقد وجد مارش وآخرون أن بروتوكولات التحلل المائي الأنزيمي المختلفة عند 37 درجة مئوية قد تغير بشكل كبير من نسخ الخلايا الدبقية الصغيرة24. يمكن أن يساعد وضع عنصر تحكم صحي في التجربة للمقارنة في تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي لإزالة الميالين ، وبالتالي القضاء على الاستجابة النسخية غير الطبيعية في البروتوكول. وفي الوقت نفسه ، لمنع هذه الحالة النسخية غير الطبيعية بعد الهضم الأنزيمي ، يمكن تحسين البروتوكول عن طريق إضافة العديد من مثبطات النسخ والترجمة مثل الأكتينومايسين D و triptolide و anisomycin في خطوات مختلفة. يمكن أن يكشف استخدام هذه المثبطات عن التعبير الجيني الحقيقي للخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي دون إعداد عنصر تحكم. لذلك ، فإن إضافة هذه المثبطات إلى البروتوكول يمكن أن تقلل من عدد الحيوانات أو العينات المطلوبة في التجربة وهي أكثر اقتصادا للتحليل النهائي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن بعض جينات الخلايا الدبقية الصغيرة سيتم تعديلها بواسطة هذه المثبطات ، مما قد يحد من استخدام هذه المثبطات للعمل المستقبلي24. إن استخدام أداة التفكك المتخصصة بعد إضافة مزيج الإنزيم 1 ومزيج الإنزيم 2 لتفكك الأنسجة يمكن أن يحد أيضا من الاستجابات النسخية في خطوة البروتوكول 323.
يحتوي هذا البروتوكول على بعض القيود. نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة هو فقط حوالي 85 ٪ في البروتوكول ، والذي فشل في تشكيل أكثر من 90 ٪ من جميع الخلايا المفردة على غرار الأدبيات الأخرى19,22. قد يكون استبدال عمود LS بعمود MS ، وغياب المرشحات ، وجودة الميكروبيدات هي الأسباب المحتملة. إذا فشلت نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في تلبية المتطلبات ، فإن إطالة وقت الحضانة المغناطيسية أو تمرير الخلايا المفروزة عبر عمود مغناطيسي ثان سيحسن النقاء (الشكل التكميلي S1). إذا كان عدد الخلايا منخفضا ، فيجب حصاد الأنسجة من المزيد من الفئران وفقدان الخلايا بسبب تجنب الطموح المهمل. إذا كانت صلاحية الخلية منخفضة ، فإن استبدال PBS في مخزن التحميل المؤقت بوسيط RPMI 1640 يمكن أن يحسن بشكل كبير من صلاحية الخلية. من المفيد أيضا لصلاحية الخلية التأكد من أن جميع الحلول المستخدمة في البروتوكول جديدة ، وأن البروتوكول قد اكتمل في أقرب وقت ممكن. من المهم للمستخدمين تحقيق التوازن بين النقاء وعدد الخلايا الدبقية الصغيرة التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول.
يستخدم البروتوكول ربط الخلايا الدبقية الصغيرة بحبات CD11b والتخصيب في مجال مغناطيسي لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة. لذلك ، تحتوي الخلايا الدبقية الصغيرة النقية على تلوث الخلايا النخاعية ، وهو أمر لا مفر منه في هذا البروتوكول. على النقيض من FACS-المعيار الذهبي لفرز الخلايا – فإن نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بواسطة MACS ليست عالية بما فيه الكفاية لبعض التطبيقات التفصيلية مثل التسلسل العميق ، مما يحد من استخدامها على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن ل FACS لفرز الخلايا الدبقية الصغيرة القضاء على تلوث الخلايا النخاعية. ومع ذلك ، فإن MACS هي طريقة أكثر لطفا ، وتحتفظ بخصائص مورفولوجية أكثر أصلية للخلايا الدبقية وخاصة الخلايا النجمية ، وتستغرق وقتا أقل لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ، ولها عائد خلوي أعلى من FACS، مما يشير إلى أنها يمكن أن تقلل من عدد الفئران التي سيتم التضحية بها وقد تكون أكثر ملاءمة للتجارب الحساسة للوقت19,25 . وفي الوقت نفسه ، فإن MACS أكثر فعالية من حيث التكلفة ومتاحة على نطاق واسع ولديها متطلبات تقنية أقل للمجربين. وقد ثبت أن نظام التشغيل MACS هو الطريقة الأكثر موثوقية واتساقا لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة. أظهر التحليل المورفولوجي أن الخلايا الدبقية الصغيرة لن يتم تنشيطها بواسطة MACS، وقد أظهر الحمض النووي الريبي أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بهذه الطريقة تحافظ على حالة راحة19,26.
بشكل عام ، يعد البروتوكول مهما لمسح الخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين ، ويمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بواسطة هذا البروتوكول لمختلف التطبيقات النهائية مثل RT-PCR الكمي و RNA-seq. يستخدم البروتوكول صبغة حمراء محايدة لتحديد موقع الآفات المزيلة للميالين ، مما يضمن دقة مواقع الآفات ويقلل من أي ارتباك مع الأنسجة الطبيعية أثناء أخذ العينات. يمكن أن يساعد التوطين الدقيق للآفات في التركيز على آثار الأمراض ودراسة النمط الظاهري الجزيئي الفريد والخصائص الوظيفية للخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين. سيوفر هذا أساسا لدراسة آلية الخلايا الدبقية الصغيرة في الأمراض المزيلة للميالين. هذه الطريقة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام حبات CD11b المغناطيسية يمكن أن تنقي الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الجدوى العالية للخلايا والعائد في وقت قصير ، مع الحد الأدنى من المتطلبات للظروف التجريبية ، مما يسمح بالاستخدام الواسع النطاق لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة في ظروف مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد أعلن صاحبا البلاغ أنه لا توجد مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة من قبل مؤسسة مستشفى تونغجي (HUST) للعلماء الشباب المتميزين (منحة رقم 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
