Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Zusammenfassung

Hochauflösende Kryo-EM-Karten von Makromolekülen können auch mit 200-kV-TEM-Mikroskopen erreicht werden. Dieses Protokoll zeigt die Best Practices für die Einstellung genauer optischer Ausrichtungen, Datenerfassungsschemata und Auswahl von Bildbereichen, die für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze mit einem 200-kV-TEM unerlässlich sind.

Zusammenfassung

Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich in den letzten zehn Jahren als Routinemethode zur Bestimmung der Proteinstruktur etabliert und nimmt einen immer größeren Anteil der veröffentlichten Strukturdaten ein. Jüngste Fortschritte in der TEM-Technologie und -Automatisierung haben sowohl die Geschwindigkeit der Datenerfassung als auch die Qualität der aufgenommenen Bilder erhöht und gleichzeitig das erforderliche Maß an Fachwissen für die Beschaffung von Kryo-EM-Karten mit Auflösungen unter 3 Å verringert. Während die meisten dieser hochauflösenden Strukturen mit modernsten 300-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten wurden, können hochauflösende Strukturen auch mit 200-kV-Kryo-TEM-Systemen erhalten werden, insbesondere wenn sie mit einem Energiefilter ausgestattet sind. Darüber hinaus reduziert die Automatisierung der Mikroskopausrichtung und Datenerfassung mit Echtzeit-Bildqualitätsbewertung die Systemkomplexität und gewährleistet optimale Mikroskopeinstellungen, was zu einer erhöhten Ausbeute an qualitativ hochwertigen Bildern und einem Gesamtdurchsatz der Datenerfassung führt. Dieses Protokoll demonstriert die Implementierung der jüngsten technologischen Fortschritte und Automatisierungsfunktionen auf einem 200-kV-Kryo-Transmissionselektronenmikroskop und zeigt, wie Daten für die Rekonstruktion von 3D-Karten gesammelt werden können, die für die Erstellung von De-novo-Atommodellen ausreichen. Wir konzentrieren uns auf Best Practices, kritische Variablen und häufige Probleme, die berücksichtigt werden müssen, um die routinemäßige Erfassung solcher hochauflösenden Kryo-EM-Datensätze zu ermöglichen. Insbesondere werden folgende wesentliche Themen im Detail behandelt: i) Automatisierung der Mikroskopausrichtung, ii) Auswahl geeigneter Bereiche für die Datenerfassung, iii) optimale optische Parameter für eine qualitativ hochwertige Datenerfassung mit hohem Durchsatz, iv) Energiefilter-Tuning für verlustfreie Bildgebung und v) Datenmanagement und Qualitätsbewertung. Die Anwendung der Best Practices und die Verbesserung der erreichbaren Auflösung unter Verwendung eines Energiefilters werden am Beispiel von Apoferritin demonstriert, das auf 1,6 Å rekonstruiert wurde, und Thermoplasma acidophilum 20S Proteasom, das mit einem 200-kV-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist, auf eine Auflösung von 2,1 Å rekonstruiert wurde.

Einleitung

Die Bestimmung der Proteinstruktur ist entscheidend für das Verständnis der molekularen Architektur, Funktion und Regulation von Proteinkomplexen, die an wichtigen zellulären Prozessen wie Zellstoffwechsel, Signaltransduktion oder Wirt-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind. Die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) hat sich zu einer leistungsfähigen Technik entwickelt, die in der Lage ist, die 3D-Struktur vieler Proteine und ihrer Komplexe zu lösen, die für die traditionellen Strukturtechniken wie Röntgenbeugung und NMR-Spektroskopie zu herausfordernd waren. Insbesondere hat sich Kryo-EM als Methode der Wahl für Membranproteine erwiesen, die für die traditionellen Strukturtechniken nicht ohne weiteres kristallisiert oder in ausreichenden Mengen hergestellt werden können, und lieferte neue Einblicke in die Struktur und Funktion wichtiger zellulärer Rezeptoren und Ionenkanäle 1,2,3,4,5 . In jüngster Zeit hat Kryo-EM eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung der Covid-19-Pandemie gespielt, indem es den Mechanismus der SARS-CoV-2-Infektion auf molekularer Ebene bestimmte, was die Ursprünge der Covid-19-Krankheit aufklärte und die Grundlage für die schnelle Entwicklung effizienter Impfstoffe und Therapeutika bildete 6,7,8,9,10.

Typischerweise werden High-End-300-kV-Transmissionselektronenmikroskope (TEM) zur hochauflösenden Strukturbestimmung von Biomolekülen durch Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse (SPA) verwendet, um ihre Konformation und Wechselwirkungen aufzudecken. Vor kurzem erreichte die SPA-Technik eine neue Grenze, als das gemeinsame Benchmark-Kryo-EM-Probenapoferritin mit atomarer Auflösung (1,2 Å) ^11,12 unter Verwendung eines 300-kV-TEM, das mit der Kaltfeldemissionskanone (E-CFEG), einem direkten Elektronendetektor und einem Energiefilter ausgestattet war^, rekonstruiert wurde. Bei dieser Auflösung war es möglich, Positionen einzelner Atome in der Struktur, die Konformation einzelner Aminosäureseitenketten sowie Wasserstoffbrückenbindungen und andere Wechselwirkungen eindeutig aufzulösen, die neue Möglichkeiten für die strukturbasierte Wirkstoffentdeckung neuer Ziele und die Optimierung bestehender Wirkstoffkandidaten eröffnen.

200-kV-TEM-Mikroskope mittlerer Reichweite werden häufig für das Probenscreening und die Probenoptimierung vor der endgültigen hochauflösenden Datenerfassung mit den High-End-TEM-Mikroskopen verwendet, insbesondere in größeren Kryo-EM-Einrichtungen. Typischerweise können abgebildete Proben im Auflösungsbereich von 3-4 Å aufgelöst werden, der ausreicht, um zur endgültigen Datenerfassung zu einem High-End-TEM mit 300 kV überzugehen. Folglich wird die Datenerfassung mit dem 200-kV-TEM oft nicht weiter optimiert, um Ergebnisse mit höchstmöglicher Auflösung zu erzielen. Darüber hinaus können bei diesen Auflösungen bereits viele interessante biologische Fragen beantwortet und veröffentlicht werden, da alle Aminosäure-Seitenketten bereits gelöst sind und auch die Belegung von Ligandenbindungsstellen zuverlässig bestimmt werden^{kann 13}. Es wurde bereits gezeigt, dass 200-kV-TEMs für zahlreiche Proben 14,15,16,17,18 Auflösungen jenseits von 3 Å erreichen können. Bilder, die mit 200 kV aufgenommen wurden, weisen von Natur aus einen höheren Kontrast der abgebildeten Partikel auf, was trotz eines gedämpfteren Signals bei hoher Auflösung im Vergleich zu 300-kV-TEM-Bildern sogar eine genauere anfängliche Ausrichtung der Partikel ermöglichen kann. Es ist wichtig zu beachten, dass die erreichte Auflösung rekonstruierter Kryo-EM-Karten auch durch strukturelle Flexibilität und Konformationsheterogenität der abgebildeten Proben begrenzt ist, was sich sowohl auf 200-kV- als auch auf 300-kV-Rekonstruktionen auswirkt. Tatsächlich wurden viel mehr Kryo-EM-Rekonstruktionen, die mit den 300-kV-Systemen erhalten wurden, im Auflösungsbereich von 3-4 Å aufgelöst als bei höheren Auflösungen¹⁹. Da 200-kV-TEM-Mikroskope weniger komplex sind und in kleinere Räume passen, stellen diese Mikroskope eine gute, kostengünstigere Option für die Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle durch Kryo-EM dar, während die Automatisierung langer Datensammlungen aus mehreren im Mikroskop-Autoloader-System gespeicherten Proben erhalten bleibt.

Die Sammlung von Kryo-EM-Datensätzen zur hochauflösenden Strukturbestimmung erfordert eine genaue Ausrichtung der Mikroskopoptik. Säulenausrichtungen verlaufen systematisch von der Elektronenquelle bis hinunter zum Kondensatorlinsensystem, der Objektivlinse und dem Energiefilter mit einem Elektronendetektor. Die vollständige Abfolge der Ausrichtungen ist in der Regel nicht erforderlich. Bei Bedarf wird der Benutzer über halbautomatische Verfahren mit einer korrekten Beschreibung jedes Schritts in einem kontextsensitiven Hilfefenster während des gesamten Ausrichtungsvorgangs in der Benutzeroberfläche des Mikroskops (Direct Alignments Control Panel) geführt. Sobald das Mikroskop vollständig ausgerichtet ist, bleibt die Elektronenoptik stabil und die Ausrichtung muss für mindestens einige Monate nicht geändert werden. Nur die empfindlichsten Ausrichtungen, wie parallele Beleuchtung der Probenebene, objektiver Astigmatismus und komafreie Ausrichtung, müssen kurz vor Beginn der Sammlung jedes Datensatzes verfeinert werden. Die Qualität der gesammelten Daten kann dann während der Datenerfassung mit verschiedenen Softwarepaketen wie EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion 22, WARP 23 oder Appion ²⁴ überwacht werden.

Neben der genauen Ausrichtung des Mikroskops ist auch die hohe Qualität gut gereinigter Proben mit minimaler Konformations- und Zusammensetzungsheterogenität eine Voraussetzung für die Sammlung hochauflösender Datensätze und die Lösung hochauflösender Strukturen. Weitere Details zu typischen Protokollen, häufigen Herausforderungen und möglichen Abhilfemaßnahmen finden Sie in anderen Rezensionen zu diesem Thema^25,26,27. Im Wesentlichen ist es wichtig, Bereiche auf einem bestimmten Kryo-EM-Gitter zu finden, das ausreichend dünnes Eis hat, um hochauflösende Informationen zu erhalten, und einzelne Partikel sind dicht verteilt in zufälligen Orientierungen ohne Überlappungen. Typische Kryo-EM-Gitter haben jedoch eine ungleichmäßige Eisdicke, und es ist daher wichtig, die optimalen Bereiche für die Bildgebung zu finden und auszuwählen. Verschiedene Mittel zur Abschätzung der Eisdicke im Netz sind in Softwarepaketen für die automatisierte Erfassung von Kryo-EM-Datensätzen wie EPU 2, Leginon²⁸ oder SerialEM²⁹ verfügbar.

Das Aufkommen schneller und empfindlicher direkter Elektronendetektoren ermöglichte die Sammlung von Bildern in vielen Fraktionen als Filme, die die Kompensation strahleninduzierter Bewegungen ermöglichten und zu einer erheblichen Steigerung der Qualität und Quantität der in der Bildverarbeitung und der endgültigen 3D-Rekonstruktion verwendeten Daten^{führten 30}. Gleichzeitig bieten Automatisierung und Datenerfassung mit hohem Durchsatz riesige Datensätze mit Tausenden von Bildern / Filmen, die Herausforderungen für die Datenspeicherung und den Datenzugriff darstellen. Das angenommene Modell mit großen Kryo-EM-Einrichtungen, die Dutzende bis Hunderte von Benutzern bedienen, erfordert insbesondere ein organisiertes Datenmanagement mit ordnungsgemäßer Nachverfolgung und Datenaustausch in etablierten Kryo-EM-Pipelines^31,32.

Diese Studie beschreibt ein Protokoll für die routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit dem 200 kV Glacios TEM-Mikroskop. Notwendige Ausrichtungen der Mikroskopoptik werden zusammen mit Verfahren zur Auswertung von Kryo-EM-Proben und Auswahl geeigneter Bereiche für die hochauflösende Datenerfassung beschrieben. Die Organisation der gesammelten Daten und der zugehörigen Metadaten mit Beispielinformationen wird in Athena demonstriert - einer Datenmanagementplattform, die die Überprüfung von Probeninformationen und gesammelten Daten erleichtert. Mit der Maus-Apoferritin-Probe konnte eine 3D-Rekonstruktion bei 1,6 Å Auflösung¹³ erreicht werden. Mit dem beschriebenen Protokoll haben wir auch die 3D-Dichtekarte des 20S-Proteasoms aus Thermoplasma acidophilum mit einer Auflösung von 2,1 Å rekonstruiert.

Protokoll

Alle Schritte des Protokolls sind für das 200-kV-Glacios-TEM-System (im Folgenden als 200-kV-TEM bezeichnet) beschrieben, das mit dem Selectris-X-Energiefilter (im Folgenden als Energiefilter bezeichnet) und dem Falcon 4-Detektor (im Folgenden als direkter Elektronendetektor bezeichnet) ausgestattet ist. Die Protokollschritte sind spezifisch für die EPU-Anwendung, bei der es sich um die Standard-SPA-Datenerfassungssoftware handelt, die auf jedem Glacios-System vorinstalliert ist. Die folgenden Protokollschritte entsprechen der EPU-Version 2.14 und kleine Änderungen werden erwartet, wenn eine andere EPU-Version verwendet wird. Voraussetzungen für dieses Protokoll sind: i) die Pistolen- und Säulenausrichtungen sind gut ausgerichtet, ii) die EM-Kalibrierungen sind korrekt und iii) die EPU-Autofunktionen sind korrekt kalibriert.

1. Laden von Gittern ins Mikroskop

HINWEIS: Das in diesem Experiment verwendete 200-kV-TEM kann bis zu 12 Autogrids (d. h. herkömmliche TEM-Gitter, die in eine spezielle Kartusche geclippt sind) in einer Kassette aufnehmen, die im Autoloader des Mikroskops geladen und ständig bei Temperaturen unter -170 ° C gehalten wird, um eine Probenabweichung zu verhindern.

1. Setzen Sie Autogrids unter flüssigen Stickstoffbedingungen in die Autoloader-Kassette ein.
2. Legen Sie die Kassette mit Autogrids in eine flüssigkeitsstickstoffgekühlte Transferkapsel ein.
3. Legen Sie die Kapsel in das Mikroskop ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Dock in der Mikroskop-Benutzeroberfläche, um die Kassette aus der Kapsel in den Autoloader des Mikroskops zu laden.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Inventar , um das Vorhandensein von Autogrids in der geladenen Kassette zu überprüfen.
5. Klicken Sie auf die Schaltflächen Laden und Entladen , um Autogrids in die Spalte für TEM-Imaging einzufügen.

2. Festlegen eines Projekts in einer Datenverwaltungsplattform (optional)

HINWEIS: Beispielinformationen und gesammelte Daten können in der bereitgestellten Datenmanagementplattform organisiert werden, die die Speicherung strukturierter Daten für alle angeschlossenen Instrumente ermöglicht. Es kann ein Projekt erstellt werden, für das beliebige Workflow-Schritte definiert werden können, um die Bilder und Metadaten auf organisierte Weise zur Überprüfung und zum Export zu erfassen.

1. Starten Sie die Anwendung des Datenverwaltungsportals und melden Sie sich mit einem Benutzernamen und einem Kennwort an.
2. Klicken Sie im linken Bereich der Portal-Benutzeroberfläche auf die Schaltfläche Projekt hinzufügen, um ein neues Projekt zu erstellen, oder klicken Sie auf eine Schaltfläche eines vorhandenen Projekts in der Liste unten, um ein Projekt zu öffnen.
3. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment hinzufügen , um ein neues Experiment innerhalb des geöffneten Projekts zu erstellen.
4. Füllen Sie die Beschreibung im Metadatenbedienfeld des neuen Experiments aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Workflow hinzufügen, um einen neuen Workflow innerhalb des Experiments zu erstellen (z. B. Einzelpartikelanalyse).
5. Klicken Sie optional auf die Schaltfläche Add Step im mittleren Bereich, um einen benutzerdefinierten Workflow zu erstellen oder dem vordefinierten SPA-Workflow zusätzliche Schritte hinzuzufügen (Abbildung 1 und Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Schritte können die Probenvorbereitung, die Probencharakterisierung durch biochemische Techniken, die Probenvitrifikation, das Screening von Kryo-EM-Gittern, Datenerfassungssitzungen und die Datenanalyse darstellen.
6. Füllen Sie optional Beschreibungen in den Notizen der einzelnen Schritte aus, die Bilder und Fotos enthalten können.
7. Erstellen Sie einen Datensatzschritt im Workflow, und wählen Sie den Datensatztyp als EPU aus.
   HINWEIS: Dies ermöglicht es der Analysesoftware, alle Ergebnisdaten / Metadaten während der Datenerfassung automatisch an der richtigen Stelle im Datenverwaltungsportal zu platzieren und die Daten automatisch an das bevorzugte Ziel zu exportieren, während alle Schritte und die Datenübertragung vollständig aufgezeichnet werden.
8. Füllen Sie Vorlagen zu den Proben- und EM-Gittern im Schritt Biochemie aus und ordnen Sie jedes Raster einer Probe zu (beachten Sie, dass eine Probe mehreren Gittern zugeordnet werden kann).
9. Ordnen Sie Beispiel-Raster-Kombinationen im Metadatenabschnitt des Dataset-Schritts zu.

3. Einrichten von Bildvoreinstellungen und Bildverschiebungskalibrierungen in der Analysesoftware

1. Legen Sie die Bildgebungsparameter für einzelne Bildgebungsmodi fest, wie in Tabelle 1 dargestellt. Überlegungen zur Auswahl bestimmter Einstellungen werden im Abschnitt Diskussion ausführlich beschrieben.
2. Stellen Sie die parallele Beleuchtung für die gewählte Vergrößerung in der Voreinstellung Datenerfassung der Analysesoftware ein
   HINWEIS: Es gibt nur eine Einstellung der C2-Linse für die parallele Beleuchtung der Probe bei der angegebenen SPOT-Größe (d. h. voreingestellte Stärken der C1-Linse) auf 2-Kondensator-TEM-Systemen, wie dem in dieser Studie verwendeten 200-kV-TEM. Die Elektronendosisleistung pro Flächeneinheit (e-/Ų/s) kann daher nur durch Ändern der SPOT-Größeneinstellungen und Neueinstellen der ^C2-Stärke (Strahlintensität) gemäß den folgenden Schritten eingestellt werden.
   1. Bewegen Sie sich in einen Bereich mit Stützkohlefolie und dünnem oder keinem Eis.
   2. Wählen Sie die Objektivblende von 100 μm oder 70 μm im Menü Blende der TEM-Benutzeroberfläche aus.
   3. Drücken Sie die Beugungstaste auf den Bedienfeldern, um in den Beugungsmodus zu wechseln.
   4. Setzen Sie den fluoreszierenden Bildschirm ein und ändern Sie den FluCam-Modus auf High Resolution.
   5. Verschieben Sie die zentrale Beugungsstelle an einen Rand der Blende. Wenn der Blendenrand nicht sichtbar ist, erhöhen Sie die Kameralänge (mit dem Vergrößerungsknopf).
   6. Drehen Sie vorsichtig den Fokusknopf am Bedienfeld, um die hintere Fokusebene in den Fokus zu bringen. Die hintere Fokusebene wird fokussiert, wenn die Blendenkante sichtbar scharf ist.
   7. Reduzieren Sie die Empfindlichkeit der FluCam auf die niedrigste Stufe und verschieben Sie den zentralen Beugungspunkt in die Mitte der FluCam.
   8. Minimieren Sie die Größe des zentralen Spots mit dem Intensitätsregler auf dem Bedienfeld.
   9. Ziehen Sie die Objektivblende in der TEM-Benutzeroberfläche ein, und wechseln Sie zurück in den Imaging-Modus.
   10. Klicken Sie in der Analysesoftware auf die Schaltfläche Abrufen , um die Einstellungen in der Voreinstellung Datenerfassung zu speichern.
3. Passen Sie die Elektronendosisleistung in der Datenerfassungsvoreinstellung an, die für den verwendeten Detektor optimal ist:
   1. Bewegen Sie sich in einen leeren Bereich auf dem Raster (z. B. ein Gitterquadrat mit zerbrochener Kohlefolie)
   2. Klicken Sie in der Analysesoftware auf die Schaltfläche Dosis messen, um die Elektronendosisleistung zu messen .
   3. Ändern Sie die SPOT-Größe, um die optimale Dosisleistung zu erreichen. Im Falle des in diesem Protokoll verwendeten direkten Elektronendetektors wird typischerweise eine Dosisleistung von 4-5 e^-/pixel/s für die hochauflösende Datenerfassung verwendet. Dies entspricht typischerweise der SPOT-Größe 4-6.
   4. Überprüfen und passen Sie die parallele Beleuchtung an der neuen SPOT-Größeneinstellung wie oben beschrieben an.
   5. Wählen Sie unter Brüche die Option EER aus, um den EER-Modus auf dem direkten Elektronendetektor³³ zu verwenden.
   6. Klicken Sie in der Analysesoftware auf die Schaltfläche Abrufen , um die Einstellungen in der Voreinstellung Datenerfassung zu speichern.
   7. Wechseln Sie zur Autofokus-Voreinstellung und drücken Sie die Get-Taste , um die Beleuchtungseinstellungen für die Fokussierung zu speichern. Ändern Sie die Belichtungszeit manuell auf 1 s und den Binning-Modus 2.
   8. Wechseln Sie zur Voreinstellung Thon Rings und drücken Sie die Get-Taste , um die Beleuchtungseinstellungen für diese Voreinstellung zu speichern. Ändern Sie die Belichtungszeit manuell auf 1-2 s und den Binning-Modus 2.
   9. Wechseln Sie zur Null-Verlust-Voreinstellung und drücken Sie die Get-Taste , um die Beleuchtungseinstellungen für diese Voreinstellung zu speichern. Ändern Sie die Belichtungszeit manuell auf 0,5 s und den Binning-Modus 4.
4. Kalibrieren Sie Bildverschiebungen zwischen den eingestellten optischen Einstellungen, wie im Handbuch der Analysesoftware beschrieben, indem Sie die Aufgabe " Bildverschiebungskalibrierung " auf der Registerkarte " Vorbereitung" verwenden (Ergänzende Abbildung 1).

Tabelle 1: Typische Bildgebungseinstellungen für die hochauflösende Datenerfassung mit einem 200-kV-Kryo-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist. Die Einstellungen werden für jede optische Voreinstellung angezeigt, die bei der Einrichtung der automatisierten Datenerfassung verwendet wird (Abschnitt 3 des Protokolls). Diese Einstellungen sind spezifisch für das 200-kV-TEM-Mikroskop und den direkten Elektronendetektor, die in dieser Studie verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

4. Grid-Mapping und Auswahl der besten Kryo-EM-Gitter für die Datenerfassung

1. Wählen Sie die Registerkarte Atlas und klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Sitzung , um eine neue Sitzung zu öffnen.
2. Geben Sie Details wie den Sitzungsnamen und den Speicherort der Daten ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um ein neues Fenster mit der Prüfaufgabe zu öffnen, in dem eine Liste aller Raster im Autoloader-Inventar angezeigt wird. Bearbeiten Sie optional die Namen der Raster.
3. Wählen Sie die gewünschten Raster aus, indem Sie ein Kontrollkästchen neben der entsprechenden Rasternummer aktivieren.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Start , um eine vollautomatische Sammlung von Atlanten aller ausgewählten Raster zu starten.
5. Wenn die Sammlung abgeschlossen ist, klicken Sie auf Rasterbeschriftungen, um die erworbenen Atlanten zu überprüfen.
   HINWEIS: Einzelne Gitterquadrate werden nach ihrer relativen Eisdicke klassifiziert, die auf der Bewertung des relativen Graustufenwerts in jedem Atlas basiert. Die klassifizierten Rasterquadrate werden in verschiedenen Farbschemata dargestellt, die zur Steuerung der Auswahl von Datenerfassungsbereichen verwendet werden können. Ein mit einem Vitrobot Mk IV hergestelltes Gitter zeigt typischerweise einen Eisdickengradienten über das gesamte Gitter an, was dazu beitragen kann, die ideale Eisdicke für die Datenerfassung zu identifizieren. Ein optimales Gitter sollte möglichst wenig Transfereisverunreinigungen enthalten und genügend ungebrochene und rissfreie Gitterquadrate aufweisen (Abbildung 3). Gitter mit geeigneter Eisverteilung können weiter untersucht werden, um die Verteilung von Partikeln im Eis bei hoher Vergrößerung (d.h. Dichte und Orientierung einzelner Partikel) zu beurteilen.
6. Klicken Sie im oberen Menü auf die Schaltfläche Probe laden , um ein ausgewähltes Raster mit geeigneter Eisverteilung in die Mikroskopspalte einzufügen.
7. Wählen Sie die Registerkarte Atlas , klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein geeignetes Rasterquadrat im Atlasbild und wählen Sie die Option Bühne hier verschieben aus dem Dropdown-Menü, um die Bühne auf das Gitterquadrat zu verschieben.
8. Wählen Sie die Registerkarte Automatische Funktionen , um das Rasterquadrat auf die Euzentrische Höhe festzulegen. Wechseln Sie zur Voreinstellung Euzentrische Höhe , klicken Sie auf die Autofunktion Auto-Eucentric by Beam Tilt in der Mitte des gewählten Rasterquadrats und klicken Sie auf die Schaltfläche Start .
9. Wechseln Sie zur Voreinstellung "Rasterquadrat " und erfassen Sie ein Bild. Verschieben Sie die Bühne in ein Loch mit Eis und keiner oder minimaler Kontamination durch einen Rechtsklick und die Option "Bühne hier verschieben ".
10. Wechseln Sie zur Voreinstellung " Bohrung/Euzentrische Höhe" und erfassen Sie ein Bild. Verschieben Sie die Bühne in einen Kohlenstoffbereich neben dem interessierenden Loch, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und die Option "Bühne hier verschieben" verwenden.
11. Klicken Sie auf die Autofokus-Autofunktion und stellen Sie die Werte für den gewünschten Unscharfzeig auf 0 μm und Iterieren auf -2 μm ein. Wechseln Sie zur Autofokus-Voreinstellung und klicken Sie auf die Schaltfläche Start .
12. Wählen Sie erneut die Registerkarte Vorbereitung und wechseln Sie zur Voreinstellung Bohrung/Euzentrische Höhe . Wählen Sie auf dem zuvor aufgenommenen Bohrungsbild einen Interessenbereich innerhalb des Bohrlochs aus und verschieben Sie die Bühne an diese Position, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und die Option " Bühne hier verschieben" auswählen.
13. Wechseln Sie zur Voreinstellung Datenerfassung und stellen Sie die Wartezeit nach der Balkenverschiebung auf 0,5 s und die Wartezeit nach der Stufe auf 20 s ein. Erfassen Sie ein Bild mit Defokus zwischen -3 μm und -5 μm, um den Kontrast mit niedriger Auflösung für eine bessere Visualisierung einzelner Partikel zu erhöhen.
14. Optional können Sie die Schritte 4.7-4.13 wiederholen, um Partikel in verschiedenen Löchern und verschiedenen Gitterquadraten mit unterschiedlichen Eisdicken nach Bedarf abzubilden.
15. Sobald das am besten geeignete Raster für die hochauflösende Datenerfassung identifiziert und ausgewählt wurde, klicken Sie im oberen Menü auf die Schaltfläche Beispiel laden, um das ausgewählte Raster in den TEM zu laden .
    HINWEIS: Wenn weitere Informationen benötigt werden und/oder eine Automatisierung dieses Screening-Prozesses gewünscht wird, führen Sie alternativ Abschnitt 5 durch.

5. Einrichten einer Datenerfassungssitzung in der Einzelpartikelanalysesoftware

HINWEIS: Bei Verwendung der Goldfoliengitter funktioniert die Verfeinerung von objektivem Astigmatismus und Komaausrichtungen (Abschnitt 6) möglicherweise nicht zuverlässig. Es wird empfohlen, ein Kohlefoliengitter oder ein Kreuzgitter-EM-Gitter zu laden und diese endgültigen Ausrichtungen durchzuführen, bevor die Datenerfassung eingerichtet wird.

1. Wählen Sie die Registerkarte EPU und klicken Sie auf die Schaltfläche Sitzungserstellung , um eine neue Sitzung im linken Bereich zu erstellen. Wählen Sie die Option "Neue Sitzung", um aktuelle optische Voreinstellungen zu verwenden, oder die Option "Neu aus den Voreinstellungen", um zuvor exportierte Sitzungseinstellungen zu laden.
2. Geben Sie den Sitzungsnamen und den Datenspeicherort ein.
   HINWEIS: Dieser Speicherort wird zum Speichern integrierter Bilder und Metadaten aus der Datenerfassungssitzung in einem Unterordner mit dem Sitzungsnamen verwendet. Obwohl diese Daten nicht wesentlich Speicherplatz beanspruchen, wird empfohlen, diese Daten auf dem Falcon-Offload-Datenspeicher des DMP-Servers zu speichern, da die EER-Kamerabilder immer im Stammverzeichnis dieses Datenspeichers in einem Verzeichnis mit dem Sitzungsnamen gespeichert sind.
3. Wählen Sie den Typ Manuell der Sitzung aus, um die Kontrolle über die Auswahl einzelner Bohrungen in Rasterquadraten zu haben, die für die Datenerfassung später im Protokoll ausgewählt wurden.
4. Wählen Sie den schnelleren Erfassungsmodus, um AFIS (Aberration-Free Image Shifting) für die Datenerfassung zu verwenden, um Bühnenbewegungen zwischen einzelnen Bohrungen zu reduzieren, die Gesamtabtastdrift zu reduzieren und den Durchsatz der Datenerfassung ohne Verschlechterung der Bildqualität zu erhöhen.
5. Wählen Sie das Standard-MRC-Format der gespeicherten integrierten Bilder aus.
6. Geben Sie das verwendete Raster und seinen Typ an. Dieses Protokoll verwendete das R-1.2/1.3 UltraAufoil für Apoferritin und das R-2/1 Quantifoil-Gitter für das 20S-Proteasom. Wählen Sie Quantifoil unter Probenträger und R1.2/1.3 oder 2/1 unter Quantifoil-Typ.
7. OPTIONAL: Klicken Sie auf die Schaltfläche Athena Login in der unteren rechten Ecke, um den EPU Quality Monitor (EQM) zu verwenden.
   1. Geben Sie die Anmeldedaten in das Browser-Popup-Fenster ein, um den Einstellungsbereich in der Sitzungseinrichtungsübersicht zu aktivieren.
   2. Klicken Sie im Abschnitt Einstellungen auf die Schaltfläche Auswählen und suchen Sie nach dem zuvor erstellten Datensatz (Protokollabschnitt 2), um ihn der aktuellen Datensammlung zuzuordnen. Schalten Sie das Kontrollkästchen Qualitätsmonitor aktivieren ein.
8. Klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um eine neue Sitzung zu erstellen.
   HINWEIS: Diese Aktion öffnet neue Aufgaben im Menü der linken Spalte. Zu jedem Zeitpunkt während der Sitzung, wenn einige Details falsch sind, ist es möglich, zur Aufgabe Sitzungseinrichtung zurückzukehren, die Details zu ändern / zu aktualisieren und erneut auf Übernehmen zu klicken, um die Sitzung zu aktualisieren.
9. Wählen Sie im linken Bereich die Aufgabe "Quadratauswahl" aus, um den gesammelten Atlas des Rasters anzuzeigen.
10. Doppelklicken Sie optional auf eine beliebige Kachel des Atlas, um ein Bild mit höherer Qualität zu sehen, um die Eisqualität in den Gitterquadraten besser beurteilen zu können. Doppelklicken Sie erneut auf das Bild, um zum Rasteratlas zurückzukehren.
11. Identifizieren Sie Gitterquadrate mit den folgenden Merkmalen (Abbildung 4): (i) Die Trägerfolie im Gitterquadrat ist unbeschadet intakt, (ii) Glasdünnes Eis in Folienlöchern (die Löcher erscheinen heller als die Stützcarbonfolie), (iii) so wenig kristalline Eisverunreinigung (schwarze Flecken) im Gitterquadrat wie möglich, (iv) Minimaler Helligkeitsgradient über das Gitterquadrat und innerhalb einzelner Folienlöcher.
    HINWEIS: Mit den gewählten Voreinstellungen und mit einem guten Raster kann das in dieser Studie verwendete 200-kV-Kryo-TEM mit einer Rate von ~ 200-300 Filmen / h abbilden. Wählen Sie in diesem Sinne so viele Quadrate wie nötig aus oder fügen Sie später weitere hinzu, indem Sie je nach verfügbarer Mikroskopzeit zur Quadratauswahlaufgabe zurückkehren. Als Referenz wurden 3000 Filme gesammelt, um eine Auflösung von 1,6 Å von Apoferritin zu erreichen.
12. Wählen Sie Rasterquadrate für die Datenerfassung entweder im vollständigen Atlas oder in hochwertigen Kachelbildern
    1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Gitterquadrat von Interesse und wählen Sie im Kontextmenü die Option Auswählen
    2. Alternativ können Sie die Strg-Taste auf der Tastatur gedrückt halten und mit der linken Maustaste auf die gewünschten Rasterquadrate klicken
    3. Umgekehrt können Sie mit der rechten Maustaste klicken und die Auswahl aufheben oder die Umschalttaste gedrückt halten und mit der linken Maustaste klicken, um Quadrate zu entfernen
    HINWEIS: Die nächsten Schritte sind entscheidend, um sicherzustellen, dass die Datenerfassung zu einer hochauflösenden Rekonstruktion führt. Beginnen Sie mit der Auswahl von Löchern im Gitterquadrat mit einer dünnen Eisschicht. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dieses Rasterquadrat, und wählen Sie die Option Bohrungen auswählen, um die Aufgabe Bohrungsauswahl (Hole Selection (Bohrungen auswählen) zu starten.
13. Wählen Sie im linken Bereich die Aufgabe Bohrungsauswahl (Hole Selection ) aus, um Bohrungen in den ausgewählten Rasterquadraten auszuwählen.
14. Klicken Sie auf die Schaltfläche Auto-Eucentric , um automatisch zum ersten ausgewählten Gitterquadrat zu wechseln, die Euzentrische Höhe anzupassen und ein Gitterquadratbild zum Auffinden von Folienlöchern zu erhalten.
15. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen suchen , um Folienlöcher im Bild zu finden.
    HINWEIS: Wenn die Lochsuche nicht gut funktioniert hat (d. h. es gibt entweder übersprungene Löcher oder falsch dimensionierte Löcher im Bild), überprüfen Sie, ob korrekte Werte in den Eintrag Quantifoil Type der Aufgabe Session Setup eingegeben wurden, und suchen Sie die Löcher erneut. Wenn Löcher immer noch nicht korrekt gefunden werden, klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungsgröße messen , um den Lochdurchmesser und -abstand manuell einzustellen und die Bohrungen erneut zu finden.
16. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrungen entfernen in der Nähe der Schaltfläche Rasterleiste, um die Auswahl von Bohrungen in der Nähe von Rasterbalken aufzuheben.
17. Passen Sie die Grenzwerte im Helligkeitshistogramm des Eisfilters (unten rechts im Softwarefenster) an, um alle Löcher mit zu dickem Eis (mit der linken Grenzwertlinie) sowie alle leeren Löcher (mit der rechten Grenzlinie) zu entfernen, wie in Abbildung 4 dargestellt.
    HINWEIS: Zur Verfeinerung können bestimmte Intensitätswerte auch in die entsprechenden Textfelder neben der Schaltfläche Übernehmen eingegeben werden.
18. Verwenden Sie optional den Auswahlpinsel, um die Auswahl der Bohrungen manuell zu verfeinern: Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie den Pinsel, um unerwünschte Bohrungen abzuwählen. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und klicken Sie mit der linken Maustaste, um Folienlöcher erneut auswählen zu können. Halten Sie die Umschalttaste gedrückt und scrollen Sie mit dem Mausrad, um die Pinselgröße anzupassen.
19. Wählen Sie eine Bohrung zum Festlegen und Testen einer Datenerfassungsvorlage aus, die während der Datenerfassung wiederholt verwendet wird: Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf eine Bohrung im quadratischen Rasterbild und wählen Sie die Option Bühne an Position verschieben.
20. Wählen Sie im linken Bereich die Aufgabe Vorlagendefinition aus.
21. Wählen Sie die Voreinstellung Bohrung/Euzentrisch und klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um ein Bild aufzunehmen.
22. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bohrung suchen und zentrieren, um eine Bohrung im Bild zu zentrieren .
23. Legen Sie die Werte für "Verzögerung nach Bildverschiebung " auf 0,5 s (Standardeinstellung) und " Verzögerung nach Bühnenverschiebung" auf 20 s fest.
    HINWEIS: Da der parallele Strahldurchmesser auf dem in dieser Studie verwendeten 200-kV-Kryo-TEM-System festgelegt ist und typischerweise 1,6-1,7 μm mit einer 50-μm-Blende entspricht, kann nur 1 Bild pro Loch mit den R-1.2/1.3-Gittern und 2 Bilder pro Loch (nahe gegenüberliegenden Kanten) mit den R-2/1- oder R-2/2-Gittern aufgenommen werden. Bitte beachten Sie, dass die Größe der eingestellten Erfassungsflächen auf dem Bildschirm nicht dem tatsächlichen Strahldurchmesser entspricht. Die Bildmaßstabsleiste kann verwendet werden, um einen geeigneten Platzierungsabstand zu schätzen.
24. Wählen Sie die Schaltfläche Aufnahmebereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Stelle im mittleren Loch auszuwählen, von der aus die Bildaufnahme mit hoher Vergrößerung durchgeführt wird.
25. Wählen Sie die Schaltfläche Autofokusbereich hinzufügen und klicken Sie auf das Bild, um die Position auf der Stützfolie neben der zentrierten Bohrung auszuwählen, an der der Autofokus des Bildes durchgeführt wird.
    HINWEIS: Die Strahlgröße für die Fokussierung beträgt 1,6-1,7 μm und sollte äquidistant von benachbarten Löchern auf Kohlenstoff platziert werden.
26. Klicken Sie auf den grünen Erfassungsbereich, um eine Reihenfolge von Defokussierungswerten in der Defocus-Liste im oberen Bereich des Softwarefensters festzulegen. Geben Sie als erstes die höchste Defokus ein, um die Visualisierung von Partikeln in einem Testlauf der folgenden Vorlagenausführungsaufgabe zu verbessern.
27. Klicken Sie auf den blauen Autofokusbereich, um die autofokusspezifischen Einstellungen im selben Bereich festzulegen:
    1. Wählen Sie die Option Nach der Zentrierung , um den Autofokus zu Beginn jedes AFIS-Clusters zu starten.
    2. Wählen Sie die Option Objektiv für schnelleren Autofokus und reduzierte Bühnendrift.
28. Wählen Sie den Task Vorlagenausführung aus und klicken Sie auf den Button Ausführen.
    1. Beobachten Sie einzelne Schritte des Datenerfassungsvorgangs (Zentrieren des Lochs, Autofokus im ausgewählten Bereich und Bildaufnahme in den eingestellten Bereichen) und überprüfen Sie die Qualität der abgebildeten Partikel im endgültigen Bild mit hoher Vergrößerung.
    2. Klicken Sie auf die FFT-Schaltfläche unten rechts im Bildfenster mit hoher Vergrößerung, um das FFT-Bild zu überprüfen und visuell zu beurteilen, ob Thon-Ringe mehrere Schwingungen aufweisen und sich im FFT-Bild auf eine hohe Auflösung erstrecken.
29. Wenn die Vorlagenausführung erfolgreich abgeschlossen wurde, klicken Sie in der Aufgabe Bohrungsauswahl auf die Schaltfläche Alle Quadrate vorbereiten, damit die Datenerfassung in allen anderen ausgewählten Gitterquadraten automatisch entsprechend den in diesem ersten Rasterquadrat verwendeten Einstellungen festgelegt wird.

6. Abschließende Mikroskopausrichtung vor Beginn der Datenerhebung

HINWEIS: Um die besten hochauflösenden Ergebnisse zu erzielen, sollten die empfindlichsten Ausrichtungen genau mit den gleichen Einstellungen wie der Datenerfassungsmodus in der Datenerfassungssoftware und kurz vor Beginn der eigentlichen Datenerfassung durchgeführt werden. Diese Ausrichtungen sollten an einer Position mit dünnem Stützkohlenstoff des Gitters erfolgen, die ausreichend von Gitterstäben entfernt und auf der euzentrischen Höhe ausgerichtet ist.

1. Wählen Sie die Aufgabe Vorlagenausführung aus, erfassen Sie ein neues Bild und bewegen Sie sich mit der Bühne durch einen Rechtsklick in einen sauberen Bereich auf Kohlefolie und wählen Sie den Menüpunkt Bühne hierher verschieben.
2. Wählen Sie die Registerkarte Automatische Funktionen und legen Sie die gewünschte Defokussierung auf 0 μm und die Iteration auf -2 μm fest. Wechseln Sie zur Autofokus-Voreinstellung und klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um die Autofokus-Funktion auszuführen.
3. Legen Sie den fluoreszierenden Bildschirm ab und öffnen Sie das Menü Direkte Ausrichtungen in der TEM-Benutzeroberfläche.
4. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, können erfahrene Benutzer die Ausrichtung von Drehpunkten überprüfen: Wählen Sie im Menü "Direktausrichtungen" die Aufgabe nP Beam Tilt pp X aus und überlappen Sie die springenden Balken mit den Multifunktionsknöpfen an den Bedienfeldern maximal. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die np Beam Tilt pp Y-Aufgabe.
5. Klicken Sie auf die EF-Schaltfläche im Kameramenü des fluoreszierenden Bildschirms, um einen grünen Kreis anzuzeigen, der die Eingangsöffnung des Energiefilters anzeigt und den Strahl über den grünen Kreis zentriert.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Turbopumpe gestoppt wird, bevor Sie fortfahren. Vibrationen davon reduzieren die Anzahl der sichtbaren Thon-Ringe und führen häufig dazu, dass die Autofunktionen ausfallen.
6. Gehen Sie zurück zum Softwarefenster und wählen Sie die Registerkarte Automatische Funktionen in der Menüleiste.
7. Wählen Sie die Autostigmate-Aufgabe aus, wechseln Sie zur Voreinstellung "Thon Ring " und drücken Sie die Starttaste . Beobachten Sie den Prozess, um sicherzustellen, dass (i) die aufgenommenen Bilder auf Kohlenstoff sind, (ii) die Thon-Ringe deutlich sichtbar sind und (iii) die berechnete CTF-Anpassung (gepunktete Linien) gut an den Thon-Ring-Minima platziert sind (Ergänzende Abbildung 2).
8. Wählen Sie den Autokoma-Task aus und drücken Sie die Start-Taste . Beobachten Sie den Prozess, um sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilder auf Kohlenstoff sind und dass die Thon-Ringe deutlich sichtbar sind und dass die berechneten Passungen (gepunktete Linien) gut an den Thon-Ring-Minima platziert sind. Vergrößern Sie jedes Thon-Ring-Bild mit dem Mausrad (Ergänzende Abbildung 3).
   HINWEIS: Wenn das Mikroskop mit einem Energiefilter ausgestattet ist, sollte die Energiefilterabstimmung als Teil der Ausrichtungssequenz erfolgen, um den Filterspalt auf den Null-Verlust-Peak zu zentrieren und Verzerrungen im Prisma des Energiefilters zu korrigieren (Schritte 6.9-6.14). Diese Ausrichtungen sollten an einem leeren Bereich des Rasters vorgenommen werden, z. B. in einem unterbrochenen Rasterquadrat.
9. Öffnen Sie die Sherpa-Benutzeroberfläche , und wählen Sie die Energiefilteranwendung aus (Ergänzende Abbildung 4).
10. Stellen Sie die Kamera im Fenster Einstellungen auf EF-Falcon, bin 4x, Belichtungszeit 0,2 s ein.
11. Klicken Sie auf die Schaltfläche Mitte in der Option Nullverlust , um den verlustfreien Energiefilterspalt zu zentrieren.
12. Klicken Sie in der Option Isochromatizität auf die Schaltfläche Tune (Ergänzende Abbildung 4).
13. Klicken Sie auf die Tune-Vergrößerung und Tune-Verzerrungen in der Option Geometrische und chromatische Verzerrungen (Ergänzende Abbildung 5, Ergänzende Abbildung 6)
14. Wenn die Ergebnisse nicht innerhalb der angegebenen Spezifikationen liegen und im Ausgabebericht in roter Farbe angezeigt werden, wiederholen Sie die Ausrichtungen aus Schritt 6.11 erneut.
    HINWEIS: Obwohl die direkte Elektronendetektor-Verstärkungsreferenz über Monate stabil sein kann, sollte eine neue Verstärkungsreferenz mit dem Falcon 4 Reference Image Manager aufgenommen werden, wenn Bilder von leeren Bereichen keine gleichmäßige Intensität aufweisen, aber Streifen oder andere unterschiedliche Merkmale aufweisen. Alternativ berechnen Sie eine Fast Fourier Transformation (FFT) eines solchen Bildes und stellen Sie sicher, dass keine Linien sichtbar sind.
15. Wählen Sie im Softwarefenster die Registerkarte Vorbereitung und wechseln Sie zur Voreinstellung Datenerfassung .
16. Stellen Sie die Dosiseinstellung auf 40 e^-/Ų ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Dosisleistung messen .
17. Gehen Sie zur Registerkarte EPU , wählen Sie die Aufgabe Automatisierte Erfassung und aktivieren Sie optional die Funktion Auto Zero Loss . Klicken Sie auf die Schaltfläche Start Run , um die vollautomatische Datenerfassung zu starten.

7. Überwachung und Optimierung der Datenqualität bei der Datenerhebung

HINWEIS: Während der Datenerfassung können die gesammelten Daten mit dem EQM über das Datenmanagement-Portal überwacht werden. EQM führt die Bewegungskorrektur und CTF-Bestimmung on-the-fly durch und zeigt die Ergebnisse im Portal an. Der Anwender ist dann in der Lage, die Qualität einzelner Akquisitionen zu beurteilen, Grafiken zu verschiedenen Qualitätsindikatoren zu sehen, unerwünschte Akquisitionen herauszufiltern und die Daten entweder im laufenden Betrieb oder als Batch-Job in ihre Endlagerung zu exportieren.

1. Navigieren Sie zu dem Datensatz, in dem die Analysesoftware die Daten mithilfe eines Webbrowsers platziert.
2. In der Datensatzübersicht zeigen Erfassungskarten die Informationen zur Bewegungskorrektur und CTF-Bestimmung in einem Grafikformat an. Klicken Sie auf einzelne Karten, um weitere Informationen zu erhalten.
3. Aktivieren Sie das DataViz-Bedienfeld , um aggregierte Diagramme aus dem vollständigen Datensatz anzuzeigen, die den Defokussierungs-, Astigmatismus- und CTF-Konfidenzbereich pro Erfassung zeigen (Ergänzende Abbildung 7).
4. Verwenden Sie die Filter oben im Bedienfeld, um nur die Daten auszuwählen, die sich innerhalb des angeforderten Defokusbereichs befinden, einen Astigmatismus nahe Null aufweisen, und der CTF kann bis zur angegebenen (Ziel-) Auflösung bestimmt werden. Sobald die Filter eingerichtet sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Übernehmen , um nur die ausgewählten Daten im Datensatzübersichtsfenster anzuzeigen.
5. Wenn die meisten der aufgenommenen Bilder innerhalb der festgelegten Kriterien liegen, lassen Sie die Datenerfassungssitzung weiter abgeschlossen sein. Wenn nur ein sehr kleiner Bruchteil der aufgenommenen Bilder die festgelegten Kriterien erfüllt, konfigurieren Sie entweder die Einstellungen der Analysesoftware neu, wechseln Sie in einen anderen Bereich der Probe (drücken Sie die Taste Next Grid Square in der Analysesoftware) oder beenden Sie die Datensammlung.

Ergebnisse

Das Datenmanagement-Portal bietet eine effiziente, strukturierte Speicherung von gesammelten Bildern, Daten und Metadaten aus mehreren experimentellen Workflows in einer einzigen Softwareplattform. Jedes definierte Experiment in einem erstellten Projekt besteht aus einem Workflow mit benutzerdefinierten Schritten zum Erfassen von Beispielinformationen, gesammelten Daten und zugehörigen Metadaten ohne Einschränkungen, um maximale Flexibilität und Benutzerfreundlichkeit für mögliche Experimente und alle Anwendungsfälle zu bieten (Abbildung 1, Abbildung 2). Das Datenmanagement-Portal verfügt auch über eine Lab-Note-Funktionalität zur Veranschaulichung von Workflow-Schritten, einschließlich der Bildverarbeitung mit Zwischenergebnissen, die alle zusammen mit einem Projekt verknüpft werden können und eine möglichst vollständige Aufzeichnung für die Analyse und Erstellung von Berichten und Publikationen bereitstellen.

Abbildung 1: Beispiel für eine mögliche Organisation von Daten und Metadaten in der Datenmanagement-Plattform. Jedes Projekt kann aus mehreren Experimenten bestehen, wie z.B. Kryo-EM oder Massenspektroskopie (d.h. Protokollschritt 2.3). Jedes Experiment kann mehrere benutzerdefinierte Workflows (d. h. Protokollschritt 2.5) umfassen, die jeweils aus mehreren konfigurierbaren Schritten bestehen (d. h. Protokollschritt 2.7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Anzeigen eines geöffneten Projektworkflows in der Datenverwaltungsplattform. Die Abbildung zeigt zugeordnete Metadaten und Notizen zum geöffneten Schritt im Workflow. Die linke Leiste mit Symbolen bietet schnellen Zugriff auf verschiedene Optionen und Menüs der Datenverwaltungsplattform. Der linke Bereich enthält eine Liste der gespeicherten Workflows (es wird nur ein gespeicherter Workflow "Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7" angezeigt) und eine blaue Schaltfläche zum Hinzufügen eines neuen Workflows. Der zentrale Bereich zeigt einzelne Schritte im geöffneten Workflow an, wie es hier für den SPA-Workflow gezeigt wird. Die blaue Schaltfläche oben rechts kann dem geöffneten Workflow einen zusätzlichen Schritt hinzufügen. Das rechte Bedienfeld bietet Platz für aufgezeichnete Metadaten oder benutzerdefinierte Notizen des Workflows, die Text, Tabellen und Bilder enthalten können. Für den Text stehen verschiedene Formatierungsmöglichkeiten zur Verfügung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Kryo-EM-Gitter, die mit herkömmlichen Tauchgefriergeräten wie Vitrobot hergestellt werden, zeigen typischerweise einen Gradienten der Eisdicke über der Gitteroberfläche. Einige Gitter können auch nach manueller Handhabung und/oder Clipping in einen Autogrid-Ringträger beschädigt (gebogen) werden. Abbildung 3 zeigt Beispiele für verschiedene Raster, wie in der Atlas-Übersicht gezeigt. Die Gitter mit dickem Eis oder Schäden sollten von weiteren Untersuchungen ausgeschlossen werden.

Abbildung 3: Galerie verschiedener Gitter, wie in der Atlasübersicht zu sehen . (A) Ein schlechtes Gitter mit dickem Eis, (B) ein gebogenes Gitter mit schlechter Eis- und Eiskontamination, (C) ein akzeptables Gitter mit gutem Eisgradienten, (D) ein typisches Gitter mit gutem dünnem Eis und kleinem Eisgradienten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Auswahl von Gitterquadraten ohne Beschädigung und optimaler Eisdicke ist entscheidend für die Erfassung hochauflösender Datensätze. Die Eisdicke kann auch auf der Ebene einzelner Gitterquadrate variieren, daher ist es wichtig, aus jedem ausgewählten Gitterquadrat nur Löcher mit optimal dünnem Eis auszuwählen. Abbildung 4 zeigt ein passendes Gitterquadrat mit intakter Folie und dünnem Eis in der Mitte. Das gezeigte Gitterquadrat eignet sich gut zum Einstellen eines Filters für die automatisierte Auswahl von Löchern mit dünnem Eis in allen ausgewählten Gitterquadraten, da es einen Bereich unterschiedlicher Eisdicke sowie leere Löcher ohne Eis enthält, was äußerst nützlich ist, um einen geeigneten Intensitätsbereich im Eisfilter in der Aufgabe Lochauswahl einzustellen.

Abbildung 4: Ein Beispiel für ein Gitterquadrat mit einem Gradienten der Eisdicke, aus leeren Gitterquadraten in der Mitte und dickem Eis in der Nähe der Gitterstäbe. Mit dem Filter der Eisqualität kann der Intensitätsbereich innerhalb von Löchern mit der idealen Eisdicke ausgewählt werden, die entsprechend im Gitterquadrat (den Löchern mit grüner Überlagerung) ausgewählt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Benchmark-Ergebnisse unter Verwendung des beschriebenen Protokolls wurden unter Verwendung der Probe von Maus-Apoferritin (apoF) aus der Kikkawa-Gruppe¹¹ erhalten. ApoF ist ein hochgradig α-helikales Protein, das einen sehr stabilen Oktaederkäfig bildet. Die hohe Stabilität und hohe Symmetrie machen apoF zu einer optimalen Probe für hochauflösende Kryo-EM-Bildgebung und Bildverarbeitung. ApoF ist daher zu einer Standardstichprobe für die Bewertung der Leistung von Kryo-EM-Instrumenten^{geworden 11,12,13}. Eine gefrorene aliquot mit 15 mg/ml gereinigter apoF-Probe wurde auf Eis aufgetaut und durch Zentrifugation bei 10.000 x g für 10 min geklärt. Der Überstand wurde auf 5 mg/ml mit 20 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl verdünnt. 3 μL der verdünnten Probe wurden auf ein glühend entladenes R-1.2/1.3, 300 mesh Goldgitter für 30 s aufgetragen. Dann wurden die Gitter für 5 s gesprüht, bevor sie in flüssiges Ethan eingefroren wurden, das durch flüssigen Stickstoff gekühlt wurde. Das Einfrieren wurde mit einem vollautomatischen Verglasungssystem bei 100% Luftfeuchtigkeit und 4 °C durchgeführt. Alle Gitter wurden in Autogrids geclippt und in ein 200 kV Cryo-TEM geladen. Etwa 3000 Filme wurden bei einem Durchsatz von 300 Filmen/h gesammelt. Die Daten wurden mit den Methoden wie^{beschrieben 11} mit den folgenden Modifikationen verarbeitet: i) Relion 4-Beta-Version wurde anstelle von Relion 3.1 verwendet, ii) automatisierte Partikelkommissionierung wurde unter Verwendung von 2D-Klassendurchschnitten früherer apoF-Rekonstruktionen als Referenzen durchgeführt und iii) das anfängliche 3D-Modell wurde aus der vorherigen apoF-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 15 Å generiert. Für diesen Datensatz wurde keine optische Gruppierung durchgeführt, da das verwendete AFIS-Verfahren^{34 nachweislich} effizient und zuverlässig strahlneigungsinduzierte Phasenverschiebungen minimiert, die die Datenqualität nicht einschränken, um 3D-Karten bei den gemeldeten Auflösungen zu rekonstruieren. Die 3D-Verfeinerung nach Bayes'scher Politur und CTF-Verfeinerung führte zu einer Auflösung von 1,68 Å. Die Auflösung wurde mit der Ewald-Kugelkorrektur weiter verbessert, was zu einer Auflösung von 1,63 Å führte. Die Übersicht über die Datenerfassungs- und Verarbeitungsparameter ist in Tabelle 2 dargestellt, und die endgültige rekonstruierte Dichtekarte ist in Abbildung 5 dargestellt, wobei die Fourier-Schalenkorrelationskurve (FSC) in ergänzender Abbildung 8 dargestellt ist.

Tabelle 2: Datenerfassung und Bildverarbeitungsparameter für die 3D-Rekonstruktion von Apoferritin. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 5: Kryo-EM-Rekonstruktion von Apoferritin. (Linkes Feld) 3D-Darstellung der rekonstruierten apoF-Kryo-EM-Karte mit einer Auflösung von 1,6 Å. (Rechtes Feld) Detailansicht der rekonstruierten Karte auf der Ebene einzelner Aminosäure-Seitenketten. Die Dichte der Aminosäure-Seitenketten ist gut aufgelöst, und das Atommodell kann innerhalb dieser Karte eindeutig aufgebaut werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Auswirkungen und Vorteile der Verwendung eines Energiefilters in den SPA-Rekonstruktionen wurden mit dem prokaryotischen 20S-Proteasom untersucht, das aus T. acidophilum isoliert wurde. Das prokaryotische 20S-Proteasom wurde auch als Standard-Kryo-EM-Probe verwendet, da es den stabilen katalytischen Kern des Proteasom-Komplexes mit der D7-Symmetrie darstellt. Die Gitter wurden durch Zugabe von 4,5 μL der gereinigten T. acidophilum 20S-Proteasom-Probe auf ein glühend entladenes 200-Mesh-R2/1-Kupfergitter hergestellt. Die Proben wurden in einem flüssigen Ethan/Propan-Gemisch unter Verwendung eines vollautomatischen Vitrifikationssystems, das auf 4 °C und 100% Luftfeuchtigkeit eingestellt ist, mit einer Blot-Kraft von 20 und einer Blot-Zeit von 4,5 s verglast.

Drei verschiedene Datensätze wurden aus demselben Kryo-EM-Gitter mit ähnlichen Gitterquadraten unter Verwendung einer unterschiedlichen Spaltbreite des Energiefilters in der Reihenfolge gesammelt: i) Spalt vollständig offen (kein Spalt eingefügt), ii) 20 eV Spalt und iii) 10 eV Spalt. Die Auswahl der Gitterquadrate erfolgte über einen Eisqualitätsfilter innerhalb der Analysesoftware. Alle anderen Parameter für die Datenerhebung und Datenverarbeitung wurden gleich gehalten. Die Datensätze wurden für 15 h mit insgesamt 4000 Filmen gesammelt und mit den beschriebenen Methoden^{wie beschrieben 11} mit Relion 3.1 verarbeitet, mit der Modifikation, dass der Laplacian-of-Gauß'sche Partikelpicking-Algorithmus verwendet wurde, um anfängliche 2D-Klassendurchschnitte für die referenzbasierte Partikelauswahl aus den vollständigen Datensätzen zu erstellen. Die gleiche Anzahl (102.200) zufällig ausgewählter Partikel wurde ausgewählt und für die endgültige Iteration und 3D-Rekonstruktion jedes Datensatzes verwendet. Die Datenverarbeitungsvariablen werden in der nachstehenden Tabelle (Tabelle 3) beschrieben, um die endgültige rekonstruierte EM-Dichtekarte in Abbildung 6 mit der in ergänzender Abbildung 9 dargestellten FSC-Kurve zu erreichen. Die optische Gruppierung und die Ewald-Kugelkorrektur wurden für diese Datensätze ebenfalls nicht durchgeführt.

Tabelle 3: Datenerhebungs- und Bildverarbeitungsparameter für die 3D-Rekonstruktion des Proteasoms T. acidophilum 20S. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Zusammenfassung der erreichten Auflösung und des B-Faktors für Kryo-EM-Rekonstruktionen des Proteasoms T. acidophilum 20S unter Verwendung von Datensätzen mit unterschiedlicher Energiespaltbreite. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Abbildung 6: Wirkung der Energiefilterung auf Kryo-EM-Bilder. (A) Kryo-EM-Bilder mit unterschiedlichen Defokussierungswerten, die mit oder ohne 10-eV-Schlitz gesammelt wurden. (B) Überblick über die 20S Proteasom-Kryo-EM-Karte mit segmentierten Untereinheiten. (C) Zoom-Ansicht auf der 20S Proteasom-Karte mit einem angepassten Atommodell. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Kalibrierung von Bildverschiebungen (gelbe Ellipse) zur Ausrichtung von Bildverschiebungen zwischen verschiedenen optischen Voreinstellungen (rote Ellipsen) in der Analysesoftware unter Verwendung eines Kristalls aus sechseckigem Eis, der im vollen Vergrößerungsbereich zwischen 100x und 165.000x sichtbar ist. (Oben) Kalibrierung zwischen den Voreinstellungen "Datenerfassung" und "Bohrung/Euzentrische Höhe", (mittlere) Kalibrierung zwischen den Voreinstellungen "Loch/Euzentrische Höhe" und "Gitterquadrat", (untere) Kalibrierung zwischen den Voreinstellungen "Rasterquadrat" und "Atlas". Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Autostigmate-Funktion in Analysesoftware (gelbe Ellipse). (Linkes Bild) Aufgenommenes Bild. (Rechtes Bild) Fourier-Übertragung des aufgenommenen Bildes, das konzentrische Thon-Ringe und ihre CTF-Passform in radialen Strahlen zeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Benutzeroberfläche der Autocoma-Funktion in der Analysesoftware (gelbe Ellipse) zur Komaausrichtung. Das Bildfeld zeigt Fourier-Transferbilder, die bei verschiedenen Strahlneigungen aufgenommen wurden, und deren CTF-Anpassungen, die zur Berechnung der Koma verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Benutzeroberfläche der Energiefilterabstimmung. Beispiel für einen guten Tuning-Bericht der Energiefilter-Isochromaität mit allen Parametern (in grünem Text dargestellt) innerhalb der Spezifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Benutzeroberfläche der Energiefilterabstimmung. Beispiel für einen guten Tuning-Bericht der Energiefilter-Vergrößerungsverzerrungen mit allen Parametern (in grünem Text dargestellt) innerhalb der Spezifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Benutzeroberfläche der Energiefilterabstimmung. Beispiel für eine gute Abstimmung der chromatischen Verzerrungen des Energiefilters mit allen Parametern (in grünem Text dargestellt) innerhalb der Spezifikationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 7: DataViz-Panel des EPU-Qualitätsmonitors mit einem Überblick über die Datenqualität in einem gesammelten Kryo-EM-Datensatz. Die Diagramme mit aggregierten Daten aus allen gesammelten Bildern/Filmen zeigen Werte (Punktdiagramme) und Verteilung (Balkendiagramme) ausgewählter kritischer Qualitätsindikatoren wie CTF-Fit-Konfidenzniveau (blau), Defokus (orange) und Astigmatismus (grün). Eine Teilmenge der gesammelten Bilder/Filme kann ausgewählt werden, indem Parameterfilter oben im DataViz-Panel festgelegt werden. Nach dem Anwenden der Filter können ausgewählte Bilder/Filme zur weiteren Verarbeitung in ein anderes Bildverarbeitungspaket wie Relion oder CryoSpark exportiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 8: FSC-Kurve der endgültigen Rekonstruktion von apoF auf 1,6 Å Auflösung, wie von Relion 4-beta berichtet. Die blaue Kurve zeigt den FSC maskierter 3D-Karten aus zwei unabhängig voneinander verfeinerten 3D-Rekonstruktionen aus zwei sich gegenseitig ausschließenden Halbdatensätzen. Nach dem Goldstandard FSC bei 0,143 entspricht die Auflösung der endgültigen 3D-Karte, die aus dem vollständigen Datensatz rekonstruiert wurde, 1,6 Å. Die orangefarbene Kurve zeigt den FSC der maskierten 3D-Rekonstruktionen mit randomisierten Phasen. Der schnelle Abfall der FSC-Kurve deutet darauf hin, dass die verwendete Maske nicht über ~2 Å Auflösung hinaus zum beobachteten FSC der ursprünglich rekonstruierten Karten (blaue Kurve) beigetragen hat. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 9: FSC-Kurven der endgültigen Rekonstruktion des Proteasoms T. acidophilum 20S unter Verwendung verschiedener Spaltbreiten des Energiefilters, wie von Relion 3.1 berichtet. Die blauen Kurven zeigen den FSC von maskierten 3D-Karten aus zwei unabhängig voneinander verfeinerten Rekonstruktionen aus zwei Halbdatensätzen jedes Datensatzes. Der Goldstandard-FSC bei 0,143 gibt die erreichten Auflösungen der endgültigen 3D-Karten an, die aus den jeweiligen vollständigen Datensätzen rekonstruiert wurden (2,3 Å, 2,2 Å bzw. 2,1 Å Auflösung). Die roten Kurven zeigen den FSC der maskierten Karten mit randomisierten Phasen. Der schnelle Abfall der roten FSC-Kurven deutet darauf hin, dass die verwendete Maske nicht über die Auflösung von ~3 Å hinaus zum FSC der ursprünglich rekonstruierten Karten beigetragen hat. Die grünen Kurven zeigen den FSC der unmaskierten 3D-Karten, die im gesamten rekonstruierten 3D-Volumen durch Rauschen beeinflusst werden und daher früher fallen als der FSC der maskierten 3D-Karten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Verfügbarkeit der Daten: Die Kryo-EM-Dichtekarten wurden in der EM-Datenbank unter den Beitrittsnummern apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973 hinterlegt. 20S Proteasom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Diskussion

Das beschriebene Protokoll geht davon aus, dass sich die Optik des verwendeten TEM-Mikroskops in einem gut ausgerichteten Zustand befindet. Für das in diesem Protokoll verwendete 200-kV-TEM werden solche Säulenausrichtungen von einem erfahrenen Servicetechniker nach der Installation des Mikroskops oder einem wesentlichen Serviceeingriff durchgeführt, verifiziert und gespeichert. Diese Ausrichtungseinstellungen können jederzeit in der Mikroskop-Benutzeroberfläche abgerufen werden. Benutzer können die Direct Alignment-Verfahren in der Mikroskop-Benutzeroberfläche verwenden, um kritische Parameter erneut zu optimieren. Einige Ausrichtungen, wie z. B. Gun Tilt und Gun Shift, sind stabil und müssen von den Benutzern nicht täglich angepasst werden. Überprüfungen und Neuausrichtungen (falls erforderlich) der Pistolenneigung und -verschiebung durch den Mikroskop-Supervisor werden zweimal im Jahr empfohlen. Auf der anderen Seite sind einige Ausrichtungen kritisch und müssen vor jeder Datenerhebung ausgerichtet werden, wie im obigen Protokoll beschrieben (z. B. objektiver Astigmatismus und komafreie Ausrichtung). Wenn die Autocoma-Funktion in der Analysesoftware nicht konvergiert, sollte die Ausrichtung der Winkelpunkte der Strahlneigung und/oder des Drehzentrums überprüft und angepasst und die korrekte Zentrierung der C2-Blende bestätigt werden. Danach sollte die Autostigmate-Funktion ausgeführt werden, da objektive Stigmatatoren auch zur Komakorrektur verwendet werden. Diese Ausrichtungen sollten iteriert werden, bis sowohl Autostigmate als auch Autocomafunctions bei ihrer ersten Iteration erfolgreich sind. Bei Bedarf kann ein anderer Bereich ausgewählt werden (z. B. Carbonfolie ohne Eis unterstützen), die Bilddefokus angepasst oder die Bildaufnahmezeit erhöht werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis in aufgenommenen Bildern und die Sichtbarkeit mehrerer Thon-Ringe in der Fourier-Transformation der aufgenommenen Bilder zu optimieren.

Moderne Kryo-EM-Mikroskope erzeugen riesige Datenmengen, die oft 1 TB pro Datensatz überschreiten, um hochauflösende 3D-Rekonstruktionen zu erreichen, insbesondere für Proteine mit geringer Symmetrie. Kryo-EM-Daten und -Ergebnisse werden typischerweise auch durch Daten und Ergebnisse aus orthogonalen Methoden ergänzt, um die Struktur-Funktions-Beziehungen in jedem wissenschaftlichen Projekt vollständig zu verstehen. Die Organisation der gesammelten Daten, ihre Übertragung in eine Bildverarbeitungspipeline und die gemeinsame Nutzung einer resultierenden Kryo-EM-Rekonstruktion unter den Mitarbeitern stellen zusätzliche Anforderungen an neue Anwender der Kryo-EM-Methodik, um ihre lokale IT-Infrastruktur einzurichten. Datenverwaltungssoftware wie Athena erleichtert die zentrale Speicherung von Daten, die von einem angeschlossenen Gerät oder einer Software erfasst werden, die von einem registrierten Benutzer betrieben wird. Auf gespeicherte Daten und Metadaten können über eine einfache Webbrowser-Oberfläche mehrere Benutzer zugreifen, die unterschiedliche Rollen im Projekt mit unterschiedlichen Zugriffsrechten (entweder als Eigentümer, Mitarbeiter oder Zuschauer) basierend auf ihren Anmeldeinformationen und der Definition der Datenfreigabe im Testaufbau haben können. Diese Digitalisierung experimenteller Workflows bietet Möglichkeiten für den Daten- und Metadatenaustausch zwischen Mitarbeitern ohne unnötige Duplizierung und erhöht die Produktivität und Rückverfolgbarkeit der verwendeten Workflows. Die Implementierung einer allgemeinen und anpassbaren Struktur von Projekten, Experimenten und Workflows in Datenmanagement-Software ist universell und ermöglicht die Anpassung und Integration orthogonaler Experimente mit komplementären Methoden in eine einzige Projektdatenbank.

Die Auswahl der Bereiche für die Datenerhebung auf einem Kryo-EM-Grid ist entscheidend für die erfolgreiche Erfassung hochauflösender Datensätze. Kryo-EM-Gitter, die mit herkömmlichen Tauchgefriervorrichtungen wie dem Vitrobot (einem vollautomatischen Vitrifikationssystem) hergestellt werden, zeigen typischerweise einen Gradienten der Eisdicke über der Gitteroberfläche (Abbildung 4). Dies kann von Vorteil sein, da das Gitter Bereiche mit unterschiedlichen Eisdicken enthält; Bereiche mit der idealen Eisdicke für die Datenerhebung müssen jedoch wie im obigen Protokoll beschrieben identifiziert werden. Ein optimales Kryo-EM-Gitter sollte so wenig Transfereisverunreinigungen wie möglich enthalten und genügend Gitterquadrate mit intakter löchriger Stützfolie enthalten. Das Sammeln von Daten über Gitterquadrate, die Risse oder gebrochene Bereiche aufweisen, wird nicht empfohlen, da die gesammelten Bilder bei der Beleuchtung durch einen Elektronenstrahl im Vergleich zu den Gitterquadraten mit intakter Stützfolie durch eine deutlich stärkere Gesamtdrift beeinflusst werden. Ein Überschuss an kristallinem Eis kann die Mehrheit der Folienlöcher verschließen und / oder den Autofokus stören, und solche Gitterquadrate sollten ebenfalls vermieden werden. Gitterquadrate mit dünnem Eis weisen normalerweise große Glasflächen und viele helle Folienlöcher auf, die in einem mit der Atlas-Voreinstellung aufgenommenen Bild sichtbar sind. Das Auftreten von dickerem Eis in der Nähe von Gitterstäben ist zu erwarten und unkritisch, da Folienlöcher in diesen Bereichen des Gitterquadrats während des Lochauswahlverfahrens ausgeschlossen sind. Das Vorhandensein mehrerer leerer Löcher in einem Gitterquadrat kann bedeuten, dass Glaseis in den umgebenden Löchern extrem dünn ist und beschädigte Partikel oder gar keine Partikel enthalten kann. Im Allgemeinen ist es ratsam, Gitterquadrate mit einer Vielzahl von Eisdicken in verschiedenen Regionen des Gitters für die Erstabschirmung und -bewertung auszuwählen, um zu verstehen, welche Bereiche die besten Bedingungen für eine hochauflösende Datenerfassung haben und die ideale Partikeldichte und Orientierungsverteilung aufweisen. Für die in dieser Studie verwendeten apoF- und 20S-Proteasom-Proben enthalten Bereiche mit dem dünnsten beobachtbaren Eis die besten Bedingungen für eine hochauflösende Bildgebung dieser Proben.

Wenn Sie mit der Datenerfassungssoftware automatisch Bohrungen in allen ausgewählten Gitterquadraten auswählen, wird empfohlen, die Vorlagenausführungsaufgabe für eine repräsentative Bohrung in jedem Gitterquadrat auszuführen, um zu überprüfen und sicherzustellen, dass weder übermäßig dicke noch zu dünne oder unerwartet nicht glasige Quadrate für die Datenerfassung ausgewählt wurden. Während der Datenerfassung können wichtige Qualitätsindikatoren der gesammelten Bilder, wie Bilddrift und CTF-Anpassung, mit EQM überwacht werden. Die Datenerfassung kann dann optimiert werden, indem Bereiche übersprungen werden, die Bilder von schlechter Qualität liefern. Bilder mit hochauflösenden CTF-Anpassungen können jedoch immer noch Bilder mit Partikeln in einigen bevorzugten Ausrichtungen oder Partikeln, die in einer zu dünnen Eisschicht denaturiert sind, enthalten. Echtzeit-Partikelkommissionierung und 2D-Klassifizierung aus gesammelten Bildern würden zusätzliche Informationen über die Qualität der Strukturdaten in abgebildeten Partikeln liefern und sowohl bevorzugte Orientierungen intakter Partikel in Eis als auch inkonsistente Strukturen von (teilweise) denaturierten Partikeln aufdecken. Die Berechnung von Klassendurchschnitten kann daher dazu beitragen, geeignete Regionen für die Datenerhebung weiter zu verfeinern, wie dies bereits in anderen Softwarepaketen implementiert und gezeigt wurde^23,28.

Die Auswahl der Bildgebungseinstellungen für die Datenerfassung, wie Vergrößerung, Elektronendosisleistung und Defokussierbereich, hängt von mehreren Kriterien ab, wie z.B. der Zielauflösung, der Größe des Proteins, der Probenkonzentration, dem gewünschten Mikroskopdurchsatz usw. Für die in diesen Experimenten verwendete direkte Elektronendetektorkamera wurde die Elektronendosisleistung im Bereich von 4-5 e-/pix/s gewählt, indem eine geeignete SPOT-Größe und ^-Intensität ausgewählt wurde, um eine parallele Beleuchtung aufrechtzuerhalten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, kann in der Voreinstellung Bohrung/Euzentrische Höhe eine andere SPOT-Größe verwendet werden, um ein ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis im Bild für die Zentrierung von Bohrungen während der Datenerfassung sicherzustellen. Die Vergrößerung sollte so gewählt werden, dass die Pixelgröße mindestens 2-3x kleiner ist als die Zielauflösung für die Kryo-EM-Rekonstruktion. Es wird jedoch die höhere Vergrößerung (d.h. kleinere Pixelgröße) verwendet, das kleinere Sichtfeld wird in Bildern erfasst und es gibt weniger Partikel pro Bild, was letztendlich zu einer längeren Datenerfassungszeit führt, um Bilder mit genügend Partikeln zu sammeln, um 3D-Karten mit einer hohen Auflösung zu rekonstruieren. Für die apoF-Probe verwendeten wir die Pixelgröße von 0,43 Å, da wir eine ausreichende Probenkonzentration für eine hohe Partikeldichte in Bildern hatten und eine Auflösung von Sub-2 Å der Rekonstruktion anstrebten. Für das 20S-Proteasom-Sample haben wir die Pixelgröße von 0,68 Å verwendet, um ein größeres Sichtfeld in aufgenommenen Bildern abzudecken. Typischerweise werden für 200-kV-TEM-Mikroskope Kryo-EM-Bilder im Defokusbereich von 0,8 bis 2,0 μm aufgenommen. Mit dem verbesserten Kontrast- und Signal-Rausch-Verhältnis unter Verwendung des Energiefilters können Datenaufnahmen jedoch viel näher am Fokus durchgeführt werden, um hochauflösende Informationen in aufgenommenen Bildern aufgrund kleinerer Aberrationen und entsprechend reduziertem Zerfall der CTF-Hüllkurvenfunktion besser zu erhalten. Wir verwenden auch keine objektive Blende, da die Blende zusätzliche Bildaberrationen verursachen kann, während der Bildkontrast durch die Verwendung des Energiefilters bereits ausreichend verbessert wird. Für die apoF- und 20S-Proteasom-Proben verwendeten wir die Defokus-Einstellungen von 0,5 μm, 0,7 μm und 0,9 μm. Für kleinere Proteine (<200 kDa) verwendeten wir Defokussierungseinstellungen von -0,5 μm, -0,7 μm und -0,9 μm, um den Kontrast von Partikeln zu verbessern und eine einfachere Partikelkommissionierung und anfängliche grobe Ausrichtung im 3D-Verfeinerungsschritt der 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen, was zu 3D-Karten mit einer Auflösung von ~ 2,5 Å führte (unveröffentlichte Ergebnisse).

Wir haben bereits gezeigt, dass die Bildgebung mit einem Energiefilter das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) in Kryo-EM-Bildern verbessert, die mit den High-End-300-kV-TEM-Mikroskopen¹¹ gesammelt wurden. In der Tat, wenn Elektronen durch eine Probe gehen, treten zwei Hauptarten von Wechselwirkungen auf: i) Elastisch gestreute Elektronen behalten ihre Energie bei und tragen zur Bildbildung bei, indem sie den nicht gestreuten einfallenden Strahl über den Phasenkontrastmechanismus stören ii) inelastisch gestreute Elektronen verlieren etwas Energie in der Probe und tragen hauptsächlich zum Rauschen in Bildern bei. Daher kann SNR deutlich verbessert werden, indem die inelastisch gestreuten Elektronen, die eine geringere Energie als der einfallende Strahl und elastisch gestreute Elektronen haben, mit einem schmalen Energiespalt gefiltert werden. Es ist jedoch wichtig, einen ausreichend stabilen Energiefilter wie den Selectris oder Selectris-X zu verwenden, um sehr schmale (10 eV oder kleinere) Schlitze über lange (12+ Stunden) automatisierte Datenerfassung von hochauflösenden KryoEM-Datensätzen verwenden zu können.

Kryo-EM-Bilder, die mit 200-kV-TEM-Mikroskopen unter den gleichen Bedingungen wie mit 300-kV-TEM-Mikroskopen aufgenommen wurden, zeigen aufgrund des schnelleren Abfalls der CTF-Hüllkurvenfunktionen ein kleineres SNR bei hoher Auflösung (insbesondere <4 Å). Folglich ist eine höhere Anzahl von Partikeln (und damit eine höhere Anzahl gesammelter Bilder) erforderlich, um bei Verwendung von 200-kV-TEMs eine bestimmte Auflösung zu erreichen. Darüber hinaus ist die Schärfentiefe (10-25 nm im Auflösungsbereich von 2-3 Å) in 200-kV-Bildern³⁵ auch etwa 20% kleiner, was bedeutet, dass weniger Partikel in der Eisschicht (typischerweise 20-50 nm dick) vollständig im Fokus sind und konstruktiv zu allen hochauflösenden Merkmalen einer berechneten 3D-Rekonstruktion beitragen, es sei denn, die Defokussierungswerte werden für jedes Partikel unabhängig voneinander in den späteren Phasen des 3D-Rekonstruktionsverfahrens verfeinert. Bei größeren Partikeln (wie ikosaedrischen Virionen oder anderen makromolekularen Anordnungen) kann die Partikelgröße die Schärfentiefe bei hohen Auflösungen überschreiten und Phasenfehler aufgrund der planaren Annäherung der Ewald-Kugel in den Standard-3D-Rekonstruktionsalgorithmen³⁶ verursachen. Diese Fehler können durch fortschrittliche Algorithmen verfeinert werden, die bereits in gängigen Kryo-EM-Bildverarbeitungspaketen^37,28,39 implementiert sind. Da die Ewald-Kugel bei 200-kV-Daten eine größere Krümmung aufweist als bei 300-kV-Daten, ist die Ewald-Kugelkorrektur bei relativ niedrigeren Auflösungen und/oder für relativ kleinere makromolekulare Anordnungen bei Verwendung von 200-kV-TEMs erforderlich. Auf der anderen Seite zeigen 200-kV-Bilder einen höheren Kontrast von Partikeln in dünnem Eis (20-50 nm), der deutlich dünner ist als der mittlere freie Weg von 200-300 keV Elektronen (220-280 nm). Der höhere Kontrast hilft, die korrekte globale Ausrichtung einzelner Partikel zu verbessern, insbesondere bei schwach streuenden kleineren Proteinen, deren Struktur noch nicht bekannt ist, und das 3D-Referenzmodell ist noch nicht gut etabliert.

Hier haben wir am Beispiel eines 20S-Proteasoms gezeigt, dass Bildkontrast und -qualität mit einem Energiefilter bei Verwendung eines 200-kV-TEM-Mikroskops ähnlich verbessert werden können. Unter Verwendung der gleichen Anzahl von Partikeln wurden die mit dem 20-eV-Spalt gesammelten Daten auf eine Auflösung von 2,26 Å rekonstruiert, verglichen mit Daten, die mit dem vollständig geöffneten Energiespalt gesammelt wurden, der nur mit einer Auflösung von 2,34 Å rekonstruiert wurde. Die beste Rekonstruktion wurde aus Daten erzielt, die mit dem 10-eV-Spalt gesammelt wurden, der auf eine Auflösung von 2,14 Å rekonstruiert wurde. Diese Ergebnisse stimmen mit der theoretischen Vorhersage überein, dass die Filterung der inelastisch gestreuten Elektronen das SNR in gesammelten Bildern erhöht und eine höhere Auflösung bei Kryo-EM-Rekonstruktionen aus der gegebenen Anzahl von Teilchen ermöglicht, wie in Tabelle 4 zusammengefasst. Diese Ergebnisse wurden durch die aus diesen Datensätzen berechneten B-Faktoren bestätigt, die auf eine höhere Qualität der Bilder in den energiegefilterten Datensätzen hinweisen.

Wir können daher zu dem Schluss kommen, dass 300-kV-TEM-Mikroskope den höchsten Durchsatz und die höchstmögliche Auflösung bei Kryo-EM-Rekonstruktionen liefern, während die 200-kV-TEM-Mikroskope auch qualitativ hochwertige Datensätze für hochauflösende Kryo-EM-Rekonstruktionen liefern. Wir haben hier gezeigt, dass die Qualität der aufgenommenen Bilder und damit die Gesamtzeit bis zur Struktur durch den Einsatz des 200-kV-TEM, das mit einem Energiefilter und einem direkten Elektronendetektor ausgestattet ist, weiter verbessert werden kann. Das vorgestellte Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, wie mit diesem Setup routinemäßig hochauflösende Kryo-EM-Daten erhalten werden können, und enthüllt feine strukturelle Details makromolekularer 3D-Strukturen, die für das Verständnis der wichtigsten Struktur-Funktions-Beziehungen in der Strukturbiologie und im strukturbasierten Arzneimitteldesign unerlässlich sind.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
AutoGrid-Ringe	Thermo Fisher Scientific	1036173	Packung mit 100x AutoGrid-Ringen für die Standard-EM-Gitter
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Packung mit 100 Clips, die die Standard-EM-Gitter in den AutoGrid-Ringen sichern
Datenmanagement-Plattform	Thermo Fisher Scientific	1160939	Teil der Glacios-Basiskonfiguration; umfasst Athena Software
EPU Quality Monitor	, Thermo Fisher	Scientific 1179770
EPU Software	Thermo Fisher Scientific	1025080	Teil der Glacios-Basiskonfiguration
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	Ethan wird zur Herstellung von flüssigem Ethan verwendet (Reinheit mindestens N35, d.h. 99,95 % vol)
Falcon 4 200kV	Thermo Fisher Scientific	1166936	Direkter Elektronendetektor
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 kV TEM
GloQube Plus Glimmentladungssystem für TEM Gitter und Oberflächenmodifikation	Quorum	N/A	auch über Thermo Fisher Scientific erhältlich (PN 1160602)
QuantiFoil Gitter	Quantifoil N	/A	R-2/1, 300 mesh; Carbon Foliengitter
Relion	MRC Laboratory of Molecular	Biology N/A	Open Source Software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris mit Falcon 4 für 200	kV Thermo Fisher Scientific	1191753	Energy Filter
Selectris X mit Falcon 4 für 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191755	Energy Filter
UltrAuFoil Gitter	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, 300 mesh; Gitter aus Goldfolie
Vitrobot Mk. IV	Thermo Fisher Scientific	1086439	Automatisiertes Verglasungssystem
Whatman 595 Filterpapier	Thermo Fisher Scientific	AA00420S