Ein chirurgisches Modell der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion bei tibetischen Minischweinen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein schrittweises Verfahren zur Etablierung eines Minipig-Modells der Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion unter Verwendung absteigender Aortenkonstriktion. Die Methoden zur Beurteilung der Herzmorphologie, Histologie und Funktion dieses Krankheitsmodells werden ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Mehr als die Hälfte der Fälle von Herzinsuffizienz (HF) werden weltweit als Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) klassifiziert. Großtiermodelle sind nur begrenzt geeignet, um die grundlegenden Mechanismen der HFpEF zu untersuchen und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Diese Arbeit bietet eine detaillierte Beschreibung des chirurgischen Vorgehens der absteigenden Aortenkonstriktion (DAC) bei tibetischen Minischweinen, um ein Großtiermodell der HFpEF zu etablieren. Dieses Modell nutzte eine präzise kontrollierte Verengung der absteigenden Aorta, um eine chronische Drucküberlastung in der linken Herzkammer zu induzieren. Mittels Echokardiographie wurden die morphologischen und funktionellen Veränderungen des Herzens beurteilt. Nach 12 Wochen DAC-Stress war das Ventrikelseptum hypertroph, aber die Dicke der Hinterwand war signifikant reduziert, begleitet von einer Dilatation des linken Ventrikels. Die LV-Ejektionsfraktion der Modellherzen wurde jedoch während des 12-wöchigen Zeitraums bei >50 % gehalten. Darüber hinaus zeigte das DAC-Modell Herzschäden, einschließlich Fibrose, Entzündung und Kardiomyozytenhypertrophie. Die Markerwerte für Herzinsuffizienz waren in der DAC-Gruppe signifikant erhöht. Diese DAC-induzierte HFpEF bei Minischweinen ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung molekularer Mechanismen dieser Krankheit und für präklinische Tests.

Einleitung

Herzinsuffizienz mit erhaltener Ejektionsfraktion (HFpEF) macht mehr als die Hälfte der Herzinsuffizienzfälle aus und ist zu einem^{weltweiten Problem der} öffentlichen Gesundheit geworden1. Klinische Beobachtungen haben auf mehrere kritische Merkmale der HFpEF hingewiesen: (1) ventrikuläre diastolische Dysfunktion, begleitet von erhöhter systolischer Steifigkeit, (2) normale Ejektionsfraktion in Ruhe mit beeinträchtigter Trainingsleistung und (3) kardiales Remodeling². Zu den vorgeschlagenen Mechanismen gehören hormonelle Dysregulation, systemische mikrovaskuläre Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Anomalien in sarkomeren und extrazellulären Matrixproteinen³. Experimentelle Studien haben jedoch gezeigt, dass eine Herzinsuffizienz mit reduzierter Ejektionsfraktion (HFrEF) diese Veränderungen verursacht. Klinische Studien haben die therapeutischen Wirkungen von Angiotensinrezeptor-Inhibitoren und Medikamenten zur Behandlung von HFrEF bei HFpEF ^4,5 untersucht. Es sind jedoch einzigartige Therapieansätze für HFpEF erforderlich. Verglichen mit dem Verständnis der klinischen Symptome sind die Veränderungen in der Pathologie, Biochemie und Molekularbiologie der HFpEF nach wie vor schlecht definiert.

Tiermodelle der HFpEF wurden entwickelt, um die Mechanismen, diagnostischen Marker und therapeutischen Ansätze zu erforschen. Labortiere, einschließlich Schweine, Hunde, Ratten und Mäuse, können HFpEF entwickeln, und verschiedene Risikofaktoren, einschließlich Bluthochdruck, Diabetes mellitus und Alterung, wurden als Induktionsfaktoren ausgewählt ^6,7. Zum Beispiel induziert Desoxycorticosteronacetat allein oder in Kombination mit einer fett-/zuckerreichen Ernährung HFpEF bei Schweinen ^8,9. Die ventrikuläre Drucküberlastung ist eine weitere Technik, die zur Entwicklung von HFpEF in Groß- und Kleintiermodellen verwendet wird¹⁰. Darüber hinaus wurden in den letzten Jahren auf allen Kontinenten spezifische EF-Cut-off-Werte zur Definition von HFpEF eingeführt, wie in den Leitlinien der European Society of Cardiology, der American College of Cardiology Foundation/American Heart Association¹¹, der Japanese Circulation Society/der Japanese Heart Failure Society¹² zu sehen ist. Daher können viele bereits etablierte Modelle für HFpEF-Studien geeignet werden, wenn die klinischen Kriterien übernommen werden. Youselfi et al. behaupteten beispielsweise, dass ein genetisch veränderter Mausstamm, Col4a3-/-, ein wirksames HFpEF-Modell sei. Dieser Stamm entwickelte typische HFpEF-Herzsymptome, wie diastolische Dysfunktion, mitochondriale Dysfunktion und kardiales Remodeling¹³. In einer früheren Studie wurde eine energiereiche Diät verwendet, um bei Affen im Alter von¹⁴ Jahren einen kardialen Umbau mit einem mittleren EF-Bereich zu induzieren, der durch eine Stoffwechselstörung, Fibrose und reduzierte Aktomyosin-MgATPase im Myokard gekennzeichnet ist. Die transversale Aortenkonstriktion (TAC) der Maus ist eines der am weitesten verbreiteten Modelle zur Nachahmung der Hypertonie-induzierten ventrikulären Kardiomyopathie. Der linke Ventrikel verläuft von einer konzentrischen Hypertrophie mit erhöhter EF zu einem dilatativen Remodeling mit reduzierter EF^15,16. Die Übergangsphänotypen zwischen diesen beiden typischen Stadien deuten darauf hin, dass die Aortenkonstriktionstechnik zur Untersuchung der HFpEF verwendet werden kann.

Die pathologischen Merkmale, die zelluläre Signalübertragung und die mRNA-Profile eines porcinen HFpEF-Modells wurden bereits veröffentlicht¹⁷. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Etablierung dieses Modells und die Ansätze zur Bewertung der Phänotypen dieses Modells vorgestellt. Das Verfahren ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, der Operationsplan wurde gemeinsam vom leitenden Prüfarzt, Chirurgen, Labortechnikern und Tierpflegern erstellt. Die Minischweine wurden Gesundheitsuntersuchungen unterzogen, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Nach der Operation wurden entzündungshemmende und schmerzstillende Eingriffe durchgeführt. Zur Beurteilung der Phänotypen wurden Echokardiographie, histologische Untersuchung und Biomarker eingesetzt.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute genehmigt (Zulassungs-Nr. IACUC2017009). Alle Tierversuche wurden nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Aufl., 2011, The National Academies, USA) durchgeführt. Die Tiere wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung des Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute untergebracht (Lizenz-Nr. SYXK (YUE) 2016-0122, China). Sechs männliche tibetische Minischweine (n = je 3 für die Scheingruppe und die DAC-Gruppe, 25-30 kg Gewicht) wurden verwendet, um das HFpEF-Modell zu entwickeln.

1. Vorbereitung von Tieren und Instrumenten

1. Akklimatisieren Sie die Tiere vor der Operation 14 Tage lang in der Einrichtung.
2. Führen Sie vor der Operation Gesundheitsuntersuchungen durch, einschließlich biochemischer Tests und Echokardiographie. Schließen Sie die Tiere mit kardialen Anomalien in der Struktur (Ventrikeldilatation oder Hypertrophie) und Funktion (EF <50%) gemäß den T/CALAS85-2020 Laboratory animals - Guidelines for the health assessment of major organs, like heart, liver, kidney, and brain of large laboratory animals (Chinese Association for Laboratory Animal Sciences, China) aus.
3. Fasten Sie die Tiere mehr als 12 Stunden vor der Narkose, indem Sie am Tag der Operation nicht füttern.
4. Bereiten Sie den Operationssaal und die Geräte vor (Abbildung 2). Überprüfen Sie die Beatmungsstation, die Veterinär- und Patientenmonitore, das veterinärmedizinische Ultraschallsystem, den Aspirator und andere chirurgische Geräte. Autoklavieren Sie die Schere, die Pinzette, die Retraktoren, die Skalpellgriffe, den Absaugkopf, die chirurgischen Nadeln usw. (siehe Materialtabelle).

2. Sedierung, tracheale Intubation und Venenkanülierung

1. Wiegen Sie die Tiere und berechnen Sie die Narkosemittel. Die Minischweine werden mit 1 mg/kg Zoletil-Injektion (Tiletamin und Zolazepam zur Injektion) und 0,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid-Injektion sediert (siehe Materialtabelle).
2. Fixieren Sie die Minipigs und legen Sie sie in die richtige seitliche Liegeposition auf den OP-Tisch. Schalten Sie die Heizung ein, um die Körpertemperatur der Tiere aufrechtzuerhalten.
3. Führen Sie die Echokardiographie (Schritt 5) durch und entnehmen Sie 2 ml Blutproben.
4. Intubieren Sie die Minipigs mit einem Endotrachealtubus, der an eine Beatmungsstation für veterinärmedizinische Anästhesie angeschlossen ist (Abbildung 3A) (siehe Materialtabelle).
5. Initiieren Sie die Beatmung mit einem Atemzugvolumen von 8 ml/kg und 30 Atemzügen/min. Pflegen Sie die Tiere während des chirurgischen Eingriffs mit 1,5%-2,5% Isofluran.
6. Die intravenöse Kanülierung erfolgt mit einem peripheren intravenösen Katheter (26 G) (siehe Materialtabelle) aus einer Ohrvene (in der Regel die marginale Ohrvene, Abbildung 3B).
7. Schließen Sie das Tier an einen tierärztlichen Monitor an.

3. Chirurgischer Ablauf

1. Rasieren Sie den linken Brustbereich. Tragen Sie 0,7 % Jod und 75 % Alkohol auf, um die Haut vom Schulterblatt bis zum Zwerchfell aseptisch vorzubereiten (Abbildung 3C).
2. Legen Sie sterile Abdecktücher über den Operationsbereich.
3. Verabreichen Sie Propofol (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle) durch intravenöse Injektion, um die Vollnarkose aufrechtzuerhalten.
4. Markieren Sie den Schnitt (~15 cm lang) entlang des 4. Zwischenrippenraums vor dem Hautschnitt mit Elektrokauter.
5. Öffnen Sie den Brustkorb mit einer Kombination aus Kauter und stumpfer Dissektion des Muskels und des Bindegewebes. Verwenden Sie einen Absauger, um während der Operation Blut zu entfernen.
6. Verwenden Sie einen Rippenaufroller, um die Rippen zu spreizen (Abbildung 3D).
7. Lokalisieren Sie das thorakale absteigende Aortasegment und bestimmen Sie die Verengungsstelle (Abbildung 3E). Verwenden Sie zwei chirurgische 3-0-Nähte, um das Segment zweimal zu umschlingen (Abbildung 3F). Legen Sie drei Schichten medizinische Gaze zwischen die Naht und die Aorta, um Gewebeschäden durch Nähte zu vermeiden.
8. Richten Sie Druckmesseinheiten ein, um den Grad der Verengung zu bestimmen (Abbildung 3F-H).
   HINWEIS: Das Gerät enthält einen Katheter, der die Gefäßwand durchsticht, einen Verbindungsschlauch, einen Druckwandler und einen Patientenmonitor.
9. Ziehen Sie die chirurgische Naht um das absteigende Aortensegment allmählich an, um den gewünschten Verengungsgrad zu erreichen. Lassen Sie die Druckwerte 20 Minuten lang stabilisieren und ziehen Sie die chirurgischen Knoten dauerhaft fest.
10. Verwenden Sie einen Drainageschlauch, um die Luft und überschüssige Flüssigkeiten in der Brusthöhle zu evakuieren.
11. Schließen Sie die Brustwand in Schichten, nähern Sie sich den Rippen und geteilten Muskeln mit resorbierbaren Nähten wieder an.
12. Prüfen Sie, ob Blutungen vorliegen und stellen Sie eine gute Blutstillung sicher.
13. Tragen Sie nach der Operation eine Flasche Benzylpenicillin (800.000 Einheiten) (siehe Materialtabelle) auf den Operationsbereich auf.
14. Überwachen Sie das Blinzeln der Augen und die Bewegung der Gliedmaßen des Tieres. Trennen Sie das Beatmungsgerät, aber lassen Sie den Endotrachealtubus stehen. Überwachen Sie das Vorhandensein von spontaner Atmung.
15. Bringen Sie das Tier in seinen Stallraum zurück und lassen Sie es automatisch aufwachen.

4. Nachsorge

1. Benzylpenicillin 1 Woche lang täglich anwenden (20.000 U/kg).
2. 1 Woche lang täglich 1 mg/kg Flunixin-Meglumin (siehe Materialtabelle) auftragen.
   HINWEIS: Opioid- und NSAR-Analgetika sollten intra- und postoperativ verabreicht werden.

5. Transthorakale Echokardiographie

1. Betäuben Sie das Tier mit 1 mg/kg Zoletil und beruhigen Sie es.
2. Legen Sie das Tier in eine mobile Rückhalteeinheit mit einer Planenabdeckung.
   HINWEIS: Die mobile Rückhalteeinheit (siehe Materialtabelle) verfügt über vier Öffnungen, die dazu bestimmt sind, die Vorder- und Hintergliedmaßen des Tieres zu verlängern.
3. Rasieren Sie die linke Brust des Tieres.
4. Legen Sie die Finger auf die linke Mitte der Brust, um den apikalen Puls zu fühlen. Tragen Sie das Ultraschallgel auf die Umgebung auf.
5. Platzieren Sie den Phased-Array-Schallkopf des Ultraschallsystems (3-8 Hz) im dritten Interkostalraum. Bewegen Sie den Schallkopf in eine vordere oder hintere Richtung und stellen Sie den Kerbwinkel ein.
6. Identifiziere die Vorhöfe, Ventrikel und Aorta. Nehmen Sie die Bilder der parasternalen Längsachse im B- und M-Modus auf.
   HINWEIS: Das B-Mode-Bild stellt den Querschnitt des linken Ventrikels auf der Ebene des Papillarmuskels dar, und das M-Mode-Bild zeigt die Bewegung des linken Ventrikels im Laufe der Zeit.
7. Drehen Sie den Schallkopfkopf um 90° im Uhrzeigersinn, um die parasternale Kurzachsenansicht zu erhalten. Identifiziere die linke Herzkammer, die rechte Herzkammer und den Papillarmuskel. Nehmen Sie die Bilder im B- und M-Modus auf.
8. Verwenden Sie die vom Hersteller des Ultraschallsystems zur Verfügung gestellte Workstation, um die Struktur und Funktion des Herzens zu beurteilen.

Ergebnisse

Echokardiographie
Die Herzstruktur und -funktion wurden in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 10 und 12 bewertet. Die B-Mode- und M-Mode-Aufzeichnungen der parasternalen Kurzachsenansicht sind in Abbildung 4A dargestellt. Die echokardiographische Messung umfasste die Dicke des Ventrikelseptums (VST), die Dicke der hinteren Wand (PWT) und die linksventrikuläre Innendimension (LVID). Die VST an der Enddiastole nahm in den DAC-Herzen zu, während die PWT an der Enddiastole während des...

Diskussion

In dieser Studie wurden DAC-Techniken verwendet, um ein HFpEF-Modell für tibetische Minischweine zu entwickeln. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Vorbereitung von Tieren und Instrumenten vorgestellt, einschließlich Sedierung, trachealer Intubation, Venenkanülierung, chirurgischem Eingriff und postoperativer Versorgung. Die Aufnahmetechniken für echokardiographische B-Mode- und M-Mode-Herzbilder werden ebenfalls vorgestellt. Nach der DAC erlitt das Herz in den Wochen 4 und 6 eine linksventrikuläre Hypertroph...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Resorbierbares chirurgisches Nahtmaterial	Putong Jinhua Medical Co. Ltd, China	4-0
Aesthesia Beatmungsstation	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, China	WATO EX-35vet
Aspirator	Shanghai Baojia Medical Apparatus Co., Ltd, China	YX930D
Benzylpenicillin	Sichuan Pharmaceutical. INC, China	H5021738
Entsorgung Endotrachealtubus mit Manschette	Shenzhen Verybio Co., Ltd, China	20 cm, ID 0,9
Entsorgung Schallkopf	Guangdong Baihe Medical Technology Co., Ltd, China
Dissektionsklinge	Shanghai  Medizin  Instruments (Gruppe) Co., Ltd, China
Elektrokautery	Shanghai  Hutong Medical Instruments (Gruppe)  Co., Ltd, China	GD350-B
Enzyme-linked Immunosorbent Assay ELISA Kit	Cusabio Biotech Co., Ltd, China	CSB-E08594r
Eosin	Sigma-Aldrich Corp.	E4009
Flunixin-Megluminin	Shanghai Tongren Pharmaceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi (2012)-090242103
Pinzette	Shanghai   Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,China
Hämatoxylin	Sigma-Aldrich Corp.	H3136
Isofluran	RWD Life Science Co., Ltd, China	Veteasy für Tiere
Laryngoskop	Taixing Simeite Medical Apparatus and Instruments Limited Co., Ltd, China	Für Erwachsene
LED-OP-Leuchten	Mingtai Medical Group, China	ZF700
Mikroplatten-Reader	Thermo Fisher Scientific, USA	Multiskan FC
Mikroskop	Leica, Deutschland	DM2500
Mobile Rückhalteeinheit	Kundenspezifisch	N / A	Eine mobile Rückhalteeinheit, hergestellt aus Metallrahmen und Rädern, mit einer Leinwandabdeckung
Sauerstoff	Lokale Lieferanten, Guangzhou, China
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich Corp.
Patientenmonitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	Beneview T5
Peripherer intravenöser (IV) Katheter	Shenzhen Yima Pet Industry Development Co., Ltd., China	26G X 16 mm
Propofol	Guangdong Jiabo Phamaceutical Co., Ltd.
Rippenaufroller	Shanghai  Medizin  Instruments (Gruppe) Co., Ltd.,China
Ruler	Deli  Fertigung  Unternehmen, China
Scalpel kümmert sich um	Shanghai  Medizin  Instruments (Gruppe) Co., Ltd.,China
Scissors (g)	Shanghai  Medizin  Instrumente (Gruppe) Co., Ltd.,China
Naht	Medtronic-Coviden Corp.	3-0, 4-0
Ultraschallgel	Tianjin Xiyuansi Produktionsinstitut, China	TM-100
Veterinärmonitor	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Company, China	ePM12M Tierarzt
Veterinäres Ultraschallsystem	Esatoe, Italien	MyLab30	Ausgestattet mit Phased-Array-Schallkopf (3-8 Hz)
Xylazinhydrochlorid-Injektion	Shenda Tier Phamarceutical Co., Ltd., China	Shouyaozi (2016)-07003
Zoletil-Injektion	Virbac, Frankreich	Zoletil 50	Tiletamin und Zolazepam zur Injektion