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Methodenartikel

Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226

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DOI:

10.3791/63525

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10. Mai 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Otolaryngological Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3Orthopedic Department of Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, 4Department of Immunology, Fourth Military Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die an Typ-2-Entzündungen beteiligt sind, sind hauptsächlich an der Reaktion auf Helmintheninfektionen, allergische Erkrankungen, metabolische Homöostase und Gewebereparatur beteiligt. In dieser Arbeit wird ein Verfahren zur Isolierung von ILC2s aus der murinen Nasenschleimhaut und zum Nachweis der Expression von CD226 demonstriert.

Zusammenfassung

Mit zahlreichen Forschungsarbeiten zu angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 (ILC2), die im Laufe der Jahre veröffentlicht wurden, ist weithin bekannt, dass ILC2 an der Regulierung verschiedener pathologischer Prozesse beteiligt ist, darunter Anti-Helminthen-Immunität, Gewebereparatur, Thermogenese und Autoimmunerkrankungen wie Asthma und allergische Rhinitis (AR). ILC2 befinden sich dauerhaft in peripheren Geweben wie Haut, Darm, Lunge und Nasenhöhle. Es gibt jedoch nur begrenzte Informationen über ihre genaue Funktion in der Immunität der Nasenschleimhaut. CD226 ist ein aktivierendes kostimulatorisches Molekül, das hauptsächlich auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen und entzündlichen Monozyten exprimiert wird. Es ist jedoch nicht bekannt, ob ILC2 CD226 exprimieren oder eine Rolle in der Pathogenese von ILC2s-assoziierten Erkrankungen spielen. In dieser Arbeit etablierten wir eine Methode zur Isolierung und Identifizierung von ILC2 aus der Nasenschleimhaut und wiesen die CD226-Expression auf ILC2 von gesunden und AR-Mäusen nach. In dieser Arbeit beschreiben wir dieses Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von ILC2s aus der Nasenschleimhaut von Mäusen, das dazu beitragen wird, den internen pathologischen Mechanismus immunologischer Erkrankungen bei Erkrankungen der Nasenschleimhaut zu erforschen.

Einleitung

Angeborene lymphatische Zellen der Gruppe 2 (ILC2) wurden zuerst im Gewebe der Peritonealhöhle von Mäusen entdeckt und später im Blut und anderen peripheren Geweben wie Lunge, Haut und Nasenhöhle nachgewiesen 1,2,3. Als geweberesidente Zellen werden ILC2s hauptsächlich lokal aufrechterhalten und vermehrt und fungieren als erste Wächter, die auf exogene schädliche Reize reagieren, indem sie zahlreiche Typ-2-Zytokine produzieren und Typ-2-Immunität induzieren 4,5,6. ILC2 können ihre Wirkung auch entfalten, indem sie in das infizierte Gewebe eindringen 7,8.

Ähnlich wie bei T-Helfer-2-Zellen (Th2) sorgen die komplizierten regulatorischen Netzwerke von ILC2 dafür, dass sie maßgeblich am Fortschreiten verschiedener entzündlicher Typ-2-Erkrankungen, einschließlich allergischer Atemwegserkrankungen, beteiligt sind 8,9. Bei Asthma können aus Epithelzellen stammende Alarmine ILC2s aktivieren, die durch die Sekretion von Interleukin (IL)-4, IL-5 und IL-13 die Lungenentzündung weiter fördern10. Klinische Studien haben auch gezeigt, dass die ILC2-Spiegel im Sputum und im Blut von Patienten mit schwerem Asthma signifikant erhöht waren, was auf einen Zusammenhang von ILC2 mit dem Schweregrad des Asthmas und ihrer Funktion als Prädiktor für das Fortschreiten des Asthmas hindeutet11.

Allergische Rhinitis (AR) ist eine häufige chronisch-entzündliche Erkrankung, von der jährlich Millionen von Menschen betroffen sind, und wirksame Behandlungen für diese Krankheit sindbegrenzt 12,13. ILC2 spielen eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der AR, sei es in der Sensibilisierungsphase oder in der Symptomentstehung und Entzündungsphase14. Bei Patienten mit AR wurde berichtet, dass die ILC2-Spiegel im peripheren Blut sowohl lokal als auch systemisch erhöht sind15. Bestimmte Effekte und die zugrunde liegenden Mechanismen von ILC2 auf die Pathophysiologie und Progression von AR müssen jedoch noch weiter erforscht werden.

CD226 - ein Transmembranglykoprotein, das als kostimulatorisches Molekül dient - wird hauptsächlich auf natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), T-Zellen und anderen entzündlichen Monozyten exprimiert16,17. Die Interaktion von CD226 mit seinen Liganden (CD155 und/oder CD112) oder Konkurrenten (TIGIT) ermöglicht es ihm, an den biologischen Funktionen verschiedener Immunzellen teilzunehmen18. Die Bindung der Liganden auf antigenpräsentierenden Zellen an CD226 auf zytotoxischen Lymphozyten (CTL) fördert die gleichzeitige Aktivierung beider Zellen, während die Aktivierung von CTL durch TIGIT (T-Zell-Immunrezeptor mit Ig- und ITIM-Domänen), dem Konkurrenten von CD226, weiter unterdrücktwerden kann 19,20. Eine humane ex vivo Studie zeigte, dass CD226 und CD155 auf T-Zellen das Gleichgewicht zwischen Th1/Th17 und Th2 durch differentielle Modulation von Th-Subpopulationenregulieren 21. CD226 kann ebenfalls die Thrombozytenadhäsion und die NK-tumorabtötende Aktivität vermitteln22,23. Inzwischen ist CD226 in der Pathogenese verschiedener Infektionskrankheiten, Autoimmunerkrankungen und Tumoren gut untersucht 18,24,25. CD226 hat sich derzeit zu einem neuen Lichtblick für die Immuntherapie entwickelt. Studien haben gezeigt, dass extrazelluläre Vesikel die CD226-Expression auf NK-Zellen umkehren können, um ihre zytotoxische Aktivität wiederherzustellen und in das Fortschreiten von Lungenkrebs einzugreifen26. Eine kürzlich durchgeführte Studie hat durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung27 eine Untergruppe von fetalen intestinalen ILCs der Gruppe 3 aufgedeckt, die durch eine hohe CD226-Expression gekennzeichnet sind, was darauf hindeutet, dass CD226 eine Rolle in der angeborenen lymphatischen Zell-vermittelten Immunität spielen könnte.

Unser Wissen über ILC2 bei Atemwegsentzündungen basiert in erster Linie auf Studien zu Asthma; Über ihre Funktionen bei der Immunität der Nasenschleimhaut ist jedoch wenig bekannt. Daher wurde ein Protokoll zur Isolierung und Identifizierung von ILC2 aus der Nasenschleimhaut etabliert. Die Studie konzentriert sich auf die Expression von CD226 auf ILC2s im Nasengewebe und seine Variation zwischen gesunden und AR-Mäusen. Dies könnte neue Einblicke in die zugrunde liegenden Mechanismen der ILC2-vermittelten Regulation in der lokalen Immunität liefern und als Grundlage für die Entwicklung neuer Ansätze für die AR-Behandlung dienen.

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Protokoll

Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Alle Verfahren und Protokolle wurden von der Ethikkommission für wissenschaftliche Forschung der Vierten Militärmedizinischen Universität (Nr. 20211008) genehmigt.

1. Etablierung des murinen AR-Modells

  1. Unterbringe männliche und weibliche Wildtyp-Mäuse (WT) C57BL/6 im Alter von 8-12 Wochen unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen und stelle Standard-Laborfutter und Wasser zur Verfügung.
  2. Emulgieren Sie 50 μg Ovalbumin (OVA) in 0,2 ml sterilem PBS, das 2 mg Aluminiumhydroxid enthält, auf einer sauberen Bank, um die Sterilität aufrechtzuerhalten. An den Tagen 0, 7 und 14 werden weiblichen oder männlichen Mäusen jeweils 50 μg emulgierte OVA intraperitoneal injiziert.
  3. An den Tagen 21, 22, 23, 24 und 25 wurden Mäuse mit 50 μg OVA, gelöst in 30 μl sterilem PBS (15 μl pro Nasenloch) unter Inhalationsanästhesie (2-3 % Isofluran mit einer Sauerstoffflussrate oder 0,5 l/min) intranasal instilliert.
  4. Euthanasieren Sie die Mäuse 24 Stunden nach der letzten Herausforderung (Tag 26).

2. Isolierung von mononukleären Zellen (MNCs) aus der Nasenschleimhaut

  1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch Zervixluxation unter tiefer Betäubung. Weichen Sie die Mäuse 5 Minuten lang mit 75%igem Ethanol ein und vermeiden Sie, dass Ethanol in das äußere Nasenloch gelangt. Legen Sie den Bauch nach unten auf den Operationstisch.
  2. Schneiden Sie die Vorderzähne ab. Machen Sie an der Mittellinie des Kopfes einen Schnitt und schneiden Sie die Haut mit einer Schere auf.
  3. Entfernen Sie den Unterkiefer, schneiden Sie die gesamte Nase am Ende des Gaumens ab und legen Sie das Gewebe in eine 60-mm-Petrischale mit 5 ml eiskaltem PBS. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette das Fleisch und die Muskeln, die an den Knochen haften.
  4. Setzen Sie die Mausnase in eine neue 60-mm-Petrischale mit 5 ml eiskaltem PBS um. Waschen Sie die Knochen zweimal mit 5 ml eiskaltem PBS.
  5. Übertragen Sie die Nase in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  6. Die Nase wird ausreichend zerschlagen und in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml vorgewärmtem Aufschlusspuffer (RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 1 mg/ml Kollagenase i.v. und 10 U/ml DNase I) überführt.
  7. Befestigen Sie den Deckel und legen Sie das Röhrchen senkrecht in einen Orbitalschüttler bei 37 °C, mit kontinuierlichem Rühren bei 120-150 U/min für 40 Minuten.
    HINWEIS: Erwärmen Sie den Aufschlusspuffer auf 37 °C, um die höchste Enzymaktivität zu erreichen.
  8. Fügen Sie 5 ml eiskaltes RPMI 1640-Medium hinzu, das 10 % fötales Kälberserum (FBS) enthält, um den Verdauungsprozess zu stoppen.
  9. Filtern Sie durch ein 70-μm-Zellsieb, um feste Fragmente zu entfernen.
  10. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 500 x g und entsorgen Sie dann vorsichtig den Überstand.
  11. Das Pellet in eiskaltem RPMI 1640 medium resuspendieren und 5 min bei 500 x g zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 4 ml 40%igem Gradientenmedium (160 μl 10x PBS + 1,44 ml Dichtegradientenmedien-Stammlösung + 2,4 ml RPMI 1640-Medium).
  13. Führen Sie vorsichtig eine Pasteurpipette in den Boden des Röhrchens ein und fügen Sie langsam 2,5 ml Gradientenmedien mit 80 % Dichte hinzu (200 μl 10x PBS + 1,8 ml Dichtegradientenmedien-Stammlösung + 0,5 ml RPMI 1640-Medium).
  14. Stellen Sie die Beschleunigungs- und Verzögerungsrate der Zentrifuge niedriger als den dritten Gang ein und zentrifugieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei 400 x g .
  15. Entfernen Sie die oberste Schicht von Verunreinigungen, bevor Sie die Zellen an der Grenzfläche entleeren, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Die Schicht der mononukleären Zellen (MNCs) an der Grenzfläche des Dichtegradientenmediums mit 40 %/80 % wird vorsichtig mit einer Pipette in ein 15-ml-Röhrchen mit 2 ml eiskaltem PBS entleert. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.

3. Oberflächenfärbung für die FCM-Analyse

  1. Die Zellen entnehmen und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Das Zellpellet wird in Färbepuffer (PBS ergänzt mit 2 % FBS und 0,1 %NaN3) resuspendiert und bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand.
    ACHTUNG: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie den Färbepuffer vorbereiten. NaN3 ist sehr giftig und kann Organe schädigen, wenn es verschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Vermeiden Sie auch die Freisetzung in die Umwelt.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 80 μL Blockierlösung (Anti-CD16/32-Antikörper (1:100) verdünnt in Färbepuffer) pro Röhrchen. 30 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
  3. Ohne Waschen 20 μl der entsprechenden Verdünnung des oberflächenfärbenden Antikörpercocktails zugeben (Tabelle 1).
  4. Fügen Sie 1 μl (pro Test) des fixierbaren Viabilitätsfarbstoffs 520 (FVD) hinzu, kurz bevor Sie den Antikörpercocktail zu den Proben geben. Im Dunkeln bei 4 °C für 30 min inkubieren. Legen Sie passende Isotyp-Antikörper und Fluoreszenz-Minus-Eins (FMO) als Negativkontrollen fest.
  5. Waschen Sie die Zellen in 500 μl Färbepuffer, indem Sie sie 5 Minuten lang bei 4 °C bei 500 x g zentrifugieren.
  6. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Färbepuffer. Geben Sie 50 μl vortexed absolute Zählkügelchen zu den gefärbten Zellen und rühren Sie um. Unterziehen Sie sie einer Durchflusszytometrie (FCM).
    HINWEIS: Die FCM-Daten wurden mit einem spektralen Zellanalysator ermittelt und mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (FCM) analysiert.

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Ergebnisse

Ein OVA-induziertes Mausmodell wurde entwickelt, um die Rolle von ILC2s in AR zu untersuchen. Die Konstruktion des AR-Mausmodells basierte auf früheren Studien mit leichten Modifikationen 28,29,30,31. Ein 10-minütiges Video wurde aufgenommen, um die Häufigkeit des Niesens und des Nasenkratzens nach der letzten nasalen Herausforderung zu messen. Die allergischen Symptome der OVA-induzierten AR-M...

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Diskussion

ILC2 stehen in engem Zusammenhang mit Typ-2-Entzündungen und entzündlichen Erkrankungen, wie eine zunehmende Zahl von Studien zeigt. Sowohl Mausmodelle als auch menschliche Beobachtungen tragen zu einem besseren Verständnis seiner Funktion in den oberen Atemwegen bei. In der Pathophysiologie des Asthmas werden ILC2s durch Thymusstroma-Lymphopoietin, IL-25 und IL-33 aktiviert, die hauptsächlich von Epithelzellen produziert werden. Umgekehrt produzieren ILC2s ILC2 IL-4, IL-5 und IL-13, um die Typ-2-Entzündung zu verschlimm...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

R.Z. wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81871258) und Mitteln der Fourth Military Medical University (Nr. 2020rcfczr) unterstützt. Y.Z. wurde durch das Natural Science Basic Research Program von Shaanxi (Nr. 2021JM-081) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AluminiumhydroxidMeilun biologische Technologie21645-51-2
CD11beBioscience11-0112-82Wird in Antikörper-Cocktail
CD11cBioLegend117306Verwendet in Antikörper-Cocktail
CD16/32BioLegend101302Klon: 93; Verdünnung 1:100
CD226BioLegend128812Wird in Antikörper-Cocktail
CD3everwendet BioLegend100306Wird in Antikörper-Cocktail
CD45BioLegend103128Wird in Antikörper-Cocktail
CD45ReBioscience11-0452-82Wird in Antikörper-Cocktail
CD90.2BD Pharmingen553014verwendet in Antikörpern Coctail
Collagenase IVDIYIBioDY40128
CountBright absolute ZählperlenInvitrogenC36950absolute Zählperlen
Dnase figure-materials-1BeyotimeD7076
Fetales Rinderserumgibco10270-106
Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff eFluor 520 (FITC)eBioscience65-0867-14FVD
HBSS, Calcium, MagnesiumServicebioG4204-500
KLRG1eBioscience17-5893-81Wird in Antikörper-Cocktail
NaN3SIGMAS2002
NovoExpress SoftwareAgilentTechnologiesVersion 1.5.0Durchflusszytometrie (FCM) Analysesoftware
OVASIGMA9006-59-1
PBS, 1xServicebioG4202-500
PBS, 10xServicebioG4207-500
PercollYeasen40501ES60Dichte Gradientenmedien
RPMI 1640 NährmedienCorning10-040-CVRV
Spektraler ZellanalysatorSONY SA3800
verwendet

Referenzen

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CD226-ExpressionAllergische RhinitisDurchflusszytometrieZellisolationDichtegradientOberflächenantigen-Färbungmononukleäre ZellenMausmodell
Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe 2 aus der Nasenschleimhaut der Maus zum Nachweis der Expression von CD226
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